1、農業生物技術學報,2011年,第19卷,第6期,第10271033頁Journal of Agricultural Biotechnology,2011,Vol.19,No.6,10271033研究報告A Letter不同轉染方法轉染牛體細胞效率的比較李松丁方榮戴蘊平*朱士恩*中國農業大學動物科技學院,中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室,北京濟普霖生物技術有限公司,北京100193*通訊作者,daiyunping;zhushien摘要為了從新轉染方法與傳統轉染方法的比較中找出更為高效的轉染方法,本研究以綠色熒光蛋白(GFP質粒DNA為外源基因,分別采用核轉染法、電穿孔法和脂質體法轉染牛的3

2、種常用核移植供體細胞(胎兒成纖維細胞、胎兒輸卵管上皮細胞、卵丘顆粒細胞。針對不同類型的細胞,實驗首先對核轉染法和電穿孔法的轉染參數進行了系統的摸索和優化,然后將優化后的核轉染法、電穿孔法與脂質體法在可控實驗條件完全一致的情況下進行了轉染對比實驗,分析比較了轉染48h后的綠色熒光比率和細胞存活率。結果顯示,核轉染法轉染胎兒成纖維細胞、胎兒輸卵管上皮細胞和卵丘顆粒細胞的優化程序分別是V013、T023和U023;在電穿孔法中,當電場強度為90V/mm,脈沖時間為10ms時,胎兒成纖維細胞和卵丘顆粒細胞的轉染效率最高,胎兒輸卵管上皮細胞則在電場強度為80V/mm,脈沖時間為5ms時獲得了最佳轉染效率

3、;最后通過轉染對比實驗得出,核轉染法在3種細胞中都獲得了最高的轉染效率,分別為(98.78±0.30%、(88.43±2.10%和(71.31±0.77%,均顯著高于電穿孔法和脂質體法;轉染后的存活率則為脂質體法最高,電穿孔法最低。研究結果說明,核轉染法可以成為一種結合牛體細胞克隆技術生產轉基因牛更有效的轉染方法。關鍵詞細胞轉染,核轉染法,電穿孔法,脂質體法,牛體細胞Comparison of Different Methods for Transfection Efficiency of Bovine Somatic CellsLi Song Ding Fang

4、rong Dai Yunping*Zhu Shien*Animal Sci-tech College,State Key Laboratory for Agrobiotechnology,China Agricultural University,Geneprint Biotechnology Co.LTD,Beijing 100193,China*Corresponding author,daiyunping;zhushienDOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2011.06.007Abstact The objective of this study was to f

5、ind a more efficient transfection method between a new transfection method and the traditional transfection methods.Three types of bovine donor cells(fetal fibroblast cells,fetal oviduct epithelial cells and cumulus granulosa cellsthat commonly used for nuclear transfer were transfected with plasmid

6、 DNA of green fluorescent protein(GFPgene using the nucleofection,electroporation and lipofection.We firstly determined optimal transfection parameters for nucleofection and electroporation,then transfection experiments were carried out to compare efficiency of optimized nucleofection and electropor

7、ation with lipofection under identical conditions,and green fluorescence ratio and cell survival were assessed48h after transfection.The results showed that the optimization program of nucleofection for fetal fibroblasts,fetal oviduct epithelial cells and cumulus granulosa cells were V013,T023and U0

8、23;In electroporation,when the electric field was90V/mm,pulse duration was10ms,fetal fibroblasts and cumulus granulosa cells got the highest efficiency, while parameters of80V/mm and5ms were good for fetal oviduct epithelial cells;Finally,after transfection comparision experiments,the nucleofection

9、demonstrated the highest transfection efficiency of(98.78±0.30%、DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2011.06.007基金項目:本研究由國家轉基因生物新品種培育重大專項(No.2008ZX08007-001資助收稿日期:2011-05-16接受日期:2011-08-03農業生物技術學報Journal of Agricultural Biotechnology(88.43±2.10%and(71.31±0.77%respectively in all three types o

10、f cells,were significantly higher than electroporation and lipofection;and lipofection yielded the highest survival rate,electroporation got the lowest. The results demonstrate that nucleofection can be a more efficient alternative to produce transgenic cattle when combining with somatic cell clonin

11、g technology.Keywords Cell transfection,Nucleofection,Electroporation,Lipofection,Bovine somatic cells細胞轉染技術是采用一定的方法和途徑將外源分子如DNA、RNA等導入特定的細胞,并表達目的基因,產生特定功能的蛋白質分子。在生產轉基因動物的研究中,通過結合細胞轉染技術與體細胞克隆技術培育轉基因動物是一條非常有效的途徑,選擇合適的細胞轉染方法并進行優化,將會得到較高的轉染效率,從而可以間接提高轉基因克隆技術的效率。目前細胞轉染應用最為普遍的是脂質體法(Fu et al.,2008;Iguma e

12、t al.,2005;Lee et al.,2005和電穿孔法(Lee et al.,2005;Roh et al.,2000。陽離子脂質體作為一種有效的基因傳遞載體具有下列特點:對細胞類型有選擇性,轉染效果隨細胞類型變化大,對DNA的質量要求高,但操作簡便,成本適中且細胞毒性低。電穿孔技術在20世紀80年代初期開始用于將DNA導人多種動物細胞,理論上可以轉染幾乎所有類型細胞。較之脂質體轉染,電穿孔法有使用方便,轉染效率高,外源基因通常以單拷貝形式整合(Boggs et al.,1986等諸多優點,但伴隨較高的細胞毒性。近些年由Amaxa公司研發出的核轉染技術是一種非病毒介導的新型轉染技術,該

13、技術在傳統電穿孔技術的基礎上進行改良,設計出包含針對不同類型細胞的優化轉染程序的Amaxa R Nucleofecto R 轉染設備和細胞特異性核轉染試劑。核轉染法就是采用對特定類型細胞配套的核轉染試劑和轉染程序,直接把外源基因導入細胞核中,以達到最佳轉染效率。與其他轉染技術相比,其可以直接將DNA轉染到細胞核內,實現了因受到細胞分裂限制而一直困擾人們的原代細胞的高效率轉染,所以特別適用于轉染原代細胞和難以轉染的細胞系(Cao et al., 2009;Ganesh et al.,2003;Gresch et al.,2004;Leclere et al.,2005;Lenz et al.,2

14、003;Trompeter et al.,2003; Yin et al.,2006。目前該技術較多的應用于腫瘤研究、免疫學、組織工程學及心血管疾病研究領域中,還未見有用于牛體細胞轉染的相關報道。胎兒成纖維細胞、胎兒輸卵管上皮細胞和卵丘顆粒細胞都是常用的核移植供體細胞,并且均已成功獲得克隆牛(Cibelli et al.,1998;Kato et al.,2000;Zakhartchenko et al.,1999,本實驗應用帶有綠色熒光蛋白基因的質粒在上述三種細胞上進行轉染,更系統地比較這三種轉染方法的轉染效率,為進一步的穩定轉染、篩選轉基因細胞并生產轉基因克隆牛提供基礎資料。1結果與分析1

15、.1牛的各種體細胞系的建立經過原代培養、繼代培養、冷凍保存等體外培養操作,成功的建立了黃牛胎兒成纖維細胞系(編號LXH102FFb、奶牛胎兒輸卵管上皮細胞系(編號1001FOV和黃牛卵丘顆粒細胞系(編號CC(圖1。1.2核轉染法轉染條件的優化對LXH102FFb、1001FOV和CC的推薦核轉染程序進行篩選。LXH102FFb和CC都采用程序A024、T016、U012、U023和V013轉染,1001FOV采用程序S005、T013、T020、T023和U017轉染,從圖2可以看出,各細胞在推薦程序下轉染后的存活率差異不大,以轉染后48h綠色熒光細胞百分比高低為標準進行選擇得出,LXH102

16、FFb、1001FOV和CC的最優轉染程序分別是V013、T023和U023。LXH102FFb1001FOVCC圖1牛3種體細胞系Figure1Three types of bovine somatic cells1028不同轉染方法轉染牛體細胞效率的比較Comparison of Different Methods for Transfection Efficiency of Bovine Somatic Cells圖3不同電轉參數下牛三種體細胞的轉染效率和存活率Figure 3Transfection efficiency and survival rate ofLXH102FFb (A

17、,1001FOV (Band CC (Cunder different electroporation parametersA.1:140V,5ms;2:140V,8ms;3:140V,10ms;4:160V,5ms;5:160V,8ms;6:160V,10ms;7:180V,5ms;8:180V,8ms;9:180V,10msB.1:120V,1ms;2:120V,2ms;3:120V,5ms;4:140V,1ms;5:140V,2ms;6:140V,5ms;7:160V,1ms;8:160V,2ms;9:160V,5msC.1:140V,5ms;2:140V,8ms;3:140V,10ms

18、;4:160V,5ms;5:160V,8ms;6:160V,10ms;7:180V,5ms;8:180V,8ms;9:180V,10ms圖2不同核轉染程序下牛三種體細胞的轉染效率和存活率Figure 2Transfection efficiency and survival rate of LXH102FFb (A,1001FOV (Band CC (Cunder different nucleofection procedures1.3電穿孔法轉染條件的優化通過調整電脈沖時間(110ms和改變電場強度(6090V/mm來設置電轉參數組合轉染LXH102FFb 、1001FOV 和CC ,不同

19、參數組合下各細胞的轉染效率見圖3,當電壓為180V ,脈沖時間為10ms 時,LXH102FFb 和CC 的轉染效率最高,1001FOV 則在電壓為160V ,脈沖時間為5ms 時獲得了最高轉染效率,為了更好的進行后面的轉染對比實驗,選擇轉染效率最高的參數組合為最優參數,盡管這些細胞在獲得最高轉染效率的同時存活率普遍偏低。1.4不同轉染方法轉染效率的比較如圖4所示,在LXH102FFb 和1001FOV 的轉染對比實驗中,3種轉染方法產生的轉染效率及細胞存活率兩兩之間均差異顯著(LXH102FFb,P <0.05;1001FOV,P <0.01,核轉染法在3種細胞中都獲得了最高的轉

20、染效率,分別為(98.78±0.30%、(88.43±2.10%和(71.31±0.77%,均顯著高于電穿孔法的(75.14±2.95%、(21.16±2.44%、(36.62±6.20%和脂質體法的(65.16±1.53%、(2.57±0.26%、(18.25±0.33%;另外,轉染后各細胞的存活率則為脂質體法最高,并且與其它2種方法得到的存活率差異顯著(P <0.05或P <0.01。2討論隨著科學技術的不斷進步,將外源基因導入真核細胞的轉染技術在生物醫藥研究和基因功能研究轉染效率Tran

21、sfection efficiency 100806040200A024T016U012U023V013核傳染程序Nucleofection programsA 百分比/%P e r c e n t a g e存活率Survival rate核傳染程序Nucleofection programsS005100806040200T013T020T023U017B百分比/%P e r c e n t a g e轉染效率Transfection efficiency 存活率Survival rate100806040200A024核傳染程序Nucleofection programsT016U012

22、U023V013C百分比/%P e r c e n t a g e轉染效率Transfection efficiency 存活率Survival rateA百分比/%P e r c e n t a g e100806040200電轉參數組合體(電壓,脈沖時間Parameters for electroporation(voltage,pulse time轉染效率Transfection efficiency 存活率Survival rate123456789B百分比/%P e r c e n t a g e100電轉參數組合體(電壓,脈沖時間Parameters for electropora

23、tion(voltage,pulse time806040200轉染效率Transfection efficiency 存活率Survival rate123456789C百分比/%P e r c e n t a g e100電轉參數組合體(電壓,脈沖時間Parameters for electroporation(voltage,pulse time806040200轉染效率Transfection efficiency 存活率Survival rate1234567891029農業生物技術學報Journal of Agricultural Biotechnology方面起著越來越重要的作用

24、,選擇好的轉染方法,對條件進行優化,將會得到較高的轉染效率。化學轉染方法經過多年的發展已經得到很好的提高,而物理轉染方法的改良進展卻很有限(Colosimo et al.,2000。Amaxa 公司在傳統電穿孔技術的基礎上加以改良形成了一種新的物理轉染方法-核轉染,依靠先進的電穿孔設備設定特定轉染程序并結合使用配套的特異性轉染液直接把外源基因導入細胞核,轉染效率不受細胞分裂快慢影響,與以往的物理方法相比該方法的轉染效果有了質的飛躍。從核轉染儀公司的官方網站(的最優轉染程序,但是本實驗中的細胞系并未羅列在特定的細胞系范圍內,而是作為泛指細胞類型被網站建議對多個推薦程序進行篩選。Maurisse

25、等(2010經過篩選多種轉染程序發現豬胎兒成纖維細胞最優轉染程序為U020,獲得的轉染效率是90%,兔胎兒成纖維細胞最優轉染程序為U023,轉染效率為38%;也有人轉染豬胎兒成纖維細胞時對推薦的10個轉染程序進行篩選得出最優程序U023,獲得了79%的轉染效率(Nakayama et al.,2007。在本實驗中,首次用核轉染法轉染牛體細胞并篩選了轉染程序,LXH102FFb 和CC 均采用成纖維細胞推薦程序A024、T016、U012、U023和V013進行轉染比較和篩選,1001FOV 則從上皮細胞推薦程序S005、T013、T020、T023和U017中篩選,在優化過程中發現轉染后的存活

26、率差異不大,于是選擇轉染后48h 綠色熒光細胞比例最高的為最優轉染程序。從圖2得出LXH102FFb 的最優轉染程序是V013,轉染效率為(96.91±1.88%,明顯高于上述豬和兔成纖維細胞的轉染效率,可見,不同細胞個體的優化程序和轉染效率有很大的差異。而1001FOV 和CC 的最優程序分別為T023(82.92±0.31%和U023(72.70±2.57%。電穿孔法可廣泛應用于各類細胞的轉染(Shigekawa and Dower,1988,但好的電轉參數因細胞不同而異。為達到較好的轉染效果,一般考慮對電場強度和脈沖時間這兩個關鍵因素進行優化(Rols an

27、d Teissie,1998,在眾多關于牛體細胞克隆文獻中(Arat et al.,2001;Forsberg et al.,2002;Gong et al.,2004;Roh et al.,2000都有報道使用電穿孔法轉染,但并沒有提及對電轉參數的優化和對轉染效率高低的評估。Jordan 等(2008對指數型電穿孔儀轉染各種難轉的人細胞的電擊參數進行了系統的摸索和探討,在通過轉染siRNA 進行評估的過程中,人原代成纖維細胞和人靜脈內皮細胞的轉染效率最高達到93%和94%,當對人原代成纖維細胞轉染GFP 質粒時則獲得了44%的最好轉染效率。Ross 等(2009在豬胎兒成纖維細胞上對方波形式

28、的電穿孔方法進行了優化,發現細胞系和電壓對轉染效率影響顯著,同時電壓還顯著的影響細胞存活率。優化過程中電壓以50V 的增幅從100V 提高到350V ,細胞的GFP 陽性率從(3.2±0.8%升高到(43.0±3.4%,而存活率卻從(90.5±8.0%降低到(44.8±2.0%。本實驗根據以往經驗和BTX 代理商推薦的電擊參數,分別用6090V/mm 和l10ms 的參數組合轉染牛體細胞,并系統的比較了各細胞的轉染效率和存活率,實驗發現各圖4不同轉染方法牛三種體細胞的轉染效率和存活率同類圖例上字母不同(a ,b ,c 或A ,B ,C表示差異顯著(P &

29、lt;0.05或極顯著(P <0.01Figure 4Transfection efficiency and survival rate of LXH102FFb (A,1001FOV (Band CC (Cunder different transfection methodsValues with different superscripts in the same type of column indicate significant difference or extremely significant difference (a vs b vs c,P <0.05or A

30、 vs B vs C,P <0.01百分比/%P e r c e n t a g eA100806040200核轉染Nucleofection (V013電穿孔Electroporation (180V,10ms脂質體Lipofection轉染效率Transfection efficiency 存活率Survival rateaab cbc B百分比/%P e r c e n t a g e80核轉染Nucleofection (T023脂質體Lipofection1006040200轉染效率Transfection efficiency存活率Survival rateAABBC C 電

31、穿孔Electroporation (160V,5msC百分比/%P e r c e n t a g e801006040200轉染效率Transfection efficiency存活率Survival rateAABACC 核轉染Nucleofection (U023電穿孔Electroporation (180V,10ms脂質體Lipofection1030細胞的轉染效率和存活率變化很廣,各細胞轉染效率隨著電壓和脈沖時間的升高而增長,最低的是(0.41±0.08%,最高的為(75.03±2.31%;存活率則急劇下降,范圍為(90.12±4.47%(23.70

32、±2.47%選擇轉染效率最高的參數組合為最優參數,LXH102FFb 和CC的最優參數為90V/mm,10ms,1001FOV的為80V/mm,5ms。采用本研究所描述的3種轉染方法轉染牛體細胞的對比實驗目前還未見相關報道,但在其它類型細胞中類似的研究實驗已經有很多,Hamm等(2002、Jacobsen等(2006和Maurisse等(2010比較核轉染法與脂質體法轉染人和其它哺乳動物多種細胞的轉染效果,結果核轉染法獲得最高的轉染效率; Nakayama等(2007在豬胎兒成纖維細胞上比較核轉染法、電穿孔法和脂質體法的轉染效率,各方法優化后分別獲得了79.0、53.4和8.2%的最

33、佳轉染效率,核轉染法的效率明顯最高,與本實驗結果一致,而且作者將核轉染后篩選得到的轉基因細胞用于體細胞克隆;在人胚胎干細胞的轉染研究中;Cao等(2009在上述3種方法的基礎上再加入了病毒轉染法進行轉染對比實驗,雖然核轉染法并沒有獲得最高的轉染效率,依然被作者推薦。本實驗在LXH102FFb、1001FOV和CC這3種細胞中分別采用核轉染程序V013、T023和U023獲得了最高的轉染效率(98.78±0.30%、(88.43±2.10%和(71.31±0.77%,均顯著高于電穿孔法和脂質體法,轉染后存活率的比較結果為脂質體法>核轉染法>電穿孔法。綜合

34、考慮轉染效果,我們認為核轉染是值得推薦的高效轉染方法。總之,核轉染法作為一種非病毒的高效轉染方法應用于牛體細胞轉染是切實可行的,為下一步的穩定轉染和篩選轉基因細胞打下基礎,相信該轉染方法終將用于轉基因克隆牛的生產并很可能提高轉基因克隆的整體效率。3材料與方法3.1化學試劑與實驗材料pmaxGFP質粒和核轉染試劑為Lonza公司(德國產品;脂質體(Lipofectamine TM2000為Invitrogen 公司(美國產品;胎牛血清(FBS、胰蛋白酶(Trypsin、DMEM和PBS購自Gibco公司(美國;細胞凍存液(cellBanker2購自ZENOAQ公司(日本;其他藥品除特殊注明外均購

35、自Sigma公司(美國。細胞培養器皿購自Corning或Nunc公司(美國。Holstein 奶牛胎兒取自山東省農業科學院奶牛研究中心,黃牛胎兒取自山東科龍畜牧產業有限公司的牛場,黃牛卵巢來自北京周邊地區屠宰場。3.2牛的各種體細胞系的建立分別取1頭3月齡Holstein奶牛胎兒和1頭2月齡黃牛胎兒建立奶牛胎兒輸卵管上皮細胞系(1001FOV和黃牛胎兒成纖維細胞系(LXH102FFb,組織樣被剪碎成1mm3左右的小塊,PBS清洗2次后分批植塊于含6mL DMEM+20%FBS的25cm2的培養瓶中。以黃牛卵巢組織樣建立黃牛卵丘顆粒細胞系(CC,將清理過的卵巢置于培養皿中,用10 mL一次性注射

36、器抽吸卵巢表面26mm大小卵泡中的卵泡液,回收形態均勻、結構致密的卵丘-卵母細胞-復合體(COCs,PBS清洗2遍后以0.1%透明質酸酶溶液震蕩3min,DMEM+10%FBS洗滌離心后重懸至1×105個/mL,6mL細胞溶液鋪至25cm2的培養瓶中。牛胎兒組織樣和卵丘顆粒細胞于37.5,5%CO2培養箱培養67d,每2d換液1次,待細胞生長匯合后,以0.1%胰蛋白酶消化傳代23次,分批凍存,先放置負80度冰箱過夜,再投入液氮長期保存。3.3核轉染法轉染將冷凍保存的細胞解凍后傳代2次,培養至70%80%匯合,0.1%胰蛋白酶消化收集細胞并計數,用核轉染液重懸細胞(細胞特異性核轉染試劑

37、Basic Nucleofector Solution和Supplement混合得到核轉染液,兩者體積比為4.51,加入pmaxGFP質粒混勻,把混合液轉移到電擊杯。按照核轉染儀Amaxa R Nucleofector R的操作手冊選擇與各類細胞對應的推薦轉染程序進行轉染,完成轉染后,向電擊杯中加入200L預熱的培養液,輕輕吸打,用吸管將細胞混合液轉移到含5mL預熱培養液的培養皿中放入CO2培養箱培養。48h后參照陰性對照分析轉染效率和細胞存活率。每次核轉染的細胞數量設為78×105個,核轉染液體積為100L,pmaxGFP 質粒2g。3.4電穿孔法轉染將冷凍保存的細胞解凍后傳代2次

38、,培養至70%80%匯合,0.1%胰蛋白酶消化收集細胞,并進行細胞計數。加入電轉緩沖液(PBS中含272mmol/L蔗糖、7mmol/L K2HPO4,1mmol/L MgCl2,pH7.4重懸不同轉染方法轉染牛體細胞效率的比較Comparison of Different Methods for Transfection Efficiency of Bovine Somatic Cells10311032 Journal of Agricultural Biotechnology 率， 確定與之對應的最佳轉染程序。 實驗 2： BTX 電穿孔儀(ECM2001設置不同 用 加入 2 mm 電

39、擊杯中， 將電擊杯放入電擊槽， BTX 參數組合對牛的 3 種體細胞進行電穿孔轉染實驗， 用 電穿孔儀(ECM2001設置相應的參數組合進行電擊， 比較各細胞在不同參數組合下的轉染效率，找到與 電擊后室溫靜置 2 min， 向電擊杯中加入 200 L 預熱 之對應的最佳轉染參數。 實驗 3： 針對牛的 3 種體細胞， 將優化后的核轉 的培養液， 輕輕吸打， 將細胞轉移到含 5 mL 預熱培養 48 液的培養皿中，置 CO2 培養箱培養， h 后參照陰性 染法、電穿孔法與脂質體法在可控實驗條件完全一 致的情況下進行轉染對比實驗，比較不同轉染方法 對照分析轉染效率和細胞存活率。 的轉染效率和毒性。

40、 3.5 脂質體法轉染 統計學分析：所有實驗至少重復 3 次，采用 TM 參照產品 Lipofectamine 2000 使用說明書， 在 SPSS19.0 統計學軟 件對數據進 行統計學 分析， 計 調整細胞密度至 5× 量資料所有數據均以平均數(x±標準差(SD表示。 轉染前一天, 6 孔板中接種細胞， 105/ 孔。 轉染的當天， 細胞密度最好達到 7080， 不同轉染方法轉染效率的比較采用 ANOVA 檢驗， 吸出各孔內的培養基， 用無血清 DMEM 培養基漂洗 當 P0.05 時認為差異顯著， P0.01 時認為差異 1 次， 向各孔內加入 Opti-MEM 培養

41、基 2 mL。 在新的 極顯著。 1.5 mL EP 管中準備溶液 A 和溶液 B， 孔板每孔用 6 量如下， 液： A 250 L Opti-MEM 培 養 基 +2 g 參考文獻 B 250 pmaxGFP 質 粒 ， 室 溫 下 靜 置 5 min， 液 ： L Arat S., Rzucidlo S.J ., G ibbons J., Miyoshi K., and Stice S.L., Opti-MEM 培 養 基 +10 L 脂 質 體 2001, Production of transgenic bovine embryos by transfer LipofectamineT

42、M2000， 室溫下靜置 5 min。將 A， 兩 B of transfected granulosa cells into enucleated oocytes, 種液體混合，室溫下靜置 20 min 后加入到 6 孔板 Molecular Reproduction and Development, 60(1: 2026 中， 輕輕搖晃使之與細胞均勻接觸， 放入 CO2 培養箱 Boggs S., Gregg R.G., Borenstein N. and Smithies O., 1986, Efficient transformation and frequent single-sit

43、e, single-copy 培養。讓脂質體 -DNA 復合物與細胞接觸 6 h 后， 換 insertion of DNA can be obtained in mouse erythroleukemia 成含有血清的完全培養基繼續培養。考慮到轉染的 cells transformed by electroporation, Experimental 細胞密度較大， 隔天進行傳代， h 后參照陰性對照 48 Hematology, 14(10: 988994 分析轉染效率和細胞存活率。 細胞， 每次電轉 78×105 個細胞 / 組， 加入 pmaxGFP 質粒 2 g，將細胞懸液

44、及質粒混合均勻后取 200 L Cao F., Xie X.Y, Gollan T., Zhao L., Narsinh K., Lee R.J., and human embryonic stem cells, Molecular Imaging and Biology, 12(1: 1524 Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J., Kane J.J., Jerry J., Blackwell C., Ponce de León F.A., and Robl J.M., 1998, Cloned transgenic calves produ

45、ced from nonquiescent fetal fibroblasts, Science, 280(5367: 12561258 Colosimo A., Goncz K.K., Holmes A.R., Kunzelmann K., Novelli G., Malone R.W., Bennett M.J., and Gruenert D.C., 2000, Transfer and expression of foreign genes in mammalian 農業生物技術學報 3.6 細胞存活率分析 每次轉染實驗中均設置未轉染的陰性細胞為對 照， 而且轉染時各組的細胞數量要相同

46、。 轉染后培養 48 h， 消化各組細胞準備流式分析時分別進行細胞計 數，然后將各轉染組的細胞數量與陰性對照的細胞 數量相除即得出轉染后 48 h 的細胞存活率。 3.7 細胞轉染效率分析 轉染的細胞培養 48 h 后，用 PBS 漂洗 2 遍， 再 Wu J.C., 2009, Comparison of gene-transfer efficiency in cells, Biotechniques, 29(2: 3148, 3202, 324 passim 用 0.1胰蛋白酶消化收集細胞，然后通過流式細胞 Forsberg E.J., Strelchenko N.S., Augenste

47、in M.L., Betthauser J. 儀 CYFLOW space(德國 PARTEC 公司檢測綠色熒 M., Childs L.A., Eilertsen K.J., Enos J.M., Forsythe T.M., 光細胞比例來分析不同轉染方法對各類細胞的轉染 Golueke P.J., Koppang R. W., Lange G., Lesmeister T.L., 效率。使用 FloMax 軟件對資料進行分析， 分析時根 Mallon K.S., Mell G.D., Misica P.M., Pace M.M., 據未轉染的陰性細胞的自發熒光水平設定門控標準。 Pfist

48、er-Genskow M., Voelker G.R., Watt S.R., and Bishop 3.8 實驗設計及數據統計 實驗 1： 使用推薦程序對牛的 3 種體細胞進行核 轉染實驗，比較各細胞在不同轉染程序下的轉染效 M.D., 2002, Production of cloned cattle from in vitro systems, Biology of Reproduction, 67(1: 327333 Fu J., Guan P., Zhao L., Li H., Huang S., Zeng F., and Zeng Y., 2008, Effects of dono

49、r cells on in vitro development of 不同轉染方法轉染牛體細胞效率的比較 1033 Comparison of Different Methods for Transfection Efficiency of Bovine Somatic Cells cloned bovine embryos, Journal of Genetics and Genomics, 35(5: 273278 Ganesh L., Burstein E., Guha-Niyogi A., Louder M.K., Mascola J.R., Klomp L.W.J., Wijmeng

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