1、造血細(xì)胞分離、集落培養(yǎng)及表型分析所謂造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一類細(xì)胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即經(jīng)過一個(gè)細(xì)胞周期活動(dòng)之后，可以產(chǎn)生兩個(gè)與分裂前性質(zhì)相同的造血干細(xì)胞,同時(shí)又具有多向分化能力，即在一定的環(huán)境條件下，造血干細(xì)胞具有向各系血細(xì)胞分化的能力。圖1 造血系統(tǒng)和造血干細(xì)胞分化圖Fig。 1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation. 造血干細(xì)胞主要存在于骨髓、動(dòng)員的外周血、臍血中，與骨髓和動(dòng)員的外周血相比，臍血來源豐富

2、、受病毒污染的幾率小、富含造血干細(xì)胞且所含的造血干細(xì)胞具有更高的增殖潛能，同時(shí)臍血中的淋巴細(xì)胞幼稚，具有較低的免疫排斥活性，是優(yōu)良的造血干細(xì)胞來源。造血干/祖細(xì)胞鑒別的傳統(tǒng)方法還是應(yīng)用集落分析方法，它可檢測粒-巨嗜細(xì)胞集落形成單位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、紅系爆式集落形成單位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核細(xì)胞集落形成單位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、紅系-粒系-巨嗜系-單核系集落形成單位（multipoten

3、t colony-forming units，CFU-GEMM或mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)集落。造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志隨著個(gè)體發(fā)育的不同時(shí)期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已經(jīng)普遍被認(rèn)為是造血干細(xì)胞的標(biāo)志。此外，1997年發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的造血干細(xì)胞標(biāo)志是AC133，但具CD34抗原是目前公認(rèn)的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的共同標(biāo)志。一、實(shí)驗(yàn)原理1、用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型   待測細(xì)胞被制成

4、單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動(dòng)下進(jìn)入流動(dòng)室，流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細(xì)胞排成單列出流動(dòng)室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細(xì)胞液柱。這種同軸流動(dòng)的設(shè)計(jì)，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種分層鞘流的狀態(tài)。鞘液和樣品流組成一個(gè)圓形的流束，一起自噴嘴的圓形寶石孔噴射出來，進(jìn)入流動(dòng)室，與水平方向的激光光束垂直相交。該區(qū)稱為測量區(qū)。利用樣品流和鞘流的氣壓差的層流原理，使細(xì)胞依次排列成單行，每個(gè)細(xì)胞以均等的時(shí)間依次通過測量區(qū)，被熒光染料染色的細(xì)胞受到強(qiáng)烈的激光照射后發(fā)出熒光，同時(shí)產(chǎn)生散射光。細(xì)胞發(fā)出的熒光信號和散射光信號，同時(shí)被熒光光電倍增管接收，被積分放大反轉(zhuǎn)換為

5、電子信號輸入電子信息接收器、通過計(jì)算機(jī)快速而精確地將所測數(shù)據(jù)計(jì)算出來，結(jié)合多參數(shù)分析，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的定量分析。2、單個(gè)核細(xì)胞的分離采用密度梯度原理，利用血液中各類細(xì)胞的密度不同進(jìn)行分離。3、CD34+細(xì)胞分選利用抗原抗體反應(yīng)的原理，樣品中的CD34+細(xì)胞可與偶聯(lián)有CD34抗原的磁珠反應(yīng)，將MiniMACS 免疫磁性吸附柱置于磁場中，未與磁珠結(jié)合的CD34-細(xì)胞隨緩沖液流出，與磁珠結(jié)合的CD34細(xì)胞保留在吸附柱中，將吸附柱移出磁場后用MACS緩沖液沖洗吸附柱即獲得純化的CD34細(xì)胞。4、集落檢測利用造血干細(xì)胞的特性，在特定的條件下，造血干細(xì)胞可向某一系的細(xì)胞分化，從而在半固體培養(yǎng)基上形成一個(gè)個(gè)

6、的克隆，即集落，一個(gè)集落代表一個(gè)造血干/祖細(xì)胞。二、實(shí)驗(yàn)材料臍血 臍血由上海國際和平婦嬰保健院提供。供者要求身體健康，發(fā)育良好的非高齡產(chǎn)婦。無遺傳病史，無病毒病史，無血液系統(tǒng)疾病，無寄生蟲病及地方病。HIV、肝炎、梅毒等檢測均為陰性。健康產(chǎn)婦分娩以后，立即用血袋無菌采取新生兒臍帶血，血袋內(nèi)裝有無菌ACDB25mL抗凝劑(每100mLACDB含有：一水合枸櫞酸0.48g，二水合枸櫞酸鈉1.32g，一水合葡萄糖1.47g)，相當(dāng)于100mL的血液抗凝劑，每次實(shí)際采集臍帶血50-100mL。采集后臍帶血置于4冰箱內(nèi)保存，一般在6小時(shí)內(nèi)取回分離。培養(yǎng)基與細(xì)胞因子培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基，添加20%的胎牛

7、血清。細(xì)胞因子均為人重組蛋白，干細(xì)胞因子（SCF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-3（IL-3）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、紅細(xì)胞生成素（EPO）、三、實(shí)驗(yàn)方法 單個(gè)核細(xì)胞的Ficoll密度梯度離心分離將臍血用IMDM培養(yǎng)基以1：2稀釋，在50mL離心管中加入15mL Ficoll，之后小心加入30mL稀釋的臍血平鋪在Ficoll上，之后置于吊籃式離心機(jī)中在400g下密度梯度離心30min，吸取中間的白層，用IMDM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，除去淋巴細(xì)胞分離液和血小板。集落分析方法CFUGM的檢測體系為IMDM培養(yǎng)基，添加20胎牛血清，4m

8、mol/mL谷氨酰胺，含0.9甲基纖維素，以及人重組造血生長因子SCF、IL-3、IL-6，GMCSF、GCSF,其濃度分別為50 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL和20ng/mL。半固體培養(yǎng)在24孔板中進(jìn)行，每孔加半固體培養(yǎng)基500mL，加入2.5×104個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。在37、5CO2、濕度飽和的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天后在顯微鏡下進(jìn)行集落計(jì)數(shù)，超過50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞簇為一個(gè)集落。 流式細(xì)胞分析取1.0×106細(xì)胞用PBS洗兩遍，重懸后分配到1.5mL管中離心，加PE偶聯(lián)的小鼠抗人CD34單抗和FITC偶聯(lián)的小鼠抗人CD45單抗各10mL，

9、4孵育30分鐘。PBS洗兩遍，離心后，每管加1mL FACS保存液。同型對照以PE偶聯(lián)的小鼠抗真菌毒素標(biāo)記。標(biāo)記細(xì)胞用流式細(xì)胞儀（BD公司）分析，結(jié)果用Lysis II軟件處理，以CD45設(shè)門進(jìn)行分析。臍血CD34細(xì)胞的分離純化將1.0×108細(xì)胞懸浮于0.3mlMACS緩沖液中，加 50l偶聯(lián)于磁珠的小鼠抗人CD34+抗體，4孵育30分鐘，采用MiniMACS 免疫磁性吸附柱分離裝置洗滌吸附柱中進(jìn)行分離，未與磁珠結(jié)合的CD34-細(xì)胞隨緩沖液流出，與磁珠結(jié)合的CD34細(xì)胞保留在吸附柱中，將吸附柱移出磁場后用MACS緩沖液沖洗吸附柱即獲得純化的CD34細(xì)胞。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、單個(gè)核細(xì)胞的

10、分離臍血的體積臍血中單個(gè)核細(xì)胞液體積分離出的單個(gè)核細(xì)胞液的密度分離出的單個(gè)核細(xì)胞液的體積收率樣品12.540ml樣品21.2540ml2、造血干/祖細(xì)胞集落計(jì)數(shù)孔內(nèi)接種的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)目孔內(nèi)的集落數(shù)每10000個(gè)細(xì)胞中集落的數(shù)目一袋臍血中總集落數(shù)樣品12.543樣品22.5313、臍血中CD34+細(xì)胞的數(shù)量CD34+細(xì)胞的比例一袋臍血中CD34+細(xì)胞的總數(shù)樣品1樣品24、臍血中分離得到的CD34+細(xì)胞的數(shù)量CD34+細(xì)胞的數(shù)目樣品1樣品2五、討論1、從一袋血獲得的CD34+細(xì)胞數(shù)與集落形成數(shù)之間有和關(guān)聯(lián)？2、用MiniMACS 免疫磁性吸附柱分離法獲得的CD34+細(xì)胞數(shù)，與流式細(xì)胞分析的結(jié)果是否

11、一致？若不一致，原因何在？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、冷凍和復(fù)蘇I. 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠蓜?dòng)物細(xì)胞表達(dá)和合成的蛋白質(zhì)除了具有正確的氨基酸序列之外，在加工過程中還能以正確的方式進(jìn)行折疊和修飾，且大多能以天然形式分泌到培養(yǎng)基中，從而確保了所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)具有與天然產(chǎn)物一致的生物活性、免疫原性和體內(nèi)壽命，這些特點(diǎn)使得動(dòng)物細(xì)胞成為工業(yè)化生產(chǎn)診斷和治療用生物產(chǎn)品的理想宿主，如各類重組蛋白質(zhì)和單克隆抗體等。另外，目前方興未艾的組織工程、干細(xì)胞工程等也是和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)密切相關(guān)的，因此，可以說細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞工程、組織工程等研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)的目的是讓學(xué)生學(xué)習(xí)和了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作，以及相關(guān)

12、的細(xì)胞培養(yǎng)前準(zhǔn)備工作、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件和其他有關(guān)注意事項(xiàng)；用血球計(jì)數(shù)板對培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)以及用臺盼藍(lán)計(jì)細(xì)胞的存活率。二、 基本原理動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體的細(xì)胞或組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)，是動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，原代培養(yǎng)是指將機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行實(shí)效培養(yǎng)的過程，這樣的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞，原代細(xì)胞通常只能培養(yǎng)1050代左右即退化死亡；由原代細(xì)胞通過變異、分化等手段篩選出來具有無限次代培養(yǎng)能力的細(xì)胞群稱為細(xì)胞系，這類細(xì)胞的培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞根據(jù)其生

13、長方式，主要可分為貼附型細(xì)胞和非貼附型細(xì)胞兩類，貼附型細(xì)胞必須貼附在某一固相表面才能生存和生長，非貼附型細(xì)胞可在培養(yǎng)液中懸浮生長，因而也叫懸浮型細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)有很大不同，這主要是因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，且大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞只有附著在固體或半固體表面才能生長。雖然動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理和微生物類似，但動(dòng)物細(xì)胞對于營養(yǎng)的要求更加苛刻，除氨基酸、維生素鹽類、葡萄糖外，通常還需要血清；對于培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性也比微生物差，其對環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，培養(yǎng)過程中一般需嚴(yán)格監(jiān)控；動(dòng)物細(xì)胞生長緩慢，因此培養(yǎng)時(shí)間較長，它們對環(huán)境的影響又比微生物大，因此常

14、用空氣、氧氣、二氧化碳和氮?dú)獾幕旌蠚怏w進(jìn)行供氧和調(diào)節(jié)pH。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)還需要防治污染問題，細(xì)菌、真菌、病毒或細(xì)胞均可導(dǎo)致動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的污染，而生物的組織材料、操作者自身、培養(yǎng)基、各種器皿以及環(huán)境都有可能含有污染物。因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)周期通常為數(shù)天到數(shù)周，培養(yǎng)時(shí)間較長，因此防治污染問題則更加顯得重要。細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要對細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測，這就必須在培養(yǎng)過程中隨時(shí)取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。最簡單、直接和最經(jīng)濟(jì)的方法是用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)取血球計(jì)數(shù)板四角的四個(gè)大方格，每個(gè)方格面積為1.0mm2，點(diǎn)樣后其厚度為0.1mm，這樣每個(gè)方格的體積即為1.0×10-4ml，細(xì)胞數(shù)的計(jì)算公式為：四個(gè)大

15、方格總細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)×104÷4，單位是細(xì)胞數(shù)/mL。細(xì)胞存活率或稱細(xì)胞活性的檢測是用臺盼藍(lán)染色方法，其原理是活細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，染色劑不能滲入，因而不能被染色，而死細(xì)胞的細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞被染上藍(lán)色，存活率為：活細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100。三、 儀器、材料和試劑1. 超凈工作臺2. 倒置顯微鏡3. 二氧化碳培養(yǎng)箱：設(shè)定二氧化碳濃度為5。4. 培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基，除菌過濾；自制無血清培養(yǎng)基，0.22m濾膜除菌過濾。5. 血清：Hyclone新生小牛血清。6. PBS緩沖液，0.22m濾膜除菌過濾。7. 胰酶：溶于PBS緩沖液，濃度0.25，

16、0.22m濾膜除菌過濾。8. 玻璃方瓶、5ml和10ml移液管，121濕熱滅菌，30分鐘。9. 血球計(jì)數(shù)板10. 移液槍11. 臺盼藍(lán)染色液：0.4克臺盼藍(lán)溶于100ml PBS緩沖液，過濾待用。四、 實(shí)驗(yàn)步驟1. 貼附型細(xì)胞傳代培養(yǎng)（1） 倒掉將要傳代的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；（2） 用10ml無菌PBS洗滌，倒掉；（3） 加入2ml胰酶溶液（0.25），進(jìn)行消化；（4） 顯微鏡下觀察，直至所有細(xì)胞由鋪展?fàn)顟B(tài)收縮為圓球形；（5） 倒掉胰酶；（6） 按稀釋要求加入新鮮培養(yǎng)基，吹打分散，分裝入玻璃方瓶，置于二氧化碳培養(yǎng)箱。2. 懸浮細(xì)胞傳代培養(yǎng)按貼附型細(xì)胞傳代培養(yǎng)步驟（6）操作即可。3. 細(xì)胞計(jì)數(shù)

17、（1） 將干凈的蓋玻片覆蓋在血球計(jì)數(shù)板正中央，壓緊使它們之間不留空隙；（2） 待計(jì)數(shù)樣品如果需要，用PBS進(jìn)行稀釋；（3） 取0.5ml稀釋后的樣品，加入0.5ml臺盼藍(lán)染色液（0.4），用滴管輕輕吹打混合；（4） 用滴管將細(xì)胞懸浮液沿蓋玻片兩側(cè)緩緩滴入血球計(jì)數(shù)板的兩個(gè)平臺上，直至平臺上完全充滿細(xì)胞懸浮液， （5） 顯微鏡下計(jì)數(shù)，并按上述公式計(jì)算細(xì)胞密度；五、 注意事項(xiàng)1. 胰酶消化的程度必須掌握好，消化不足則細(xì)胞結(jié)團(tuán)，無法分散，這將嚴(yán)重影響傳代后細(xì)胞的生長，消化過量則會(huì)使細(xì)胞嚴(yán)重受損；2. 在將細(xì)胞懸浮液滴加到血球計(jì)數(shù)板上時(shí)注意不能過量以至于細(xì)胞懸浮液溢出平臺，同時(shí)不能出現(xiàn)氣泡；3. 對于稀

18、釋比例，應(yīng)掌握在每個(gè)大方格內(nèi)含2550個(gè)細(xì)胞為合適；4. 對于每個(gè)大方格中剛好壓在邊線上的細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)只計(jì)入兩條邊線上的細(xì)胞而忽略另兩條邊線上的細(xì)胞，例如將上側(cè)和左側(cè)邊線上的細(xì)胞計(jì)入，那么下邊和右邊邊線上的細(xì)胞則不能計(jì)入，不論細(xì)胞是大半在方格內(nèi)還是小半在方格內(nèi)。六、 實(shí)驗(yàn)記錄記錄四個(gè)大方格內(nèi)各自的活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，并最終計(jì)算樣品的細(xì)胞密度。七、 思考題1. 傳代培養(yǎng)過程中導(dǎo)致污染的原因有哪些？2. 引起細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差的原因有哪些？II.細(xì)胞的冷凍和復(fù)蘇一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募?xì)胞在體外長期傳代中并不是穩(wěn)定不變的，它們常常會(huì)發(fā)生各種變異，表現(xiàn)在形態(tài)、生長特性、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)甚至細(xì)胞核型也會(huì)發(fā)生變異，這些變異往往

19、會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的丟失，細(xì)胞功能的喪失以及生物安全性方面的問題。因此，在構(gòu)建好細(xì)胞株后需要建立一個(gè)細(xì)胞庫，用低溫冷凍的方法將細(xì)胞保存起來，以便隨時(shí)有新鮮的細(xì)胞可供使用，確保研究或生產(chǎn)所用的細(xì)胞在一定的時(shí)間內(nèi)具有結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性和一致性。本實(shí)驗(yàn)的目的是讓學(xué)生學(xué)習(xí)和了解細(xì)胞凍存、復(fù)蘇的目的和基本操作方法。二、 基本原理在動(dòng)物細(xì)胞的組成成分中90以上是水，而水在冷凍過程中會(huì)形成冰晶，由于動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，冰晶會(huì)使細(xì)胞膜發(fā)生破裂而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此要維持冷凍和復(fù)蘇過程中細(xì)胞的存活率，必須在冷凍液中加入冷凍保護(hù)劑。常用的冷凍保護(hù)劑有二甲基亞砜（DMSO）和甘油，其中二甲基亞砜因?yàn)槠鋵?xì)胞具有良好的保護(hù)性和較低的毒副作用二成為首選。在冷凍和復(fù)蘇過程中影響細(xì)胞存活率的因素主要是保護(hù)劑濃度和溫度下降速率，實(shí)際操作中二甲基亞砜的濃度通常為510，一般來說，冷凍過程中溫度必須緩慢下降，盡可能減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成；在復(fù)蘇過程中對細(xì)胞產(chǎn)生傷害的原因主要是解凍過程所形成