1、酶工程復習大綱試題題型：名詞解釋，判斷題，選擇題，簡答題，論述題，實驗設計題第一章酶工程基礎、 名詞解釋：, 是工業 學反應，生產人酶：指生物體產生的具有催化活性的生物大分子。酶工程：由酶學與化學工程技術、基因工程技術、微生物學技術相結合而產生的一門新技術 上有目的地設計一定的反應器和反應條件，利用酶的催化功能，在常溫常壓下催化化 類所需產品或服務于其它目的地一門應用技術。轉換數：酶使底物每分鐘變化的分子數。 催化周期：單位時間內每個酶分子將底物分子轉換成產物的最大值，即每摩爾酶單位時間催化底物轉化為產物的摩爾數。酶活力：也稱為酶活性，是指酶催化某一化學反應的能力。其大小可用在一定條件下，酶催

2、化某一化學反應的速度來表示，酶催化反應速度愈大，酶活力愈高。比活力：指在特定條件下，單位質量的蛋白質或RNA所擁有的酶活力單位數。酶活國際單位 IU: 1961 年國際酶學會議規定：在特定條件 （25°C, 其它為最適條件）下，每 分鐘 內能轉化 1 umol 底物或催化 1 11 mol 產物形成所需要的酶量為 1 個酶活力單位，即為國 際單位IU ) O催量 kat ：每秒鐘轉化 1 摩爾底物（被反應物）所需的酶活力為 1 個 katal ，簡稱 kat 問答題1、酶催化的特點有哪些？>高效性：酶的催化效率比無機催化劑更高, 使得反應速率更快；> 專一性：一種酶只能催

3、化一種或一類底物，如蛋白酶只能催化蛋白質水解成多肽、二肽酶可催化各種氨基酸脫水縮合形成的二肽；>溫和性：是指酶所催化的化學反應一般是在較溫和的條件下進行的.> 活性可調節性：包括抑制劑和激活劑調節、反饋抑制調節、共價修飾調節和變構調節等. > 有些酶的催化性與輔因子有關 .> 易變性：由于大多數酶是蛋白質，因而會被高溫、強酸、強堿等破壞2、影響酶催化作用的因素有哪些？%1 溫度：酶促反應在一定溫度范圍內反應速度隨溫度的升高而加快；但當溫度升高到度時，酶促反應速度不僅不再加快反而隨著溫度的升高而下降。在一定條件下，每一定限 一種酶在某一定溫度時活力最大，這個溫度稱為這種酶

4、的最適溫度%1 酸堿度：每一種酶只能在一定限度的 pH 范圍內才表現活性，超過這個范圍酶就會失 去活 性。%1 酶濃度：在底物足夠，其它條件固定的條件下，反應系統中不含有抑制酶活性的物質及其它不利于酶發揮作用的因素時，酶促反應的速度與酶濃度成正比。%1 底物濃度：在底物濃度較低時，反應速度隨底物濃度增加而加快，反應速度與底物濃度近乎：成正比，在底物濃度較高時，底物濃度增加，反應速度也隨之加快，但不顯著；當底物濃度很大且達到一定限度時，反應速度就達到一個最大值，此時即使再增加底物濃度，反應也幾乎不再改變。抑制劑：能特異性的抑制酶活性，從而抑制酶促反應的物質稱為抑制劑?激活劑：能使酶從無活性到有活

5、性或使酶活性提高的物質稱為酶的激活劑。3、試述米氏方程和米氏常數 Km的意義。米氏方程就是表示在酶促反應中底物濃度與反應速率的關系式V=（ Vmax* S） / （Km+:S）;其中V是反應速率Km即米氏常數Vmax是酶反應最大速率 S是底物濃度； 米氏方程表示一個酶促反應的起始速度（v）與底物濃度（S）關系的速度方程。其意義為：方程反映了反應性質、反應條件、反應速度之間的關系；%1反映了反映速度與底物濃度之間的關系，當S遠大于Km時,反應速度與底物濃度無關 ；%1反映了酶反應速度與酶濃度的關系，當S遠大于Km時,v=k2 :呂為線性關系，酶活正比于酶濃度。4、測定酶活力時終止酶活力的方法有哪

6、些？終止法是在恒溫系統中進行酶促反應，間隔一段時間后，終止酶反應，然后測定反應物的消耗量或產物的生成量，從而計算岀酶的活性。可以加熱變性、強酸、強堿、三氯乙酸、SDS 乙醇等使酶失活或終止反應。催化反應的底物或產物可用化學法、放射性化學法、酶偶聯法等方法進行測定。5、 如何繪制雙倒數曲線 （L-B 作圖法）？一個酶促反應速度的倒數（l/v ）對底物濃度的倒數 （1/ s）的作圖。X和Y軸上的截距 分別代表米氏常數 （Kn）和最大反應速度 （VmaX的倒數1 =仝*丄_|_丄“W/Tt : S 第二章酶的發酵工程一、名詞解釋組成酶：根據酶的合成方式和存在時間，微生物細胞內的酶可分為組成酶和誘導酶

7、，組成酶是細胞內一直存在的酶，它的合成僅受遺傳物質控制即受內因控制。誘導酶：根據酶合成的方式，微生物細胞內的酶可以分為誘導酶和組成酶兩類。誘導酶是在環境中有誘導物（通常是酶的底物）存在的情況下，由誘導物誘導而生成的酶。協同誘導：加入一種誘導劑后微生物能同時或幾乎同時合成幾種酶，它主要存在于較短的代謝途徑中，合成這些酶的基因由同一個操縱子控制。順序誘導：指第一種酶的底物會誘導第一種酶的合成，而第一種酶的產物又可誘導第二種酶的合成，依此類推合成一系列的酶。先后誘導合成分解底物的酶和分解其后各中間代謝產物的酶.終產物阻遏：催化某一特異產物合成的酶，在培養基中有該產物存在的情況下常常是不合成的，即受阻

8、遏的。分解代謝物阻遏：大腸桿菌在含有能分解的兩種底物（如葡萄糖和乳糖）的培養基中生長時，首先分解利用其中的一種底物（葡萄糖），而不分解另一種底物（乳糖），這是因為葡萄糖的分解代謝產物阻遏了分解利用乳糖的有關酶合成的結果，此作用即為分解代謝產物阻遏。葡萄糖效應：由于葡萄糖常對分解利用其他底物的有關酶的合成有阻遏作用，故分解代謝產物阻遏 又稱為葡萄糖效應。二、問答題1、 常見的產酶微生物有哪些？（PQ> 細菌、放線菌、酵母菌和霉菌2、對產酶菌種有哪些要求？（1）酶的產量高（2）容易培養和管理，產酶細胞容易生長繁殖，適應性較強，便于管理3）菌株遺傳性要穩定，不易變異退化，不易感染噬菌體，保證生

9、產的穩定性4）菌株能利用廉價原料，發酵周期短，生產成本低5）發酵產物利于酶產品的分離純化，最好是分泌型的胞外酶6）菌株安全可靠，不是病原菌，不產毒素及其他有害物質，不影響生產人員的身體健康。7）基因工程菌株必須符合安全性要求3、從微生物產酶的上、中、下游階段調控來分析，可通過哪些措施來提高產酶量？（包括優良產酶遏物、添加表面活菌種的選育、設備的選型、發酵方法的選擇、發酵工藝的控制、添加誘導物、解除阻 性劑和產酶促進劑、選擇先進的分離純化設備和技術等） （ PQ改善菌種，選擇優良菌種，產酶能力高使其酶產量提升選擇通風攪拌設備匹配、容量盡可能與產酶菌種匹配的發酵罐 采用連續發酵的方式，連續加入培養

10、物并不斷的提取酶產物防止其次級代謝產物堆積。 添加一些表面活性劑，增加產酶細胞的透過性，打破胞內酶合成的反饋平衡 加誘導物（酶的作底物、酶的反應產物、酶的底物類似物）解除阻遏物（采用難以利用的碳源，或采用分次添加的碳源的方法使培養液中的碳源保持在不至于引起分解代謝物阻遏的濃度；對于末端產物阻遏的酶，可通過控制末端產物的濃度使阻遏解除）添加表面活性劑（非離子型，對酶分子有一定的穩定作用） 添加產酶促進劑（指那些非微生物生長所必需，能提高酶產量但作用機制尚未闡明的物質，可以是酶的激活劑或穩定劑，也可能是產微生物的生長因子，或有害金屬的螯合劑） 選擇先進的分離純化設備和技術4、結合酶生物合成的四種模

11、式，試論述如何提高酶的生物合成量。酶生物合成的模式分為 4 種，即同步合成型、延續合成型、中期合成型和滯后合成型。1）遺傳控制%1誘變育種a. 使誘導型變為組成型：選育組成型突變株b. 使阻遏型變為去阻遏型c. 解除反饋阻遏：選育營養缺陷型突變株、選育結構類似物抗性突變株d. 解除分解代謝物阻遏：選育抗分解代謝阻遏突變株%1 基因工程育種：改變細胞調節基因，使菌種由誘導型變為組成型；增加結構基因的拷貝數，增加細胞專一性酶的生產（2）條件控制%1 添加誘導物酶的作用底物、作用底物的前體、反應產物、酶的底物類似物或底物修飾物%1 降低阻遏物濃度： 產物阻遏：除去終產物；添加阻止產物形成的抑制劑 分

12、解代謝物阻遏：避免使用葡萄糖、避免培養基過于豐富、添加一定量的cAMP 添加表面活性劑：離子型（Tween80）, 對細胞有毒害作用；非離子型（ TritonX-100 ） , 增加細胞通透性 .%1添加產酶促進劑：酶促進劑對不同細胞、不同酶的效果各不相同，需通過試驗選用適當的產酶促進劑并確定最適濃度，其作用機制并未闡明清楚。如添加植酸鈣鎂可使桔青霉素生產磷酸二酯酶的量提高 10-20 倍。5、如果要篩選酸性蛋白酶或酸性淀粉酶高產菌株，請制定初篩和復篩實驗方案（策略）。1 材料和方法1.1 試驗材料111 HA| -甲曲分離及斜面培養基：斜面培養基為 PDA培養基和察氏培養基，分離培養基是在察

13、氏培養基中加入1%的酩蛋白。(1)PDA培 養基;（ 2）查氏培養基：硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀lg、硫酸鎂 （MgSO- 7H ：0）0. 5 s氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0. Olgs庭糖30g、瓊脂20g、蒸憎水1L,加熱溶解，自然 PH,分裝后121匕滅菌20min?培養方法：按要求配制發酎基質，調節初始含水量和pH后，取150步裝于1L三角瓶中，在0.1 MgE力條件下滅菌 30 mi 佰，冷卻接種，接種量為 0.3%, 于不同條件下發酉寺 84h, 干燥后，進行酶活的測定。2 實驗方法2.1 菌種的分離和純化： 采用常規稀釋分離法。2.2 菌株的誘變處理取0.1 ml稀釋的抱子懸液涂布初

14、篩平板，30匕培希h紫外燈預熱30min后，將平HD置于距15W紫外燈 30 cm 處距分別照射 0 s （對照用） ' 4 min 6 min 8min 、 lOmin 、 12min （各 做 2 組。隨后在 暗光條件下，用 5mL無菌生理鹽水對平皿上的菌進行洗脫，適當稀釋后，涂布于分離平皿，以黑布包裏30 乜下避光培養 3-4 天，從長出菌落與其水解圈直徑比的大小 及菌落形態的變化，挑選所需菌種，編號 并保存，同時根據平 nn 菌落數計算致死率，從而求 得成活率。致死率 （） = （ A-B） /AX100式中：A為對照組平HD上的菌落數；B為誘變處理后平皿上的菌落數。2. 3

15、酶活測走方法g 酩氨酸為一個 酶活力單100 余株突變 株。這些菌程度以及水解圈的大酶活定義： lg 酶粉在 401!, pH 值為 3.0 反應條件下， 1 分鐘水解酩素產生沖 位（U/g）。3 結果與分析 3.1 菌株選肓結果為了篩選在固體培養條件下產酶高的菌株，經紫外線誘變處理后，得到株在形態上有一定的差異，依照其菌落的形態、菌落大小、抱子顏色和抱子豐滿小，從中挑選出 20 株先經三角瓶 '液體發酎產酶測定，獲得 10 個高產菌 株再經三角瓶固體發酣培養復 選。其中 z-10 的酶活最高為 9284U/g （干基），比出發菌株（CK） 提高了 11. 1 倍。紫外線誘變的機理是能

16、作用于 n密咗，形成 H密咗二聚體（主要是 TO,影響DNA正常解誰與堿基配對，從而引起基因 突變，提高酶產量。第三章酶的分離工程（不作考核）第四章固定化酶與細胞一、名詞解釋的酶。的空間區生變化，酶活性下降，這種固定化酶：用物理或化學手段定位在限定的空間區域，并使其保持催化活性，可重復利用 固定化細胞：固定化細胞技術是利用物理或化學手段將游離狀態的細胞固定或定位在限定 域，并使其保持固有的催化活性。構象效應：酶在固定化過程中，由于酶與載體相互作用使酶的活性中或變構中心的構象發 從而導致了酶與底物結合能力或酶催化底物轉化的能力降低，導致 效應被稱為構象效應。屏蔽效應：酶經固定化后，載體會成為底物

17、或者其他效應物結合到活性中心或者變構中心的空間障礙，降低了酶與底物或其他效應物結合，從而影響酶的催化活性。微擾效應：由于載體固有的性質使緊鄰固定化酶的區域發生微環境變化，使酶的催化能力及酶對效應物作出調節反應的能力發生改變，這種效應被稱為微擾效應。分配效應：由于載體的親水或者疏水特性以及帶電特征使底物、產物或其他效應物在固定化酶所處微觀環境和宏觀體系間發生不等分配，改變了酶反應系統的組成平衡, 從而影響了反應速度。外擴散限制：底物、產物和其他效應物從宏觀體系穿過包圍在固定化酶周圍近乎停滯的液膜層（又稱為 Nernst 層）到固定化酶表面所受到的限制內擴散限制：底物、產物和其他效應物從固定化顆粒

18、表面進入顆粒內部酶活性位點受到的一種限制。二、問答題1、固定化酶具有什么優點？> 極易將固定化酶與底物、產物分開；產物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝。> 以在較長時間內反復使用，有利于工藝的連續化、管道化。>反應過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化。> 絕大多數情況下提高了酶的穩定性。>較能適應于多酶反應。> 酶的使用效率提高，產物得率提高，產品質量有保障，成本低。2、試述常見固定化酶的方法、原理及其優缺點（可采用表格歸類總結）。物理吸附法離子結合法生物特異性吸附法共價結合法交聯法包埋法原理范德華力氫鍵疏水作用離子效應互補生物分子間的親和作用共價鍵作用發生

19、交聯反應，形成網絡結構的酶固定化方將酶分子截 留在具有特定 網狀結構載體中優點利用此法進行固定 化，酶的活性中 心不 易被破壞，且酶 的高 級結構變化少， 因而 酶活力損失很少操作簡單，處理 條件溫和，酶的 高級結構和活性 中心的氨基酸殘 基不易被破壞， 能得到酶活回收 率高的固定化 酶。采用吸附法固定 酶，其操作簡便、條件溫和，不會 引起酶邊形或失 活，且載體廉價 易得，可反復使 用。共價結合法酶與載 體之間結合緊密， 不易脫落，穩定性 好制備的細胞與載體結合緊密酶包埋在聚合物中 不易漏出；操作條 件溫和、對外界環 境的緩沖作用大， 可防止酶體的機械 損傷，易于再生，產 物分離提取容易缺點但

20、是物理吸附法固 定 的酶與載體相互作用力弱、酶容易從載體上脫落下來。載體和酶的結合 力比較弱，容易 受緩沖液種類或 pH的影響，在離子強度高的條件 下進行反應時，酶往往會從載體 上脫落。固定化費用高制備難反應條件激烈，操 作復雜，控制條件 苛刻，活力損失較 大制備麻煩，活力損 失較大，是交聯反應 的過程往往比較激 烈，因為交聯反應可 能發生在酶分子間， 也可能發生于分子 內，分子間交聯 和分 子內交聯的比例 在一 定程度上和酶的 濃度 與交聯試劑的濃 度有 關，也與 pH、離子 強度有關，如果交聯 條件控制不合適，許不可能再生容易造成酶的泄露失效，酶回收率不高。3、評價固定化酶固定效果的參數有

21、哪些？由于選用的固定化方法不同，固定化酶的活力和性質也有所不同，因此需要對不同的固定化方法進行評價。評價的指標主要有：（1）固定化酶的比活 每克（毫克）干固定化酶所具有的酶活力單位。或：單位面積（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。（2）操作半衰期是衡量穩定性的指標。指在連續使用的條件下，固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間 （tl/2 ）。固定化酶的操作半衰期是影響其實際應用的重要因素。偶聯效率 =（加入的蛋白量一溶液中殘留的蛋白量）/ 加入的總蛋白量 X100%活力回收 =（固定化酶活力 / 投入的總酶活力 ）X100% 相對酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力

22、的比值。酶載量 單位載體所固定的酶活力（或酶蛋白量）。 酶的固定化效率與酶的活力回收率；酶的固定化效率：是指酶與載體結合的百分率。酶活（3）（4）（5）（6）（7） 率：指固化酶的總活力與用于固化酶的總酶活力的百分率。 4、 固定化酶活力降低的可能原因有哪些？（PJ一般來說，固定化酶的活力比游離酶的低。固定酶的活力要低于等摩爾游離酶的活力的原因可（1）力回收酶分子在固定化過程中，由于構象效應造成活性中心或調節中心空間構象發生變化或者 蔽效應造成酶活性中心無法結合底物。有部分活性中心的氨基酸殘基參與了與載體的結合，導之部分酶完全喪失活性。 酶活性未參與反應，但與載體結合后使酶與底物的結合和產物的

23、擴散存在位阻效應。能是：由于屏（2）（3）5、 固定化對酶反應體系產生了哪些影響（效應）？ 為了便于分析，通常在固定化酶體系中作兩個預先的假設：一是酶在載體表面或多孔介質內的 全均勻的；二是整個系統各向同性。在上述條件下，固定化對反應體系造成以下效應。%1%1%1分布是完%1%16、構象效應 屏蔽效應 微擾效應 分配效應 擴散限制效應（外擴散限制和內擴散限制）固定化酶的表觀米氏常數 Km受哪些因素的影響？（ Ps9）固定化可以使酶分子的空間構象發生一定程度的改變，可以影響到酶分子與底物的親和力，造 Km值的變化，由于構象改變引起的Km值變化很難經行預測，其受載體的類型、固定約。 載體的帶電性質

24、可以影響固定化酶的表觀Km值。固定化酶載體的疏水性強弱同樣會影響到底物在酶催化微環境的濃度分配，進而影響固定化酶 值。 酶的表觀Km值還受溶液中離子強度的影響。7、載體的帶電荷性質如何影響固定化酶最適pH的變化？酶固定化后，對底物作用的最適pH和酶活力一 pH曲線常常會發生偏移。帶負電荷的載體酶的最適pH向堿性偏移，帶正電荷的載體固定化的酶的最適pH向酸性偏移。8載體的親疏水性質如何影響固定化酶動力學參數表觀Km值的變化？固定化酶載體的疏水性強弱同樣會影響到底物在酶催化微環境的濃度分配，進而影響固定化酶 值，如果載體的疏水性較強，疏水性底物在酶催化的微環境的分配增加，使固定化酶 對于親水性底物

25、在酶催化的微環境的分配相對減少，造成酶的表觀 于固定化酶，對于疏水性底物的表觀Km值會值增加，對親水性底成酶分子化方法等因素的制的表觀 Km固定化的的表觀 Km的表觀Km值降低,Km值增力匕反之，如果親水性載體用 物的表觀Km值降低。第五章化學酶工程一、 名詞解釋 酶分子改造：通常把改變酶蛋白一級結構的過程稱為改造。 酶分子修飾：通過各種方法可使酶分子結構發生某些變化，從而改變酶的某些特性和功能的技術過程。模擬酶：用合成高分子來模擬酶的結構、特性、作用原理以及酶在生物體內的化學反應過程，從原理的本質定義為是用人工方法合成具有酶性質的一類催化劑。肽酶：是模擬天然酶的活性部位，人工合成的具有催化活

26、性的多肽。抗體酶：又稱催化抗體，是一種新型人工酶制劑，是抗體的高度特異性和酶的高效催化能力巧妙結合的產物，本質上是一類具有催化能力的免疫球蛋白。印跡酶：通過分子印跡技術產生類似于酶的活性部位的空腔，對底物產生有效的結合作用的一類人工模擬酶。二、 問答題1、簡述酶化學修飾的目的。 （PKH ） 酶化學修飾的目的在于：人為地改變某些天然酶的性質，創造某些天然酶所不具備的某些優良 特性甚至 創造出新的特性，概括起來有：（ 1） 提高生物活性。（ 2） 增強酶的穩定性。（ 3） 降低酶類藥物的抗原性。（ 4） 改變酶學性質。2、在酶的化學修飾過程中應考慮哪些因素？（Pm）（ 1） 被修飾酶。開始設計酶

27、化學修飾反應時，對被修飾酶的活性部位、穩定條件、側鏈基團性 質及酶 反應的最適條件等應盡可能全面了解。2）修飾劑的選擇。要求修飾劑具有較大的相對分子質量，對蛋白質的吸附有良好的生物相容性和水溶性，修飾劑表面具有比較多的活性基團。3）修飾反應條件的選擇。修飾反應一般要選擇在酶穩定的條件下進行，盡可能少破壞酶的必 需集團，選擇酶與修飾劑的結合率和酶活回收率都較高的反應條件。對反應條件中酶與修飾 劑的分子比 例、反應溫度、pH、時間、溶劑性質和離子強度等在確定反應條件時也必須考慮。3、簡述酶分子側鏈上的修飾功能基團主要有哪些？ 酶的化學修飾主要是對一些活潑性比較強的氨基酸側鏈基團進行修飾。主要包括：

28、氨基（賴氨酸殘基）、竣基（谷氨酸、天冬氨酸殘基）、輕基（絲氨酸、蘇氨酸殘基）、疏基（半胱氨酸 坐基（組氨酸殘基）、肌基（精氨酸殘基）、酚基（酪氨酸殘基）、口引卩朵基（色氨 蛋氨酸殘基）。簡述常用的酶分子表面化學修飾方法。1）殘基）、咪卩 酸殘基）、甲硫基4、5、Pw） 聚乙二醇對酶的修飾，該類修飾劑是既能溶于水，又可以溶于絕大多數有機溶劑的兩親 在沒有免疫原性和毒性，在體內不殘留。右旋糖酹及右旋糖酹硫酸酯對酶的修飾：漠化氧法；，高碘酸法 糖肽對酶的修飾：糖肽一般是通過纖維蛋白酶或蛋白水解酶降解纖維蛋白或丫一球蛋白 肽結構上有氨基，這些氨基經合適的方法活化后能與酶分子中的氨基發生反應 現對酶的修

29、飾。在酶分子的表面化學修飾中，常用的大分子修飾劑有哪些？分子，且2）3）而得。糖而以共價鍵結合實聚乙二醇、右旋糖酹、糖肽、肝素、血清蛋白6、修飾酶的性質發生了哪些變化？首先要強調的是，我們對酶進行修飾的目的就是要改變酶的結構和特性，而且要使這種改變類有用的方向進行。不管是從理論上分析還是從實際修飾的結果來看，酶經修飾之后，朝著對人性質朝任何方向改變的可能性都存在，而且多數改變都是不利的。酶修飾之后，性質的變化因酶、修飾劑和修飾方法的不同而出現很大的差異。（1）熱穩定性 用前面介紹的一些修飾劑對酶進行修飾，在多數情況下可以提高酶的穩定 性。但PEG沒有明顯的提高。（2）抗原性 抗原性是藥物用酶必

30、須解決的問題。在前面介紹過的修飾劑中，被認為可以消除酶的抗原性的修飾劑只有PEG和人血清白蛋白。（3）對各類失活因子的抵抗力由于酶修飾之后，表面會帶上修飾劑而受到保護，因此，酶修飾之后，抵抗蛋白酶水解和其它失活因子的能力普遍增強。（4）在生物體內的半衰期由于修飾之后，穩定性和對抗各種失活因子的能力增強，因此， 半衰期也普遍延長。(5) 修飾酶的最適 pH(6) 修飾酶的動力學性質7、抗體酶具有什么特點？%1 能催化一些天然酶不能催化的反應抗體酶的多樣性決定了抗體酶的催化反應類型多樣性； 催化抗體 的構建，表明可通過免疫學技術，為人工酶的設計和制備開辟一條新的、實用化的途 徑。這種利用抗原 -

31、抗體識別功能，把催化活性引入免疫球蛋白結合位點的技術，或許可能發展 成為構建某種具有定向特異 性和催化活性的生物催化劑的一般方法。%1 有更強的專一性和穩定性抗體酶作為一種具酶和抗體雙重功能的新型大分子用作分子識 別元件，具 有優于酶和抗體的突出特點。因為配體底物與抗體酶的活性部位結合后，會立即發 生催化反應，釋放產 物，所以每一次分子反應之后，抗體的分子識別位點都可以再生，這就使 催化抗體能夠作為一種可以連 續反復使用的可逆性分子。%1化作用機制不同酶催化機制是 "鎖鑰學說 " (Lock and Key) 及"誘導契合學說 " (Induced-Fi

32、t) ；而抗體酶 的催化劑至目前 還沒有完全搞清楚。 Janda 曾提出“識別開關”或“誘餌開關” (Bait and Switch) 機制，即抗體將底 物“釣進”抗體結合部位，然后使其與抗體結合，打開底物轉化為反應過渡 態的“開關”，導致共價鍵 斷裂，形成產物，還有待研究。8、試述采用誘導法制備抗體酶的一般步驟。 首先合成穩定反應的過渡態類似物，將此化合物作為半抗原與載體蛋白相連，然后免疫動物制 備單克隆 抗體，由它誘導產生的單克隆抗體可以按預定的方向獲得催化活性。9、簡述分子印跡聚合物的制備方法。 所謂分子印跡是制備對某一化合物具有選擇性的聚合物的過程。這個化合物叫印跡分子或叫模 板分子。

33、 印跡技術包括下列內容：%1 選定印跡分子和功能單體，使兩者發生互補反應。%1 與印跡分子發生互補作用的單體與其它單體共同發生聚合反應。%1 將印跡分子從聚合物中去除。這樣形成的聚合物內就保留有和印跡分子的形狀、大小完全 一樣的 空穴，印跡的聚合物能維持相對于印跡分子的互補性，因此，該聚合物能以高選擇性重 新結合印跡分 子。分子印跡也叫主 - 客體聚合作用或模板聚合聚合作用，制得的分子聚合物稱為 分子印跡聚合物。10、簡述生物印跡酶的基本制備過程。 (P” 。) 將酶溶解于含有其配體的緩沖溶液中，使其構象發生改變，有利于與底物結合，再將此酶液冷 凍干燥形 成酶粉，用有機溶劑沖洗干酶粉除去配體后

34、，將其過濾并真空干燥，在無水或微水有 機溶劑中，由于酶 的記憶功能，這種新構象仍能保持，致使結合配體的能力大大提高。第六章生物酶工程一、 名詞解釋定點突變：在基因的特定位點引入突變，即通過添加、插入或刪除已知的 DNA 序列中特定的 核昔酸 序列。酶分子定向進化：人為的控制進化條件，模擬天然進化機制來達到體外對酶基因的改造，產 生基因多 樣性，并通過定向篩選技術獲取定向選擇獲取特定性質的酶。易錯PCR是一種迅速、簡便的在DNA序列中進行隨機突變的方法，主要特點是能夠控制它的突變頻率。連續易錯PCR將一輪PCR擴增得到的有用突變基因作為下一輪的模板進行PCR擴增，連續反復進行隨機誘變使每一輪獲得

35、的小突變可以積累大部分的有益突變。DNA改組：用 Dn ase 1或者用超聲波進行隨機切割產生隨機大小片段，再從正突變基因庫中分離岀來所需DNA片段，得到的片段在不加引物的多次PCR循環中，彼此之間互為模板和引物進行擴增,直到連接成為接近目的片段長度的DNA分子，然后再利用基因兩端序列為引物擴增獲得全長基因,這是來自不同基因之間的重組。復合酶：復合酶是一種混合物，由多只能跟沒組成，用來完成一系列的催化反應。由2 種或2 種以上單一酶制劑混合而成融合酶：指將兩個或兩個以上的酶分子組合在一起形成的融合蛋白 二、 問答題信息，這改造，這就是酶分構與功能等信息，直接通過1、如何理解酶分子改造的理性設計

36、和非理性設計？ 在研究天然酶及其突變體時，通常先獲得酶分子特征、空間結構以及結構與功能的關系等方面 些用各種生物化學、光譜學、晶體學等方法來解決，然后根據這些信息進行酶分子的 子的理性設計，它包括化學修飾、定點突變等，而不需要準確知道酶蛋白結隨機突變、篩選等方法進行酶分子的改造，稱為酶分子的非理性設計，如定向進化、雜合進化。1, 簡述酶分子定向進化的一般步驟。酶定向進化通常分 3 步進行：首先通過隨機突變或基因體外重組創造基因多樣性；然后導入適當載體后構建突變文庫；最后通過靈敏的篩選方法，選擇陽性突變子。這個過程可重復循環，直至得到預期性狀的酶。3、 酶分子定向進化的基本方法有哪些？ %1 易

37、錯 PCR 可以用 曲+來替代Mg",使PCR寸發生突變。%1 DNA 重組（改組）（DNA shuffli ng ）重組可以在同一基因的不同突變體之間進行，也可以在不同物種的同源基因間進行。因此，DNA重組就是把不同來源的同源基因斷裂成不同大小的片段，然后對這些片段進行重新組合。%1外顯子改組；與DNA改組相似，都是在各自含突變的片段進行交換。%1 隨機引物體外重組%1 交錯延伸法%1 臨時模板隨機嵌合法4、 易錯PCR勺技術目的和策略有哪些？（調整dNTP濃度、增加 Mg"濃度、添加 Mn*等）易錯PCR是一種迅速、簡便的在 DNA序列中進行隨機突變的方法，主要特點是能

38、夠控制它的突變頻率。用PCR擴增目的基因時，通過使用低保真度的Taq DNA聚合酶或改變 PCR常規的 反應條件，如調整dNTP濃度、增加 Mg2+濃度、添加 Mn2+等，引起堿基以某一頻率進行隨機錯配而引入多點突變，構建突變體庫，然后選擇或篩選出所需的突變體。目的：將一輪 PCFRT增得到的有用突變基因作為下一輪的模板進行PCRT增，連續反復進 行隨機誘變，結果使每一輪獲得的小突變可以積累大部分的有益突變。5、簡述DNA改組技術的基本原理和操作。DNA改組技術又稱 DNA1排技術或有性 PCR指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進行有性重組。通過用 DNase 1 或者用超聲波進行隨機

39、切割產生隨機大小片段，再從正突變基因庫中分離出來所需DNA片段，得到的片段在不加引物的多次PCFF1環中，彼此之間互為模板和引物進行擴增，直到連接成為接近目的片段長度的DNA分子，然后再利用基因兩端序列為引物擴增獲得全長基因，這是來自不同基因之間的重組。6、簡述交錯延伸PCR技術的原理和特點。這是一種簡化的 DNA改組法，它在 PCR反應中，將含不同點突變的模板混合，隨之進行多輪變性、短暫的復性 / 延伸，反復重復直到形成全長基因片段。它的主要特點在于能將 PCR反應中的常規的退火和延伸合二為一，大大縮短反應時間，結果得到非常短的新生鏈，又將經過變性的新生鏈作為引物與體系內同時存在的不同模板退

40、火，繼續延伸。由此生第七章非水相酶催成的新生DNA分子中含有大量的突變組合，有利于酶的新性質的產生。化一、 名詞解釋最適水含量：在特定的有機介質反應體系中，催化速度達到最大時的含水量。水活度Aw在一定的溫度與壓力下，反應體系中水的蒸汽壓與同樣狀態下純水蒸汽壓的比值。疏水參數lgP : lgP是某有機溶劑在正辛醇 /水體系中分配系數 P的對數，lgP可以定量描述溶劑 的極性，可作為有機溶劑的選擇標準。pH記憶：有機溶劑中酶能夠保持其冷凍干燥或沉淀前所在緩沖液中的pH.分子印跡：由競爭抑制劑導致在酶構象改變在除去抑制劑后在低水條件下仍能保持。這種酶分子記憶原來在水相中的一些特性的現象稱為分子印記。

41、酶的區域選擇性：在酶促反應中，底物某一位置上的基團被被酶選擇性的轉化，而另一位置上的相同基團沒有被轉化。溶劑工程：有機介質條件下，酶所處溶劑系統的改變會改變酶的催化活性。這種通過改變反應介質，實現酶催化性質改變的技術稱為溶劑工程。二、 問答題1、酶催化反應的介質有哪些？（一）水介質（二）非 水介質%1 有機介質反應體系 %1 超臨界流體反應體系%1 氣相介質反應體系 %1 離子液介質反應體系2、非水介質中酶催化反應的特點。（1）在非水系統內，絕大多數有機化合物溶解度高，尤其是能提高非極性底物的溶解度。（2）非水介質的參與可以改變反應平衡，使酶可以催化在水中不能進行的反應。（3）能抑制依賴于水的

42、某些不利反應和副產物。（4）從有機溶劑中分離純化產物比從水中容易，從低沸點的溶劑中可以更容易地分離純化產物。（5）酶在非水體系中的熱穩定性和儲存穩定性增加，而且可以有效減少反應過程中的微生物污染。（6）可以控制底物的特異性，區域選擇性和立體選擇性。（7）在很多情況下，可以實現游離酶的回收與再利用。（8）有機溶劑的凝固點一般遠低于水，使一些對溫度非常敏感的酶在適宜的溫度下進行催化反應。3、簡述酶促反應的有機介質體系種類。根據酶和水的分布特性可以將有機介質反應體系分為以下幾種類型：%1 酶在與水共融的有機介質體系中催化反應；%1 酶在有機介質和水組成的兩項體系中催化反應；%1 酶在近乎無水的有機溶

43、劑中催化反應，包括非極性有機溶劑- 酶懸浮體系和非極性有機溶劑-PEG修飾酶單相體系%1 酶在反膠束體系中催化反應4、 水對有機介質中酶催化反應的影響有哪些？（ 酶的空間構象、反應速率、平衡及立體選擇性 ） 有機介質 中水的含量與酶的空間構象、反應速率、平衡及立體選擇性等都有直接關系。(1) 水對酶分子空間構象的影響 (2) 水對有機介質酶促反應速率的影響 (3) 水對酶催化反應 平衡及立體選擇性的影響 (4) 有機介質反應體系中水含量的調控5、有機溶劑對有機介質中酶催化反應的影響有哪些？( 影響的三個方面及其對酶活性、效應物分配、溶劑結構的影響 )有機溶劑主要通過三個方面來影響酶促反應。首先

44、有機溶劑與酶分子直接發生作用，通過 干擾氫鍵 和疏水鍵等改變酶的構象，從而導致酶的活性受到抑制或者失活；其次有機溶劑直接 與酶分子周圍的水 相互作用，造成酶分子必須水的變化和重新分布；再次是有機溶劑影響到底 物和產物的分配與擴散，影 響反應的進行。6、有機介質體系中酶活性顯著降低的原因是什么？(1) 傳質障礙是造成酶活性下降的主要原因之一(2) 有機溶劑可以增加酶促反應的活化能，導致酶活性的下降(3) 有機介質中酶分子活性中心剛性的增加，也是造成酶活性下降的主要原因7、簡述有機介質中酶的穩定性發生了哪些變化？ 有機介質中酶分子的剛性增加，同時有機溶劑的引入使一些與水相關的酶蛋白不穩定因 素大大 降低，使得酶分子在有機介質中的熱穩定性、儲存穩定性以及對變性劑的耐受性顯著 提咼。8、試述有機介質中酶的熱穩定性提高的原因。 在惰性有機溶劑中許多酶的熱穩定性顯著增加，酶的熱穩定性與溶劑的含水量密切相關，一