1、微陣列比較基因組雜交技術及其在腫瘤研究中的應用 【摘要】 微陣列比較基因組雜交(array-CGH) 技術是將DNA克隆或cDNAs做成微陣列，代替?zhèn)鹘y(tǒng)CGH法中中期染色體作為雜交靶，不僅使分辨率提高，甚至可以確定腫瘤相關基因并提供精確的定位。全文綜述Array-CGH的原理、方法及其在腫瘤學中的應用和意義。 【關鍵詞】 微陣列-比較基因組 微陣列比較基因組雜交(array-comparative genomic hybridization，Array-CGH)技術是將DNA 克隆或cDNAs做成微陣列，代替?zhèn)鹘y(tǒng)CGH檢測中將中期染色體作為雜交靶進行檢測，不僅使分辨率提高，而且還可以確定腫瘤相

2、關基因并提供精確的定位。同時可經計算機軟件識別每條染色體，克服了需要經驗豐富的人員識別染色體的限制，為快速全面地分析腫瘤組織DNA 拷貝數(shù)的變化，以及染色體不穩(wěn)定性的檢測提供了較為理想的方法。本文就該技術原理、方法及其在腫瘤研究中的應用作一簡單的綜述。 1 微陣列比較基因組雜交概述 1.1 Array-CGH基本原理 Array-CGH與CGH相似，但它是用DNA克隆或cDNAs微陣列代替中期染色體鋪片作為雜交靶，即將等量的不同熒光標記的待測和參照DNA經人Cot-1DNA封閉非特異性重復序列后，同時雜交到由DNA克隆或cDNAs組成的微陣列上。用微陣列每個靶點上的兩種信號的熒光比例反映待測基

3、因組DNA在相應的序列或基因上的拷貝數(shù)變化15。 1.2 方 法 微陣列可以為DNA克隆微陣列和cDNAs微陣列。DNA克隆是在BAC、PAC 或YAC載體中克隆的DNA片段。cDNAs 微陣列，可以從樣本中提取總 RNA，再分離mRNA，然后將得到的cDNAs進行PCR擴增。用專門的儀器將 DNA克隆或cDNAs點樣至覆蓋特定介質的玻片上，按照在染色體中的分布，確定靶點的排列順序。為了得到精確的結果,每個靶點可重復點樣210次。點樣后，立即將玻片在80烘烤10min，制成微陣列玻片，存儲在帶有干燥劑的盒子里，室溫保存1，2，47。 待測 DNA可以來自腫瘤細胞系、冷凍或石蠟包埋的腫瘤組織。應

4、盡可能選擇具有典型組織學特征的腫瘤細胞，棄除壞死組織和炎癥區(qū)及周邊正常細胞，以免干擾。使用標準的酚氯仿異戊醇提取法分離腫瘤細胞和組織中的 DNA。對于甲醛固定、石蠟包埋組織,可以用激光捕獲顯微切割法（LCM）獲得腫瘤組織，提取DNA，再用變性引物介導的PCR（DOP-PCR）擴增和標記8，參照 DNA來源于健康人血液中的白細胞或同一患者同一器官中正常組織。對探針可以進行直接或間接熒光標記。標記方法有以下幾種：缺口平移法；隨機引物法；DOP-PCR法；順鉑熒光素連接法1，9等。標記完成后用SephadexG5旋轉柱去除未結合的核苷酸1。 將不同熒光標記的待測和參照DNA（各1）與人Cot-1（6

5、0）混合，封閉非特異重復序列，降低本底作用。然后將待測和參照DNA 80熱變性10min。37孵育12h，再與已經預熱的微陣列37雜交過夜，雜交后洗滌微陣列玻片，蓋上蓋玻片。對于DNA克隆微陣列，可以用DAPI復染，有助于定位靶克隆1，2，48。 用共聚焦掃描裝置或帶有冷光源相機的光學設備獲取圖像，并用專門的分析軟件處理數(shù)據(jù)。需要確定實際的靶區(qū)域、靶信號強度和局部背景強度。從靶信號強度中扣除局部背景得到靶熒光比例。將正常標本在微陣列全部靶點的平均熒光比例調整為1，代表無DNA拷貝數(shù)變化。利用全部靶點的平均熒光比例（M）和標準差（s）確定拷貝數(shù)變化的界限。獲得和缺失分別定義為（M+2s）和（M-

6、2s），高水平擴增定義為（2M+2s）7。分析時去除在正常樣本中熒光信號不知的點（熒光信號高出背景20）和有過多熒光殘骸的點8。DNA拷貝數(shù)圖像可以用移動平均值（moving average）（5個相鄰的靶）顯示。移動平均值用于減少靶信號交叉引起的誤差和降低背景8，9。 1.3 可行性檢測和質量控制 Urban等10用已知有-globin位點缺失的人用Array-CGH法進行檢測驗證Array-CGH檢測染色體基因組缺失或擴增是否可靠，結果均檢測到了缺失的存在，證明該芯片系統(tǒng)可以準確地檢測基因或基因組的缺失。Veltman等11為用Array-CGH法檢測膀胱腫瘤患者DNA拷貝數(shù)變化，為確定該

7、技術及該芯片在檢測基因或基因組改變的可信性，先用正常人對正常人的組織進行對比試驗，結果沒有缺失或擴增的信號出現(xiàn)。而在膀胱癌患者的組織中檢測到了明顯有擴增或缺失的信號發(fā)生。而這些缺失或擴增的部位，含有相應的癌基因或抑癌基因。證明此方法在檢測基因擴增或缺失中，得出的結果是可信的。 1.4 Array-CGH的特點 Array-CGH技術具有兩方面明顯優(yōu)勢：靈敏度和精確性：由于染色體DNA以高度密集和超螺旋的形式存在著，因此傳統(tǒng)CGH只有在DNA序列缺失達10Mb20Mb（細胞株）或20Mb30Mb（原發(fā)腫瘤）以上或序列擴增時擴增子與擴增拷貝數(shù)之積至少2Mb才被檢測出來。故傳統(tǒng)CGH所提供的信息中必

8、然包含有為數(shù)眾多的基因，需要作進一步的精確定位。Array-CGH避開了復雜的染色體結構，所雜交的靶序列僅為包含了少數(shù)基因的短DNA片段，所以能找出傳統(tǒng)CGH檢測不出的DNA序列拷貝數(shù)的差異，并同時將擴增或缺失的范圍精確地定位在某個或某幾個已知基因或未知基因上。自動化、程序化：染色體帶型的復雜性和個體差異決定了核型分析不可能全部實現(xiàn)機械化，必須依靠經驗豐富的細胞遺學家對核型分析軟件得出的結果進行校正后才能進一步分析基因組的不平衡性。因此傳統(tǒng)CGH的技術受人為因素的限制，需要一定的經驗技術和勞動力支持。Array-CGH技術中不需要染色體核型的制備和分析，與普通的基因芯片檢測表達譜的過程一樣，其

9、結果完全可以由機器和計算機綜合分析后即可獲得樣品中大量基因序列及表達的信息。 1.5 Array-CGH技術的分類 根據(jù)微陣列上所固化的核苷酸的性質，Array-CGH可分為cDNA Array-CGH和DNA Array-CGH兩種類型。前者以常規(guī)的cDNA 微陣列為平臺，基因芯片表面固定的探針來自待測種屬的cDNA文庫。cDNA Array-CGH技術使得大規(guī)模、高通量研究基因的改變成為現(xiàn)實。DNA Array-CGH技術是直接將基因組DNA片段固化于芯片表面，因此靶序列上不但有基因編碼區(qū)，還包含了內含子、重復序列、其他調控序列等非翻譯區(qū)，增加了實驗結果的信息量。同時由于基因組DNA片段長

10、于cDNA片段，因而DNA Array-CGH的雜交信號強于cDNA Array-CGH，提高了實驗的敏感度。但cDNA Array-CGH芯片制備相對容易，而DNA Array-CGH芯片上廣泛分布的表達序列標簽也有助于所得序列進一步純化和點陣。因此這兩種Array-CGH技術各有所長，在實際工作中可根據(jù)具體情況和實驗要求作出選擇。 2 Array-CGH技術在腫瘤研究中作用 Array-CGH應用超高密度和長寡核苷酸探針，對多種腫瘤相關染色體區(qū)域的DNA拷貝數(shù)變化具有較高的分辨率，從而可以找出基因組的改變，并可精細到基因和外顯子水平的改變；也可以檢測到很小范圍的基因擴增和缺失以及小于500

11、堿基對的染色體斷點位置。該技術最新進展，Nimblegene公司研制的芯片,在一芯片上含有385 000個探針，一次可以分析成千上萬個基因組的變化，甚至可以確定相關基因并提供精確的定位1214。 2.1 乳腺癌 應用Array-CGH技術，得到許多乳腺癌DNA拷貝數(shù)變化的圖譜。Garcia等15應用Array-CGH在乳腺癌的研究中，不僅證實了傳統(tǒng)CGH法探測到的8p1112上的擴增和過表達區(qū)域與新發(fā)現(xiàn)FLJ14299，C8orf2， BRF2和RAB11FIP這四個基因密切相關，而且還認為這四個基因是最好候選“始動”癌基因。Varma等16應用Array-CGH研究不同地區(qū)及經受核輻射的乳腺

12、癌患者基因拷貝數(shù)變化及基因表達水平，發(fā)現(xiàn)大量的以前沒有被報道過的乳腺癌癌前病變的突變基因，并確定了用來鑒別來自核放射性微塵地區(qū)乳腺癌患者的基因拷貝數(shù)的變化圖譜，發(fā)現(xiàn)共同擴增的基因在8p13.2、1p21.1、8q24.21，而在1p36.22、17p13.2、8p23.3基因有缺失。 浸潤性導管癌和所有的浸潤性小葉性癌大約80的患者16q上都有部分基因缺失。共同的位點是在54.555.5Mb 和 57.458.8Mb。而丟失的峰值 (83%)卻發(fā)生在61.962.9Mb17。Pole等18應用Array-CGH對48例乳腺癌患者及MDA-MB-134，MDA-MB-175，MDA-MB-361，T-47D和ZR-75-18p五個乳腺癌細胞系進行分析，發(fā)現(xiàn)均有8p遠端丟失并在4Mb處有倒置，近端100kb丟失，而在NRG1和11q片段之間可以檢測到3倍擴增。乳腺癌中相當部分的表現(xiàn)型獨特性可能歸因