1、脂質體在超聲藥物和基因傳遞中的應用摘要作為藥物和基因傳遞系統的脂質體在大多數藥物治療中起到重要的作用。近來，在超聲控制藥物釋放和超聲增強藥物傳遞系統中，脂質體用來包裹氣體和藥物。通過不同的方法制備可發生回聲脂質體，包括凍干，高壓，生物素-抗生物素蛋白結合。目前，超聲控制釋放藥物和用于基因傳遞的脂質體體外主要應用于心臟病，中風和癌癥的治療。這些傳遞系統應用于臨床還需要全面的了解，提高物理性質以避免體內快的清除，還有可能的副作用，包括使用的超聲。本文獻的目的是在超聲增強脂質體和基因傳遞的研究領域為研究者提供研究方向。關鍵字：脂質體；超聲；藥物傳遞；基因傳遞；氣體；氧化亞氮1. 引言 藥物到達病變部

2、位的有效的傳遞很大程度上取決于藥物足夠的局部濃度和足量藥物跨過內皮細胞的轉運。脂質體藥物傳遞系統已被證實有增加體內特殊病變部位藥物劑量的作用1-4.基于超聲的方法是通過增加藥物跨細胞膜或內皮屏障的作用來提高藥物或者基因的傳遞5-9.應用適當的參數,超聲能形成空腔, 它是一個氣體空泡成核,生長,震動的過程.空腔形成包括快速生長和氣泡的破裂(惰性空腔)或者氣泡持久的震蕩(穩定的空腔).兩種形式的空泡可以對組織產生較強的物理-化學或生物效應5.尤其是,空腔氣泡的破裂導致沖擊波或者高速的微噴射流,它們可以擊穿細胞和組織的細胞膜,從而來提高藥物的轉運.由于體內缺少內源性氣體，血液和組織組成的環境很難誘導

3、惰性空腔，除非處于超聲劇烈震蕩和與之相關的負壓的條件下10.然而, 劇烈震蕩可能會破壞細胞和組織,因此需要引起注意。先前已有的空化核，一種超聲造影劑，能降低形成空腔的閾值。在超聲造影劑存在的條件下，較低能量的超聲就可以使藥物或者基因方便的到達許多種細胞，如鼠的成纖維細胞，軟骨細胞11, 中國倉鼠卵巢細胞12,人癌細胞HeLa, NIH/3T3C127I 13,14, 前列腺癌細胞DU1457,還有許多組織比如肌肉15-18,肝臟19,20,肺19, 脈管系統19,21-23,大腦,和腫瘤部位8,24-26.超聲造影劑一般由微氣泡組成,這種微氣泡由表面活性劑來穩定27,28.經常使用的表面活性劑

4、包括血清白蛋白, 聚合物, 磷脂29.當用磷脂作為氣體穩定劑,兩種結構中的一種是典型要的: 在氣泡的表面有脂質單層,或者包含氣體的脂質體(回聲脂質體)30-32.當用于增強超聲易化藥物和基因傳遞時, 回聲脂質體具有以下特點:1) 回聲脂質體與普通脂質體有著相似的載藥量.2) 包裹著治療制劑的回聲脂質體可與抗體結合,靶向到特殊的病變部位,形成局部高濃度并降低系統毒性.3) 可以控制內容物的釋放速率。使用單個的高振幅的超聲脈沖可以達到快速釋放，用一系列的低振幅的脈沖可以達到緩釋釋放，或者兩者結合使用。這些選擇有些情況下特別使用，比如有時要提高局部濃度達到治療水平并且使其保持一段時間。4) 超聲激發

5、氣泡破裂引起的空腔可以增加不同粒徑的分子對細胞和組織的滲透性，因此可以促進藥物或基因向細胞和組織轉運。5) 回聲脂質體的超聲反射可以引導藥物和基因的傳遞。2.回聲脂質體概述脂質體是一種自發形成的脂質雙分子層，內部是從大量水相中分離出來的親水的小室（圖1）33.與脂質單分子層結構相比，脂質體的特點就是可以延伸，兩面性和分開的親水和疏水區域。脂質雙分子層的親水基朝向水相（內部和外部），兩個脂質層的疏水基相互靠近，形成了膜的內核。脂質體作為藥物傳遞系統的特別之處就是它能同時包裹水溶性和水不溶性物質。水溶性物質被包裹在水相內核，水不溶性或油溶性疏水藥物包在脂質雙分子層中34。由于脂質體可以是陽性的（在

6、處方中加入陽離子脂質），它們可以載大量的不需要特別生產或處理過程的DNA，并且有較低的免疫反應在基因傳遞中35,36。由于高穩定性，提高生物分布和在血液中的最優循環性，有些脂質體處方已被FDA認證4（表1）。脂質制劑最初被修飾形成氣體包囊作為靶向造影劑用于超聲成像增強劑38-42.這些制劑被命名為回聲脂質體（見圖2和表2）.據推測，當氣體被包裹在脂質體內，由于熱力學原因，表現出像疏水藥物一樣位于脂質雙分子層的兩個單分子之間或者作為單分子包裹的氣泡在脂質體的水相隔室中43. 回聲脂質體保留了普通脂質體的特性因此可以共同包裹氣體和藥物或者基因作為藥物和基因的傳遞體44-46。最新證據表明氣體微囊的

7、穩定性很大程度上取決于包裹的氣體和脂質殼的性質47比如氣體跨過脂質殼的擴散速度48,49，脂質層的厚度和微泡的粒徑50,51,和人血清和血清蛋白的存在52.圖1.脂質體的脂質雙分子層示意圖。根據制備方法，三種基本的回聲脂質體結構已被研究（圖2和表2）.第一種回聲脂質體有兩個室，正如前面提到的。小室中含有氣體并用單層與大室分開，大室中含有水相（圖2A）。這一結構可通過低壓凍干法制備32,38或者高壓冷凍法。第二種結構也稱為囊泡脂質體，有單分子層包裹的氣體囊泡在脂質體的水相中53(圖2B)。囊泡脂質體是基于通過相轉變蒸發的方法制備的PEG修飾的脂質體（PEG-脂質體）；PEG-脂質體放在充有高壓全

8、氟丙烷氣體的管形瓶中，然后用超聲儀進行超聲46.第三種結構是普通脂質體通過生物素-抗生物素蛋白鍵共價接合到穩定的氣體囊泡上，形成一種復合物45(圖2C).低壓凍干法制備回聲脂質體包括脂質體在甘露醇存在條件下的冷凍干燥 32，使其產生兩個室。小室包含氣體并用脂質體的單層與大室分開，大室含有水相。用這種方法制備時，在冷凍和升華干燥步驟中包含一些沒有冷凍保護作用或者容易結晶的溶質（如甘露醇）是很重要的。甘露醇的重要功能是引起雙分子層破裂并使破裂的脂質體最大程度的暴露于空氣中47.Huang等人介紹的高壓冷凍技術產生相同結構的回聲脂質體。在這一方法中，通過增加氣體的壓力產生一個過飽和水相，然后進行冷凍

9、操作，這樣導致氣體和溶質分子濃縮，對包囊是有利的43.由于氣體低的溶解度，傳統的制備脂質體的過程都無法包裹氣體。通過加壓來增加氣體的包裹可以用Henry方程解釋。因為大多數氣體的溶解度很低，脂質體包裹氣體需要增加氣體在水溶液中的數量。根據Henry方程，氣體的溶解度與液體上方氣體的壓力成正相關。當氣體的壓力比周圍溫度對應的平衡飽和氣壓值低，相當，或者高時，溶液被稱為不飽和，飽和或者過飽和。因此，隨著壓力增加，溶液中氣體分子的濃度也增加。隨后的凍干步驟可能有兩個目的，增加溶解氣體的局部濃度和大量氣體中小塊核的形成。這一步驟不僅將空氣包裹而且也將溶解于水相中的藥物一起包裹54。最近，一種新的生產有

10、聲學活性的脂質體已被研究，通過生物素-抗生物素蛋白鍵使脂質體和氣體囊泡連接。每個微泡周圍可連接平均直徑200nm和100nm的脂質體分別高達1000和10000個（圖2C）。藥物和基因可用傳統的方法裝載于脂質體中。連接脂質體和微泡的鍵，含有5%的聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-生物素（PEG-DSPE-生物素），很大程度上取決于抗生物素蛋白的濃度（高于抗生物素蛋白濃度10nM）。脂質體-忍耐性強的微泡隨著聲波振動并且逐漸瓦解，方式與微泡造影劑相同。最近FDA批準的磷脂基質的造影劑的典型結構是由一層脂質單分子膜包圍高分子量（>400 Da）的氣體55,56。這一造影劑已被用于藥物載體，特別

11、是包裹疏水性藥物，盡管疏水性藥物和基因可以在微細胞表面吸附。氣態核產生聲學阻道失配，這將導致微泡有高回音，可以被用于超聲波成像。包裹或吸附的藥物或基因可以通過超聲釋放15,21,27,57,58。盡管它們代表著可行的發展方向，需要理解的是回聲脂質體制劑還仍處于臨床前階段。圖2.三種不同類型的回聲脂質體示意圖。A).表示一種回聲脂質體的結構，水相內容物通過超聲釋放。在制備過程中希望有大量的不均一性存在，以致于氣體和水相室的比例有很大不同。然而，所有脂質體是單層是不可能的。B).含有C3F8氣體的PEG修飾的回聲脂質體結構。C).表面載有脂質體的微泡。微泡由5% DSPE-PEG2k包衣，并通過5

12、%DSPE-PEG2k-生物素與載有5%DSPE-PEG2k-生物素和5%NBD-膽固醇通過抗生物素蛋白共價連接。NBD-膽固醇提供了混合載體結果的最優熒光測定，使結合量化，并使細胞內陷由于細胞-載體相互作用。3.藥物裝載和超聲刺激釋放 脂質體可以裝載大量制劑，包括親水性和親脂性藥物，寡核苷酸，蛋白質，多肽和基因等3,35,59-63.回聲脂質體保留了普通脂質體載藥的性質。例如，產生回聲活性的脂質體的過程與含有15%分子量黃綠素包裹效率是相一致的，黃綠素是一種存在于含有水溶性藥物的水相室的熒光指示劑。當裝載水溶性藥物的脂質體含有氣體，就變成了對超聲刺激敏感的藥物。有兩個室的回聲脂質體超聲刺激時

13、釋放藥物最可能的機制從脂質體的結構可以看出來，其結構中一個脂質體中含有兩個室。聲波較弱的相會引起空氣的膨脹并伸展到雙分子層。如果壓力足夠使其延伸到脂質體膜，并超過彈性限度，脂質體內容物就會被釋放出。回聲脂質體對超聲刺激的敏感性與脂質體的組成和包裹的氣體以及超聲應用參數有關。脂質雙分子層通過疏水基相互作用而緊密連在一起，這些疏水基有自封性質導致脂質體表面破裂后又會很快封閉起來43,64。顯然，像白蛋白包衣的阿馬諾嗪那樣的硬殼造影劑只對超聲波壓力有反應，當壓力足夠大時就可以引起殼不穩定。這是因為白蛋白的柔韌性沒有磷脂殼好。不像白蛋白基質的囊泡破裂依賴于足夠強烈的超聲，脂質包裹的囊泡擴張和收縮平滑，

14、并且即使在超聲過程中也可以立即自發組裝修復膜結構65,66。因此，應用超聲時，磷脂殼的囊泡在它們變得不穩定或合并前可以延伸比它們最初的表面積多10倍65。因此，通過改變脂質膜的剛性來影響其對超聲的反映性是可行的。最優的氣體是在脂質體中有大的體積并在血液中的擴散速率低48,49。最有效的超聲波是組織可以忍受的最強的聲強度的一小段波43。這些參數對選擇合適的超聲刺激是重要的，同時每次應用時都需要研究。疏水性藥物可以裝載到回聲脂質體中；但是理論上，超聲時它們可能更加耐受從脂質體中釋放，因為它們與脂質體的聯系是基于在雙分子層內部的溶解度比在水中的高。因此，藥物可能仍留在破裂脂質體的脂質碎片中。一種處理

15、疏水性藥物的方法是使用環糊精賦予它們親水性。環糊精的外部表面是親水的，并有一小塊疏水基結合區，因此可以顯著增加疏水性藥物的水溶性54。通過親水基團包衣的疏水性藥物就有和親水性藥物相同的釋放特性。4.回聲脂質體增強的超聲空腔細胞膜和內皮是許多藥物特別是基因藥物的屏障。細胞膜由一脂質雙分子層膜（厚度<50nm），其中嵌有蛋白質分子或者在其表面67,68。內皮由單分子內皮細胞組成，內皮細胞之間有緊密連接可以封閉管腔。超聲被用來增加細胞和內皮的通透性，使藥物和基因能到達細胞和組織。回聲脂質體裝載的藥物不僅能靶向病變組織，增加該部位的局部濃度，而且可以靶向增強超聲易化細胞和內皮的通透性。除了釋放脂

16、質體內容物和提供該過程的成像外，超聲可以對組織產生效應，協同藥物傳遞，即通過空腔效應。超聲空腔效應可通過回聲脂質體增強。當氣泡破裂時，速度梯度和周圍液體產生的壓力產生高的機械強度69。這些能量足夠使細胞膜產生暫時的開口，這一現象的強度可能受超聲參數，細胞類型和造影劑性質的影響70。回聲脂質體的超聲行為不同于阿馬諾嗪，一種常用的蛋白造影增強劑。當使用輸出水平高于阿馬諾嗪的碎片閾值（3.5MHz，MI=0.27），4.5MHz諧波和6.9MHz 基本的B型超聲波時，對于兩種類型的B型超聲波，回聲脂質體耐受時間長于60s然后破碎，而用同樣的波時阿馬諾嗪在5s內被破壞71。Akowuah等比較了Son

17、oVue，BR14和阿馬諾嗪關于超聲增強的裸pGL3螢光素酶質粒向豬的血管平滑肌細胞轉運的體外實驗。所有這些造影劑都含有全氟化碳氣體，但是阿馬諾嗪是清蛋白基質的制劑，但是SonoVue和BR14是磷脂穩定的囊泡72.這兩種脂質穩定的囊泡中，SonoVue的基因傳遞效率是阿馬諾嗪的2.6倍。光學和聲學方法顯示脂質殼的囊泡通過兩種主要的機制經歷超聲破壞：在低超聲壓力下超聲溶解和在高壓力時母泡破裂成兩個或者更多的子泡73。通過應用超聲，當超聲壓力低時（200 kPa, 2.25 MHz），脂質殼內的氣體可穩定的振搖，在高壓時（大于300 kPa, 2.25 MHz），氣泡破裂是很重要的74。據報道，

18、在1.00 MHz和1.3 MPa條件下超聲將導致脂質殼囊泡從2um膨脹到大約20um。從絨(毛)膜尿囊的膜模型中外滲物的影像很相似的表達了從最大直徑為55um的管中滲漏的情形75。囊泡表面或者細胞壁快速破裂將產生一個流體噴射或者直接朝向壁的沖擊波，這將導致脈管的通透性增加76并且藥物呈對流傳遞。在1.0MHz下，藥物的對流傳遞速率是在0.5MPa壓力下為188.6um/s，在1.3MPa壓力下為362.5 um/s75。藥物通過超聲空腔的形成來提高轉運的效率很大程度上與藥物成分和超聲造影劑到生物膜的距離有關。Kodama等人發現轉運膜的通透性被誘導當其在距離囊泡中心5um內，在這個距離內外源

19、性的分子可以被轉運到細胞質。然而，必須承認的是藥物成分轉運到細胞核或者其它細胞室里要依賴于完全獨立的超聲效應的機制。例如，加入超聲造影劑將增加pDNA攝入到培養細胞的細胞質而不是細胞核77。5.藥物和基因傳遞的超聲成像既然回聲脂質體可以容易地為超聲診斷成像42,43，含有藥物的回聲脂質體同樣有用于超聲的潛力。因此可以用于監測藥物的傳遞，至少當有聲學活性的脂質體被用于傳遞裝置78。除了用于監測傳遞外，對于局部藥物傳遞，裝載藥物的回聲脂質體還有其它重要的優點。它們獨特之處在于，因為超聲可以聚焦到局部，并且調整相關的強度和脈沖頻率，可以運用于靶區使生物學效應達到最優化。因此，在特定的時間最大程度的釋

20、放藥物很明顯是可行的。另外，可以調整超聲波的特性來產生增加管壁通透性的額外的效應（要適當的，提前或者當脂質體存在時），因此可以使脂質體和內容物跨過脈管內皮到達靶組織變得容易79-81。6.藥物和基因傳遞的治療應用回聲脂質體在藥物和基因傳遞的治療應用是基于它們許多性質的結合，包括靶向，超聲控制藥物釋放，增加細胞和組織的通透性，還有超聲成像的能力。許多特別的應用可以被想象出。6.1. 血栓溶解 超聲已被證明有增加血栓溶解的作用，不管有沒有超聲造影劑的加入55,82。靶向或者無靶向的囊泡可以通過靜脈或者直接到達血塊。共價接合到超聲造影劑上，用于血塊靶向的配體包括精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD）多

21、肽83，纖維蛋白素原39,41，組織纖溶酶原激活物（tPA）84。已報道tPA裝載的回聲脂質體有血塊溶解的作用。含有tPA的有聲學活性的脂質體被發現在血塊區有高的濃度，由于tPA 結合在(血)纖維蛋白(單體)的表面。tPA裝載的ELIP在超聲條件下與有超聲時相同的操作下相比，可以增強49.5%的溶栓作用78,84。超聲增強溶栓的回聲脂質體的機制包括微泡自身的空腔效應85-87。當在低頻和高能條件下超聲時，超聲造影劑的振動可能導致血塊溶解。另外，因為tPA已經結合到回聲脂質體上，運用超聲可能刺激tPA的釋放（或者易化小的脂質體或碎片進入血塊）。已經證明空腔和超聲控制的溶栓制劑結合比只含有超聲造影

22、劑的超聲在溶血方面好84。6.2 動脈粥樣硬化在循環中，由于橫向力的作用超聲造影劑傾向于分布在脈管軸線上88。這在治療動脈粥樣硬化時將阻礙藥物的傳遞，這就要求循環的回聲脂質體與脈管內皮接觸。因此，合適的配體結合到脂質體的表面來支持回聲脂質體依附在脈管表面是很有利的。動脈粥樣硬化最早的一個事件就是單核細胞活化并依附在內皮細胞。活化的單核細胞從循環中結合到內皮上需要存在于內皮細胞上粘附分子的幫助，粘附分子有內皮粘附分子（ICAM），脈管細胞粘附分子（VCAM），內皮白細胞粘附分子（ELAM），還有P&F選擇蛋白89。研究表明，忍受單克隆抗體并靶向于ICAM -1的回聲脂質體在體外有好的結合

23、效率40,91。隨后，Hamilton等人41,42 將這些脂質體用于血管內us成像來強調血栓和在抵抗受傷的脈管時形成與粥樣斑有關的許多脈管標記。分子靶是ICAM -1，VCAM-1，纖維蛋白，纖維蛋白素原和組織因子（TF）；它們可以在脈管壁上產生靶向影像增強當靜脈注射脂質體5分鐘內92。除了配體增強了脂質體吸附到內皮組織的表面，低能量的超聲能使超聲造影劑和內皮的結合。這就是所謂的聲輻射力的結果，它有一個直接從聲源和次級聲源獲得的初級力組成。這些力在超聲造影劑之間是相互吸引的93-95。Dayton證明了初級輻射力能夠推動非靶向超聲造影劑從脈管中心到脈管壁96。在用人的黑素瘤單層細胞實驗中，S

24、hortencarier等人發現使轉運裝置進入細胞的聲輻射力波的應用需要裝置碎片成功的粘附在細胞膜上94。Rychak等人發現聲輻射力可以激烈增加到80倍-連接P選擇蛋白的脂質囊泡結合到內皮上，壁剪切力的速度為1244/s97。6.3基因傳遞超聲加速基因傳遞已在體內和體外被成功的證明9。這一系統的轉染率不僅受超聲參數，造影劑的存在，質粒DNA局部濃度的影響，還受轉染劑的影響。當DNA和陽離子脂質復合物被用時，在細胞培養和體外研究中重要的增強作用已被報道26,57,98。人們發現單獨使用DNA時超聲增強轉染80倍。聚乙烯亞胺（PEI）和DNA復合物（形成多聚物）能增加轉染90倍。然而，最重要的是

25、超聲和PEI的結合可以協同增加轉染200倍。這將導致細胞34%達到基因表達。動力學測定使我們認識到單獨使用超聲時效力大，而PEI單獨使用或者和超聲一起使用可以增加轉染，聲處理后培育4h的DNA質粒強烈的受益于PEI99。因此，選擇最優的脂質體轉染劑，將與超聲的增強效應產生協同作用，因為超聲增強膜的通透性一般發生在超聲應用時。裸pDNA與US的結合應用于全身作用是無效的，可能是由于裸DNA被血清核酸酶降解和在聲探器細胞環境中低濃度的DNA。對于超聲增強的脂質體基因傳遞中超聲和高轉染效率的制劑聯合使用時一個可行的方法。最新研究的聲活性的回聲脂質體以脂質體和氣泡結合的形式為這一應用提供了一個平臺。當

26、使用超聲時（1.2 W/cm2, 20 s,，工作期為50%），由聚乙烯二醇，二硬脂酸磷脂酰膽堿和全氟丙烷氣體組成的脂質體在小鼠眼睛里質粒DNA綠色熒光蛋白質的表達增加了60%。含有氣泡的脂質體的轉染率比脂(質)轉染(法)的高46。6.4.生物活性氣體的轉運許多氣體被認為有生物活性，包括氙，硫化氫，氧化亞氮，一氧化碳等。最近的動物實驗表明在腦或者心臟缺血后氙可以降低梗塞的范圍，一些氣體例如NO和CO在正常或者病變的生理中起著重要的作用。近幾年，研究者的興趣已經轉向H2S，另一種有生理活性的氣體。在體內外研究中發現它有擴張血管的活性100。最近，有報道稱腦內含有相對高濃度的內源性的H2S并且H2

27、S已被認為是腦部的神經調節劑/遞質101。氣態的藥物可以迅速跨過血腦屏障，因此可以很快在腦部和其它靶組織達到有效的濃度。另外，許多氣態的藥物在血液中有低的溶解度，這對藥物迅速進入和消除方面有利102。這對治療有利并且能降低副作用。生物活性氣體用于治療的障礙是缺乏合適的服藥方法和不知道潛在的副作用。含有氣體的脂質體已被用作超聲造影劑很多年，因為氣體界面在循環和周圍的組織間產生很高的對照。包裹的氣體在37的血清中產生回聲的半衰期為7個小時52。如果氣體被其它氣體如有生物活性NO氣體代替，這樣的脂質體可以被用作氣體藥物的載體并且是有生理活性的制劑。這尤其是在一個藥物或者生理學制劑在沒有保護狀態下有較

28、短的生存時間時特別有用。NO有許多不同的生物活性，但是作為氣體它在體內脈管轉運中是不穩定的。NO在循環中的半衰期是1.8ms。NO包裹在脂質體中可以避免NO在循環時被NO消除劑例如血紅蛋白清除。使用低壓冷凍的方法，在相對低的壓力下，30ul的氣體可以迅速的包裹在5mg的脂質中。用這種方法制備的脂質體NO自發釋放時有雙相性的性質，在開始的30分鐘釋放迅速，然后再接下來的8小時釋放緩慢。NO和氬的混合氣體提供了一個簡單的方法去調節NO的釋放速率。足夠的NO到達培養的平滑肌細胞時可以產生生物效應，即使有NO消除劑血紅蛋白的存在。體外實驗表明服用NO-ELIP到達囊損害的頸動脈時將阻止內膜的肥厚的51±6%。這一系統為轉運多數生物活性氣體到達靶組織提過了一個新的方法，當全身給藥時產生很小的效應103。回聲脂質體應用于生物活性氣體轉運是獨一無二的，并且還在初期，但是已有許多關于