1、ILK在cGVHD狼瘡樣小鼠腎小管上皮細胞轉分化中的作用         08-11-21 15:47:00     作者：黃霞，王美美    編輯：studa20【摘要】  目的 觀察整合素連接激酶（ILK）在慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼瘡樣小鼠腎臟中的表達，探討其在狼瘡腎炎腎小管上皮細胞轉分化中的作用。方法 建立cGVHD狼瘡樣小鼠模型，將小鼠分成正常對照組(A組)、12周模型組(B組) 和16周模型組(C組)，每組

2、6只。采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法、western blot、免疫組織化學法分別檢測ILK 、E-鈣粘蛋白和-平滑肌肌動蛋白（-SMA）mRNA和蛋白在腎組織中的表達。結果 RT-PCR和western blot方法分別檢測到B、C兩組小鼠腎組織ILK、-SMA mRNA和蛋白表達較A組升高(P均0.01)， E-鈣粘蛋白表達降低(P均0.01)。ILK蛋白和mRNA表達與-SMA表達呈正相關（r分別為0.83，0.86，P均0.01），與E-鈣粘蛋白表達呈負相關（r分別為-0.84，-0.89，P均0.01）。免疫組化結果表明，與A組相比，B、C兩組小鼠腎小管及間質均可見ILK、

3、-SMA蛋白顯著表達，而E-鈣粘蛋白的表達顯著減少。結論 cGVHD狼瘡樣小鼠腎組織中ILK蛋白及mRNA表達明顯上調，可能通過介導腎小管上皮間充質細胞轉分化而參與了狼瘡腎炎腎間質纖維化的進程。 【關鍵詞】  移植物抗宿主病；狼瘡腎炎；粘蛋白類；腎小管；小鼠；動物實驗Abstract:  Objective  To determine the expression of integrin-linked kinase (ILK) in renal tissue of mice with chronic graft versus host disease (cGVHD

4、) lupus nephritis and its relationship with the epithelial-mesenchymal transition.  Methods  cGVHD lupus nephritis mice models were conducted. All the mice were divided into three groups: group A (control group, n=6), group B (12-week model group, n=6) and group C (16-week model group, n=6

5、).  The mice were killed twelve weeks later (group B) or sixteen weeks later (group C), respectively. The protein and mRNA expressions of ILK, alpha-SMA and E-Cadherin in kidney were detected by using immunohistochemistry, western blot and RT-PCR, respectively.  Results  The  pro

6、tein and mRNA expression of E-cadherin were significantly down-regulated (P<0.01) in group B and group C compared with group A, while expressions of ILK and  alpha-SMA were up-regulated, respectively (P<0.01). The protein and mRNA expressions of ILK were positively correlated with alpha-S

7、MA (r=0.83, and 0.86, all P<0.01), but  adversely associated with E-cadherin (r=-0.84, and -0.89, all P<0.01).  Conclusion  The elevating expression of ILK may play an important role in the process of lupus nephritis through mediating the epithelial-mesenchymal transition.  

8、;   Key words:  graft versus host disease; lupus nephritis; mucins; kidney tubules; mice; animal experimentation狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）是系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus， SLE）最常見臨床表現之一，其病理改變具有多樣性及不均一性，以腎小球、腎血管、腎間質的損害為主要特征，后期可發展為腎小球硬化、纖維性新月體、間質纖維化及其腎小管萎縮等。與其他慢性腎臟疾病一樣，腎臟纖維化是各型LN進展到終

9、末期的必經階段。腎小管上皮細胞間充質轉分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腎臟纖維化的發生發展中起重要作用，近年來一些研究提示整合素連接激酶（integrinlinked kinase，ILK）可能是介導EMT的關鍵因子1，但是在LN中EMT的形成以及ILK與EMT關系的研究報道尚少。我們以慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus  host disease，cGVHD）狼瘡樣小鼠為模型，觀察不同時期ILK、E-鈣粘蛋白和-平滑肌肌動蛋白(-SMA)在腎組織中的表達，并探討ILK在狼瘡腎炎腎小管上皮細胞轉分化中的作用

10、。1  材料與方法1.1  實驗動物  810周齡（C57BL/6J×DBA/2）F1代雜交雌性小鼠（以下稱F1代鼠）及46周齡DBA/2雌性小鼠購自中山大學醫學動物中心，體重（19.99±1.99）g，SPF級。1.2  模型的建立與分組  按隨機設計原則將F1代鼠分為正常對照組（A組）、12周模型組（B組）及16周模型組（C組），每組6只小鼠。建立cGVHD狼瘡樣小鼠模型。取DBA/2小鼠脾臟、胸腺、淋巴結細胞，制成單細胞懸液（約60%脾細胞、30%胸腺細胞及10%淋巴結細胞）。分別于第0、3、7、10天注射于模型組F1

11、代鼠，每次注射給予細胞數約為50×106個。正常對照組于相同時間點經尾靜脈注射與單細胞懸液等體積的生理鹽水。于首次注射單細胞懸液之日起，于第12周末處死B組小鼠，于第16周末處死A組和C組小鼠。處死后立即取下腎臟，將腎包膜完全剝離后，一部分保存于-80以備提取總RNA和蛋白質，另一部分固定于10%中性福爾馬林溶液中，經石蠟包埋后切片進行組織病理檢查及免疫組織化學實驗。1.3  組織病理切片  2m連續切片，至經多聚賴氨酸包被的載玻片上，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，分別行蘇木素伊紅（hematoxylineosin，HE）染色和Masson染色。1.4  免

12、疫組織化學  SP法進行免疫組化染色。將腎組織石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%過氧化氫室溫孵育10min滅活內源性過氧化物酶，微波修復抗原，10%正常羊血清封閉，37孵育15min，分別滴加兔抗小鼠ILK抗體（150，Upstate公司）、兔抗小鼠E-鈣粘蛋白抗體（1100，Sigma公司）、兔抗小鼠-SMA抗體（1100，Santecruz 公司）4孵育過夜，再依次加入生物素偶聯的羊抗兔IgG抗體和辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素，各37孵育15min 二氨基聯苯胺(DAB)染色，顯微鏡下控制顯色，HE復染，常規脫水、透明、封片鏡檢。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照

13、。1.5  western blot  取80保存的腎組織5080mg，加適量裂解液后勻漿，冰中靜置30min，離心，取上清，測蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液，煮沸4min，瞬時高速離心，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移蛋白至PVDF膜上，麗春紅染色觀察轉膜情況，TBST洗膜，5BSA封閉，分別加入兔抗小鼠ILK抗體，兔抗小鼠E-鈣粘蛋白抗體、兔抗小鼠-SMA抗體、兔抗小鼠，室溫孵育1.5h，TBST洗膜，化學發光顯示結果。圖片掃描保存后用Totallab 2.01分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數字化。以GAPDH為內參，用目的蛋白條帶灰度值與內參灰度值的比值代表目

14、的蛋白的相對表達含量。1.6  逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)表  引物序列（略）PCR反應體系5×PCR緩沖液10l，MgCl2(25mmol/L) 4l，dNTPs(10 mmol/L)1l，上下游引物各1l（10mol/L），cDNA模版1l，TaqDNA聚合酶（5U/l ）(TAKARA公司)0.25l，補足雙蒸水至50l。97預變性后，94變性30s，59退火50s，72延伸1min為一個循環，共38個循環后，72終末延伸7min。1.7  統計學處理  計量資料采用±s表示，使用SPSS 13.0統計軟件，兩組間比較采

15、用檢驗，兩變量間相關性采用直線相關分析。2  結果2.1  腎臟病理改變  模型組腎小球系膜區增寬，基質大量增生；小管多灶性萎縮，管腔內可見蛋白管型及細胞管型，B組間質大量單個核細胞浸潤并有基質沉積，C組細胞數減少并出現部分腎小管空泡化。Masson染色可見C組小鼠腎小球囊壁，腎小管間質有明顯的膠原纖維沉積，B組膠原纖維較C型組少，主要位于腎小管間質。A組腎組織未見明顯膠原沉積。2.2  免疫組織化學檢測結果  見圖。ILK在A組腎小球及腎小管上皮細胞中無明顯表達，在B組小鼠腎組織小管及間質中表達增強，而在C組小鼠腎組織中表達較B組進一步增加。

16、E-鈣粘蛋白幾乎表達于A組所有上皮細胞中，而在B組、C組小鼠隨著腎小管上皮細胞結構的破壞，表達減弱。A組-SMA僅表達于血管平滑肌細胞和間質少量成纖維細胞，B組小鼠腎小管上皮細胞和間質-SMA的表達開始升高，C組小鼠腎小管上皮細胞和間質中-SMA陽性細胞數明顯增加。A圖  A組腎小球及腎小管上皮細胞中無明顯表達；（略）           B圖  B組小鼠腎組織小管及間質中表達增強；（略）             C圖