1、丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠的神經保護作用機制初探 【摘要】 目的初步探討丹參酮主要成分丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠的神經保護作用機制。方法雙側頸總動脈反復缺血/再灌注合并尾部放血降壓方法建立血管性癡呆小鼠模型。動物隨機分為假手術組、缺血模型組、丹參酮IIA低、高劑量（4 mg/kg.d，8 mg/kg.d ） 治療 組。手術20 d后開始運用Morris水迷宮觀測各組的學習記憶功能，然后斷頭取腦，分離皮層和海馬，分光光度法測定丙二醛(malondialdehyde, MDA) 含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性

2、的變化；運用高效液相色譜法測定不同組小鼠皮層和海馬組織內谷氨酸和-氨基丁酸的含量。結果丹參酮IIA可以改善血管性癡呆小鼠的學習記憶功能； 丹參酮IIA可減少MDA的生成, 增加SOD、GSH-Px活性; 小鼠手術20 d后，小鼠皮層和海馬組織谷氨酸和-氨基丁酸的含量減低，丹參酮IIA可增加血管性癡呆小鼠皮層和海馬組織內谷氨酸和-氨基丁酸的含量。結論丹參酮IIA在血管性癡呆小鼠可發揮抗氧化作用并調節興奮性氨基酸和抑制性氨基酸的含量。 【關鍵詞】 丹參酮IIA; 谷氨酸; -氨基丁酸； 血管性癡呆Abstract：ObjectiveTo investigate the underlying neu

3、roprotective mechanisms of Tanshinone IIA (TSA) on mouse cerebral ischemia in vivo.MethodsMale mice were divided into four groups sham-operated, ischemic and treated groups (lower dose and higher dose). The mice were subjected for ischemia-reperfusion three times on bilateral common carotid arteries

4、 by knots to establish models of vascular dementia. After ischemia-reperfusion impairment, TSA (4 mg/kg.d, 8 mg/kg.d) was administered by i.p. for 20 days in treated group. 1. We used morris water maze to investigate the learning and memory； 2. Levels of malondialdehyde (MDA), activity of superoxide

5、 dismetase (SOD) and glutathione peroxidase (GPX) in brain tissue were detected by spectrophotometer; 3. High-performance liquid chromatography(HPLC) with fluorescence detection was applied to measure the contents of glutamate and gamma-aminobutyric acid (GABA) in cortex and hippocampus.ResultsTSA c

6、an improve learning and memory deficits in vascular dementia; An elevation of SOD and GPX activity and decrease of MDA level were shown in TSA treated group after brain ischemia; Decreased glutamate and gamma-aminobutyric acid induced by chronic brain ischemia were markedly inhibited by TSA pretreat

7、ment. ConclusionThe neuroprotective effect of TSA are partly due to its functions as follow: anti-free radical injury; regulating the content of glutamate and gamma-aminobutyric acid.Key words： Tanshinone IIA; Glutamate; GABA; Vascular dementia血管性癡呆(vascular dementia,VD)是指由各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產生的獲得性智能損害

8、綜合征,為一種慢性進行性疾病,其病理改變主要是以廣泛性腦動脈硬化和腦梗塞為特征, 隨著當今世界人口老齡化日益嚴重,其發病率日趨增高1。我國中藥資源豐富, 從祖國傳統中草藥中尋找有效成分治療血管性癡呆不失為一條可以探索的道路, 研究者們已經在這方面做出了一些卓有成效的。丹參是我國傳統中藥, 丹參酮是丹參脂溶性成分的代表物質, 具有清除氧自由基、改善微循環、鈣拮抗、抑制中性粒細胞的游走、抗癌及保護血管內皮細胞等廣泛的藥理作用, 現已成為研究的2，3。目前已發現它有十多種單體, 其中丹參酮IIA(TSA)的研究最多, 已有報道指出丹參酮IIA能顯著降低心肌缺血再灌注后組織中MDA的生成和減少心肌肌酸

9、激酶的釋放, 認為它直接清除氧自由基是防治家兔心肌缺血再灌注損傷的機理之一4, 5。另有報道丹參酮對中風模型大鼠有一定的神經保護作用3，但有關其神經保護機制目前仍然不甚清楚，相關研究工作開展較少, 本課題對這方面進行了初步的探索, 利用小鼠血管性癡呆模型觀察丹參酮IIA對其是否有治療作用, 并探討丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠是否有抗氧化作用以及對皮層和海馬組織興奮性氨基酸和抑制性氨基酸的影響。 1 材料與儀器 丹參酮IIA（紅色結晶粉末， 純度98），購于西安冠宇生物技術有限公司；谷氨酸和-氨基丁酸標準品均購自 Sigma 公司(St. Louis, MO, USA); -巰基乙醇購自 AMR

10、ESCO Inc. (Ohio, USA); 鄰苯二甲醛(O-phthaldialdehyde, OPA) 購自Sigma (St. Louis, MO, USA); 甲醇(色譜純)購自Fisher Scientific (USA); 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼酸鈉均為國產分析純，實驗前用四蒸水配成所需濃度；MDA, SOD,GSH-Px以及蛋白定量試劑盒（考馬斯亮蘭法）購自南京建成生物 工程公司（南京， 中國 ）。 VARIAN Prostar高效液相色譜儀；VARIAN 363型熒光檢測器；依利特ODS C18反相色譜柱(4.6 mm250 mm, 5 m)。 清潔級雄性昆明種小鼠, 體質

11、量1827 g, 由華中科技大學同濟院實驗動物中心提供。 2 方法 2.1 動物分組和模型制備方法將實驗小鼠隨機分為4組：假手術組；血管性癡呆組；丹參酮IIA低劑量治療組；丹參酮A高劑量治療組。癡呆動物模型的制備：將小鼠適應性飼養 1周后, 參照 文獻 6行雙側頸總動脈反復缺血/再灌注合并尾部放血降壓方法建立VD小鼠模型。術前 12 h 禁食不禁水。用水合氯醛以350 mg/kg的濃度腹腔注射麻醉后, 將小鼠仰臥固定于手術臺上。消毒后沿頸正中切口, 分離雙側頸總動脈 （CCA）, 絲線結扎阻斷 CCA, 20 min后再灌注 10 min, 如此反復兩次 , 第 1次缺血時在距小鼠尾尖 1 c

12、m處剪斷放血約 0.3 ml。術中保持動物肛溫在 （37 0.5） 。其中假手術組只分離CCA, 套絲扣, 但不阻斷血流, 尾部不放血, 觀察時間與其他組相同。丹參酮IIA治療組，術后第2天開始腹腔注射給藥，給予丹參酮IIA 4 mg/kg（低劑量組）或8 mg/kg（高劑量組）, 共20 d。2.2 學習記憶功能測定利用Morris水迷宮對各組動物學習記憶能力進行檢測, Morris水迷宮實驗系統由中國醫學 科學 院藥物研究所研制。基本方法參照文獻7。各組均于造模30 d后開始進行，每組取710只動物進行測試。數據由水迷宮實驗系統獲得, 實驗數據以 s表示, 各組數據用SPSS 12.0軟件

13、處理, 采用重復測量方差分析結合Tukeys 檢驗, P 0.05有統計學差異。2.3 MDA含量，SOD及GPX活性的測定方法操作均按照試劑盒說明書進行。2.4 高效液相色譜法測定海馬組織內氨基酸含量2.5 統計分析采用SPSS 12.0軟件進行統計分析。所有數據以 s表示。多組間均數比較采用one-way analysis of variance (ANOVA)及Fisher LSD test (Least-significant difference)。P0.05 有統計學差異。 3 結果 3.1 丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠認知功能障礙的作用3.2 丹參酮IIA對血管性癡呆小鼠MDA含

14、量、SOD和GSH-Px的影響與假手術組相比，缺血性腦損傷30 d后，小鼠皮層和海馬MDA含量均顯著增加（P0.01），丹參酮A明顯降低缺血性腦損傷后MDA的產生（圖3）,而且丹參酮IIA作用呈劑量依賴性。 與假手術組相比，缺血性腦損傷30 d后，小鼠皮層和海馬GSH-Px活性均顯著降低（P0.05），丹參酮IIA明顯增加缺血性腦損傷后GSH-Px的活性（4）, 而且丹參酮IIA作用呈劑量依賴性。與假手術組相比，缺血性腦損傷30 d后，小鼠皮層和海馬SOD活性均顯著降低（P0.05），丹參酮IIA明顯增加缺血性腦損傷后SOD的活性（圖5）, 而且丹參酮IIA作用呈劑量依賴性。3.3 丹參酮II

15、A對血管性癡呆小鼠皮層和海馬谷氨酸和-氨基丁酸含量的影響如圖6所示，血管性癡呆小鼠皮層谷氨酸和-氨基丁酸的含量均明顯低于假手術組（P0.05）；而丹參酮IIA組小鼠谷氨酸和-氨基丁酸含量與血管性癡呆組比較，均明顯增加，具有學意義（P0.05）。如圖7所示，血管性癡呆小鼠海馬谷氨酸和-氨基丁酸的含量均明顯低于假手術組（P0.05）；而丹參酮IIA組小鼠谷氨酸和-氨基丁酸含量與血管性癡呆組比較，均明顯增加，具有統計學意義（P0.05）。 4 討論 本實驗行為學結果顯示, 術后30 d模型組出現明顯的學習記憶功能障礙, 表現為逃離潛伏期的延長和在目標象限中游泳時間的縮短, 而丹參酮IIA 治療 組則

16、學習記憶成績明顯好于模型組, 表明丹參酮IIA能改善學習記憶能力。大量研究表明, 氧化應激損傷在多種神經退行性病變包括神經元缺血性損傷中亦起關鍵作用8。腦缺血和再灌流期間產生大量的自由基, 使MDA含量升高, 并消耗SOD而使其活性下降, 而且自由基的大量產生是遲發性神經元損害的主要原因。一方面由于反復腦缺血再灌流, 使缺血組織不斷得到大量新的氧供, 結果大量激活黃嘌呤氧化酶, 產生大量超氧陰離子自由基并廣泛攻擊富含不飽和脂肪酸雙鍵的神經元膜和微血管, 引發脂質過氧化“瀑布狀”連鎖反應和微循環障礙,致使大量神經元損害；另一方面又使缺血期間因氧耗竭而停滯的烷自由基向脂質過氧化物自由基轉化得以延續

17、, 造成新的惡性循環。此時, 體內抗氧化劑被自由基大量消耗, 而反應所產生的自由基又超過了體內清除能力, 缺血組織中自由基急速蓄積, 必然進一步攻擊其他細胞的生物膜結構, 造成更多的細胞壞死,半暗帶區進一步惡化, 梗塞范圍迅速擴展9。已有報道指出丹參酮IIA在心肌缺血再灌注后組織中表現出很強的抗氧化作用2，本實驗亦表明丹參酮IIA降低缺血小鼠腦內MDA含量，增加GSH-Px和SOD活性，對慢性腦缺血動物表現出良好的抗氧化作用，故推測丹參酮IIA的抗氧化作用可能是其發揮神經保護作用的機制之一。 目前均認為, 缺血性腦損傷與興奮性氨基酸的毒性作用有關, 較多報道均指出腦缺血急性期神經細胞外液主要的

18、興奮性氨基酸谷氨酸水平都有較明顯升高, 但隨著缺血時間的延長, 其水平逐漸恢復到正常水平10。關于較長時間的慢性低灌注導致的小鼠不完全性腦缺血后腦組織內氨基酸水平如何變化目前國外報道并不多見, 國內較多報道均認為血管性癡呆模型小鼠腦組織內興奮性氨基酸水平升高11。但本實驗發現血管性癡呆模型小鼠皮層和海馬組織內谷氨酸和-氨基丁酸含量均較假手術組小鼠腦內氨基酸含量低, 且有統計學意義(P0.05), 而丹參酮IIA治療組的小鼠腦內谷氨酸和-氨基丁酸含量則均高于血管性癡呆模型組。血管性癡呆模型小鼠谷氨酸和-氨基丁酸含量降低是否可以這樣理解:缺血初期, 由于能量障礙, 大量興奮性氨基酸釋放, 觸發興奮

19、性毒性作用, 而較長時間大腦供血不足后, 腦細胞代謝障礙, 使各種氨基酸吸收和合成障礙, 故而谷氨酸和-氨基丁酸含量均減少低于正常水平。本實驗結果表明, 長期慢性腦缺血可使小鼠腦組織內谷氨酸和-氨基丁酸含量均降低, 而谷氨酸和-氨基丁酸為中樞神經活動必需氨基酸，丹參酮A通過提高腦組織內谷氨酸和-氨基丁酸含量, 改善血管性癡呆模型小鼠的學習記憶功能, 加強神經電生理活動, 這一作用對血管性癡呆病人的治療可能有一定益處。總之，丹參酮IIA在血管性癡呆模型小鼠可改善其學習記憶，表現出較強抗氧化作用，同時能夠調節興奮性氨基酸和抑制性氨基酸的含量。除了上述兩種作用機制之外，筆者推測亦有可能有其他機制參與

20、其神經保護作用，尚需要進一步的研究，從而闡明丹參酮的神經保護作用機制，為上更好的利用丹參酮治療腦缺血性病人提供理論依據。【 參考 文獻 】 1Myron DG. Neuroprotection for ischemicstroke: Past, present and futureJ. Neuropharmacology, 2008,55: 363.2Han JY, Fan JY, Horie Y, et al. Ameliorating effects of compounds derived from Salvia miltiorrhiza root extract on microcir

21、culatory disturbance and target organ injury by ischemia and reperfusionJ. Pharmacol Ther. 2008,117(2): 280.3Yu XY, Lin SG, Zhou ZW, et al. Tanshinone IIB, a primary active constituent from Salvia miltiorrhza, exhibits neuro-protective activity in experimentally stroked rats J. Neurosci Lett. 2007, 417(3): 261.4鐘先陽, 羅仁, 魏 華，等. 丹參酮IIA對大鼠出血性休克再灌注腎損傷的保護作用 J. 中國 中西醫結