1、生化制品技術實驗大綱一、實驗目的本實驗是生化制品技術課程的配套實驗，目的是增加學生對生物藥物及生物技術制藥的感性認識及提高學生的實驗操作能力。要求學生熟悉并掌握生物藥物的制備過程和生物技術制藥的基本操作方法。二、適用專業及層次適用于生物制藥技術專業學生三、實驗內容和學時分配序號實驗內容學時實驗類型必做/選做備注1牛奶中酪蛋百和乳蛋白素粗品的制備4操作實驗必做2卵磷脂的制備及鑒定4操作實驗必做3薄層板制備及使用4操作實驗必做4甘露醇的制備及鑒定4操作實驗必做5甲殼素制備4操作實驗必做合計20實驗一 牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制備一、實驗目的1.掌握鹽析法的原理和操作。2.掌握等電點沉淀法的原理

2、和基本操作。二、實驗原理乳蛋白素是一種廣泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白質。牛奶中主要的蛋白質是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右會沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才會沉淀。利用此一性質，可先將pH降至4.8，或是在加熱至40的牛奶中加硫酸鈉，將酪蛋白沉淀出來。酪蛋白不溶于乙醇，這個性質被利用來從酪蛋白粗制劑中除去脂類雜質。將去除掉酪蛋白的濾液的pH調至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分雜質即可隨澄清液出去。在經過一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。三、實驗器材燒杯（250ml和100ml）、玻璃試管（10mm×100mm）、離心管（50ml）、磁力攪拌器、pH計

3、、離心機、水浴鍋。四、試劑和材料脫脂牛乳或低脂牛乳、無水硫酸鈉、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、濾紙、pH試紙、濃鹽酸、乙酸緩沖溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。五、操作步驟1.鹽析或等電點沉淀制備酪蛋白（1）將50ml牛乳倒入250ml燒杯中，于40水浴中加熱并攪拌。（2）向上述燒杯中緩緩加入（約10min內分次加入）10g無水硫酸鈉，再繼續攪拌10min（或加熱到40，再在攪拌下慢慢地加入50ml40左右的乙酸緩沖液，直到pH達到4.8左右，將懸浮液冷卻至室溫，放置5min）。（3）將溶液用細布過濾，分別收集沉淀和濾液。沉淀懸浮于30ml乙醇中，傾于布氏漏斗

4、中，過濾出去乙醇溶液，抽干。將沉淀從布氏漏斗中移出，在表面皿上攤開以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。準確稱重。2.等電點沉淀法制備乳蛋白素（1）將制備酪蛋白操作步驟（3）所得濾液置于100ml燒杯中，一邊攪拌，一邊利用pH計以濃鹽酸調整pH至3±0.1。（2）將溶液倒入離心管中，6000r/min離心15min，倒掉上層液。（3）在離心管內加入10ml去離子水，振蕩，使管內下層物重新懸浮，并以0.1mol/L氫氧化鈉溶液調整pH至8.59.0（以pH試紙或pH計判定），此時大部分蛋白質均會溶解。（4）將上述溶液以6000r/min離心10min，上層液倒入50ml燒杯中。（5）將燒杯

5、置于磁攪拌加熱板上，一邊攪拌，一邊利用pH計以0.1mlo/L鹽酸調整pH至3±0.1。（6）將上述溶液以6000r/min離心10min，倒掉上層液。取出沉淀干燥，并稱重。六、結果與討論1.計算出每100ml牛乳所制備出的酪蛋白數量，并與理論產量（3.5g）相比較。求出實際獲得率（%）。2.計算出100ml牛乳所制備出的乳蛋白素數量。實驗二 卵磷脂的制備及鑒定一、實驗目的學習從蛋黃中制備卵磷脂的方法和基本操作。二、實驗原理利用卵磷脂可溶于乙醇的性質，將卵黃溶于乙醇，卵磷脂從卵黃中轉移到乙醇溶液中，可分離提取出來，而蛋白質等某些雜質從沉淀物中除去。但由于乙醇溶劑抽提時，其他物質也一起

6、被抽提，如甘油三脂、甾醇等。利用卵磷脂不溶于丙酮的性質，用丙酮從粗卵磷脂溶液中沉淀磷脂，能使卵磷脂與其他脂質和膽固醇分離開來。無機鹽和卵磷脂可生產絡合物沉淀，因此可利用金屬鹽沉淀劑將卵磷脂從溶液中分離出來，由此除去蛋白質、脂肪等雜質，再用適當溶劑萃取出無機鹽和其他磷脂雜質，這樣可大大提高卵磷脂純度。三、實驗器材離心機、旋轉蒸發儀、布式漏斗、抽濾瓶、真空干燥箱、層析缸、紫外分光光度計。四、試劑和材料95%乙醇、丙酮、10%ZnCl2、2%氯仿、碘、甲醇、0.1%乙醇、無水乙醇。五、操作步驟1、粗提室溫下，取適量的雞蛋卵黃用2倍于卵黃體積的95%乙醇進行提取，混合攪拌，離心分離（3000r/min

7、，5min），將沉淀物重復提取3次，回收上清夜；然后減壓蒸餾（45）至近干，用少量石油醚洗下粘壁的黃色油狀物質；加入丙酮，抽濾，分離出沉淀物，真空干燥（40，30min），得到淡黃色的粗卵磷脂，稱重。2、精制取一定量的卵磷脂粗品，用無水乙醇溶解，得到約10%的乙醇粗提液，加入相當于卵磷脂質量的10%的ZnCl2水溶液，室溫攪拌0.5h；分離沉淀物，加入適量冰丙酮（4）洗滌，攪拌1h，再用丙酮反復研洗，直到丙酮洗液為近無色止，得到白色蠟狀的精卵磷脂；干燥；稱重。3、鑒定（1）薄層色譜分析 將卵磷脂樣品與對照品分別配成2%氯仿溶液，用GF254硅膠板進行層析，展開劑為氯仿甲醇水（65254），層析

8、完畢后，取出薄板，干燥，碘蒸汽顯色。（2）紫外吸收光譜測定 將一定量卵磷脂樣品溶于無水乙醇，配成0.1%乙醇溶液，用紫外分光光度計掃描其在90400nm的吸收光譜，可測得卵磷脂的紫外最大吸收峰。卵磷脂紫外最大吸收峰在215nm波長。六、結果與討論1.計算卵磷脂得率，討論影響卵磷脂得率的主要因素。2.根據薄層色譜圖譜、紫外吸收光譜分析所制備的卵磷脂的純度。實驗三 薄層板的制備及使用實驗一 薄層色譜板的制備和使用目的要求：通過實驗進一步理解薄層色譜技術理論，熟悉掌握薄層色譜板的制備和使用方法。一、薄層層析的基本原理把吸附劑（固定相）均勻地鋪在一塊玻璃板上，將待分離的樣品溶液點加在一薄層板的一端，在

9、密閉的容器中用適當的溶劑（流動相）展開，由于吸附劑對不同物質的吸附力大小不同及溶劑對不同物質溶解分配系數不同，當溶劑流過時，各物質在吸附劑和溶劑之間發生連續不斷地吸附，解吸附，再吸附，再解吸附。不易被吸附或易被溶劑溶解的物質相對移動得快一些。經過一段時間的展開，不同的物質被彼此分開，最后形成相互分離的斑點。將展開完畢的薄層板從密閉容器中取出后，應用特定的試藥或方法將斑點顯色，從而達到定性和定量的目的。二、薄層板的制備1玻璃板用一塊玻璃板涂上很薄的吸附劑，如硅膠或氧化鋁等，玻璃板要求薄厚一致，大小相同，表面光滑平整，一般玻璃只要合乎這些要求就可。如果找不到平整均一的，將舊光學照像底片截成同樣大小

10、也可以。用前先將玻璃用肥皂和水洗干凈，必要時浸泡在清洗液中，然后水洗烤干，用紗布擦光。玻璃板大小有各種規格，一般有20×20、20×10、20×5厘米，也有更小的，可根據需要自行設計。寬度要求至少能點開兩三個樣品，每兩點之間相隔至少1.5厘米，玻板長度一般要滿足展開10厘米的距離。點樣的起點應距底邊至少1.5厘米的距離。2吸附劑應用最廣泛的為硅膠和氧化鋁，市場上有專供薄層色譜用的吸附劑，規格分不含粘合劑的硅膠H，氧化鋁H和含有粘合劑熟石膏的硅膠G，氧化鋁G，如市售硅膠G含13熟石膏，氧化鋁分中性、酸性、堿性三種。吸附劑的粒度范圍最好在180200目之間，太小了流速

11、慢，太大則影響分離效果。如不合要求，應過篩。3薄層板的涂布最簡單的涂布方法是用兩條比玻璃板厚025毫米的玻璃條或有機玻璃條（或在同樣厚度的玻璃條下粘一層膠布），將玻璃板夾住，把調好的吸附劑漿液平鋪在薄層板上，然后用一有機玻璃條或直尺，迅速均勻地向前推進，就象推血片一樣，只要推進的速度均勻一致，即可得到薄厚均勻的薄層板，如在一塊玻璃板末端再接一塊相同的玻璃板，把剩余的裝液接過去，可使涂層邊緣整齊，厚度一致，吸附劑漿液的加水量和攪拌時間是涂布成敗的關鍵，像12×8平方厘米的玻璃板需要23克硅膠G，加46毫升水即可，只要技術熟練即能涂成厚薄一致，光滑平整的一塊薄層板。不同性質不同批號的吸附

12、劑，加水量和攪拌時間有時可有差異，應根據情況摸出規律。為了達到涂布的各板厚度均勻一致，最好采用涂布器進行薄層的涂布。為了增加薄層的牢固性及易于保存，可在涂布過程中加入某些粘合劑以增加薄層的硬度。一般采用添加劑羧甲基纖維素鈉（CMCNa），應用方法是取CMC-Na 1克溶于100毫升水中，加熱煮沸溶解，按比例與硅膠攪勻，鋪板。涂成之后先把玻板放在平面上，室內干固，再對光檢查，看是不是均勻，有無氣泡，平整光潔度如何，合格的上烤箱110加熱30分鐘進行活化，冷卻后貯于干燥器內備用。在進行實驗時，應盡量可能采用同批號涂布活化的薄層板，以減少因活化不一致引起的Rf值發生差異，目前國內市場已有成品供應，如

13、黃巖化學分析材料廠即有各種類型的薄層板出售。三、薄層板的使用1點樣將樣品溶于適當的溶劑中（應盡量避免有水），取微量注射器或玻璃毛細管截齊后，吸取一定量的檢樣，輕輕接觸到薄層上，使樣品自動吸到薄層上，點的直徑不要超過0.3厘米，一次不能點完，待干后再點，稍有過分就會損傷板面，影響展開后的斑點形狀。每兩個樣點之間相距至少1.5厘米。點樣的起點距薄板底邊至少1.5厘米，以免樣點浸入展開溶劑中，同塊薄板上各樣點應保持在與底邊平行的一條直線上，為控制好點樣距離，應用薄層點樣尺架。2展開根據薄層板大小，自行選用適當玻璃標本缸，長方形，如17×10×6厘米的標本缸可容納下15×

14、9厘米的玻璃板。采用較大的玻璃缸和玻璃板時，在缸內沿周圍缸壁襯一層預先浸有溶劑的濾紙，以便缸內展開溶劑易達到飽和，防止邊緣效應（即兩邊緣的點走得快）和同一物質Rf值不一致現象。一般將薄層板斜置展開容器內，密閉。先不使溶劑浸濕薄層板，飽和1015分鐘后再進行展開，展開溶劑沿著薄層板向上移動。對加粘合劑的涂板可以近于垂直的狀態進行展開，而對未加粘合劑的薄層板則必須以傾斜狀態（15度角）進行展開。為了防止產生“邊緣效應”和展開溶劑不飽和現象。還可采用夾心式展開容器，其方法是將薄層板的左右兩側各刮去510毫米，墊上條狀玻璃或塑料，蓋一塊與薄層板同樣大小的玻璃，用夾子將兩邊夾好，插入展開溶劑中進行展開，

15、并能取得良好效果。3顯色薄層展開后，涼干。如含粘合劑，即可直接噴顯色劑，使之顯色，有的還需經紫外線（254nm）照射后方能顯色；對不含粘合劑的薄板，在噴顯色劑時應盡量遠離薄層板，否則會連吸附劑一起吹掉，應予以注意。四、檢樣的定性定量分析1比移值（Rf）的測定當樣品的薄板一端被展開，經過毛細管作用流向另一端，樣品是按一定的比例分配在固定相與流動相之間。并沿著溶劑流動的方向移動，由于樣品中各組分在兩相中分配系數不同，各組分的移動速度也不同，經一定距離后使各組分彼此分離。樣品各組分移動的速率，亦即分離后在薄層板上的位置與溶劑展開前沿的距離的比值為比移植。2定性分析相同的物質Rf值應當是相同的，但因能

16、影響Rf值的因素很多，要想得到與標準物質相同的Rf值，最好在鑒定時，將樣品與標準物質點在同一張薄層板上一同展開，根據檢樣斑點的Rf值與標準樣品的Rf值比較，即可確定二者是否相同，但要做到準確的定性，需要兩種以上展開溶劑系統所得的Rf值比較判斷。3定量分析（1）目測比較法用吸附劑（如硅膠G）涂布成厚0.250.5毫米，大小20×20厘米的薄層板，110活化30分鐘，室溫冷卻。用微量注射器（10微升）在距板底1.5厘米處，將標準樣品溶液按1、3、5、7微克自左向右點在起始線上，然后再吸取不同量的檢材提取溶液（相同于1、3、5克檢材的提取溶液）按次序點在同一板的右側。選擇比移值適中的展開劑

17、（Rf在0.450.75之間者）用夾心式展開法或連續薄層展開法。展開距離為10厘米，顯色劑要求能使顯色后的斑點明顯清晰。這樣得到的色斑比較集中，重現性好，便于比較。顯色后，觀察其色斑大小，深淺與已知不同濃度的標準樣品系列色斑相比較，粗略定出含量，然后算出檢液總體中含量，根據所取檢材量，求出百分含量。（2）洗脫測定法在制備好的薄層板左端，先點一標準樣品點，作為對照定位用，然后根據檢材提取溶液的多少，在同一板的右端點成點狀或線狀。置玻璃缸中展開（如有連續薄層展開儀更好），展開后晾干，再用玻璃板遮住右側檢材部分，僅使對照定位點顯色。顯色后，根據斑點位置將未顯色部分（相當于色斑所在部分）的吸附劑用刮刀

18、刮下或用抽吸法收集起來。將收集的吸附劑置于小層析柱管中，用極性大的溶劑甲醇或乙醇進行洗脫，收集洗脫液并加以濃縮。用適當溶劑調整到一定體積，可用紫外分光光度計，在被檢物最大吸收波長處進行測定。同時用薄層吸附劑洗脫液作空白吸收值測定。如有靈敏度高專屬性好的比色反應，還可用比色計測定化合物的含量。上述洗脫液亦可作為氣相色譜儀、液相色譜儀分析前的處理液。（3）薄層色譜掃描儀測量法以洗脫法處理層析色斑，不僅操作麻煩，而且有些待測成分不能定量地洗脫下來。或者在洗脫過程中發生分解，影響測定結果的準確性，最好是采用雙波長薄層色譜掃描儀直接定量檢測，經電子積分器積分推算出檢樣中待測物質的含量。其測定方法包括為：

19、斑點面積測量法；斑點光密度測量法；斑點熒光測量法。附：實驗儀器1薄層涂布器 2微量注射器 3薄層點樣尺架4薄層板展開缸 5吸引器 6噴瓶7烘烤箱實驗四 甘露醇的制備及鑒定一、實驗目的1.了解甘露醇的化學和物理特性。2.掌握從海帶中分離提純甘露醇的原理和操作方法。二、實驗原理甘露醇為白色針狀晶體，無臭，略有甜味，不潮解。易溶于水，溶于熱乙醇，微溶于低級醇類和低級胺類，微溶于吡啶，不溶于有機溶劑。在無菌溶液中較穩定，不易被空氣所氧化，熔點166。甘露醇在海藻、海帶中含量較高。海藻洗滌液和海帶洗滌液中甘露醇的含量分別為2%與1.5%，是提取甘露醇的重要資源。本實驗以海帶為原料，用自來水浸泡提取甘露醇

20、；通過調節酸度，沉淀除雜質；煮沸濃縮后用乙醇沉淀甘露醇；最后通過回流、重結晶、活性炭脫色等工藝精制甘露醇。三、實驗器材pH試紙、電爐、布式漏斗、抽濾瓶、回流裝置。四、試劑和材料海帶（市售）、30%NaOH、硫酸-水（11）、95%乙醇、粉末活性炭、1mol/L三氯化鐵溶液、1mol/LNaOH溶液。五、操作步驟（1）浸泡、堿化、酸化 將海藻或海帶加20倍量自來水，室溫浸泡23h，浸泡液用作第二批原料的提取液，一般浸泡4批后浸泡液中的甘露醇含量已較大。收集浸泡液用30%NaOH，調pH1011，靜置8h，凝集沉淀多糖類黏性物，待海藻液、淀粉及其他有機黏性物充分凝聚沉淀。虹吸上清液，用11H2SO

21、4-H2O中和至pH67，進一步除去膠狀物，得中性提取液。（2）濃縮，醇洗 直接用火或蒸汽加熱至沸騰蒸發，溫度110150，大量氯化鈉沉淀，不斷將鹽類與膠污物撈出，直至呈濃縮液，取小樣倒于玻璃板上，稍冷卻至室溫后，離心甩干除去膠質，得灰白松散物。（3）提取 取松散物，加入8倍量的95%乙醇加熱回流30min，靜置一晝夜，2500r/min離心甩干，得白色松散甘露醇粗品，同上操作，乙醇重結晶1次。（4）精制 甘露醇粗品加適量蒸餾水，加熱溶解，再按5%質量加入粉末活性炭，不斷攪拌，加熱至沸騰，趁熱過濾，少許水洗活性炭2次，合并洗濾液（如有渾濁重新過濾），高溫濃縮至濃縮液相對密度為1.2左右時，在攪

22、拌下冷卻至室溫，低溫結晶，抽濾至干，得到結晶甘露醇，烘干得甘露醇成品。（5）鑒定 取所制得的甘露醇成品飽和溶液1ml，加1mol/L三氯化鐵溶液與1mol/LNaOH溶液各0.5ml，即生成棕黃色沉淀，振搖不消失，滴加過量的1mol/LNaOH溶液，即溶解成棕色溶液。符合此現象，可初步斷定為甘露醇。六、結果與討論1.稱重，計算甘露醇的得率。2.討論影響甘露醇的得率因素。實驗五 甲殼素制備一、實驗目的1、掌握以蝦殼或蟹殼為原料，用酸堿法制備甲殼素；用制備好的甲殼素脫乙酰化制備殼聚糖。2、了解甲殼素與殼聚糖的應用，黏度計的使用。二、實驗原理甲殼素廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼動物的外殼。甲殼素一般與蛋白質或碳酸鈣或兩者同時緊密結合在一起，成為絡合物，通過酸堿處理可除去鈣鹽及蛋白質等雜質，蝦、蟹殼還有色素，可以通過氧化還原除去。甲殼素是聚-2-乙酰胺基-2-脫氧-D-吡喃葡糖，是一種線形中性高分子多糖，經濃堿處理去掉乙酰基得到脫乙酰甲殼素，即殼聚糖。三、儀器設備烘箱、水浴鍋、天平等。四、相關知識點多課程知識點：多糖化學特點，生化提取方法：蛋白質分解方法，碳酸鹽降解方