1、實(shí)驗(yàn)日期：2017.10.25 實(shí)驗(yàn)班級：生物技術(shù) 指導(dǎo)教師：張建麗 姓名：高熹 學(xué)號：1120152430環(huán)境中微生物的分離和純化 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?）了解培養(yǎng)基的制備原則和制備程序，熟悉常用培養(yǎng)基的名稱2）掌握微生物的分離、接種技術(shù)3）了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍，掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法 2 實(shí)驗(yàn)原理2.1 顯微鏡及油鏡2.1.1 顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡是由一組光學(xué)系統(tǒng)和支持及調(diào)節(jié)光學(xué)系統(tǒng)的機(jī)械系統(tǒng)組成。機(jī)械系統(tǒng)包括鏡座、鏡臂、鏡臺、物鏡轉(zhuǎn)換器、鏡筒及調(diào)節(jié)器等。鏡座是顯微鏡的基座，使顯微鏡能平穩(wěn)地放置在桌子上；鏡臺又稱載物臺，是放置標(biāo)本的地方，鏡臺上有壓片夾用以固定被檢標(biāo)本，標(biāo)本移動

2、器可使標(biāo)本前后和左右移動，有的標(biāo)本移動器帶有游標(biāo)尺，可指明標(biāo)本所在位置；鏡臂用以支持鏡筒，也是移動顯微鏡時(shí)手握的部位；鏡筒是連接目鏡和物鏡的金屬筒，鏡筒上端插入目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相接；物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在鏡筒的下端，其上裝有35個(gè)不同放大倍數(shù)的物鏡，可以通過轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器隨意選用合適的物鏡；調(diào)節(jié)器安裝在鏡臂基部，是調(diào)節(jié)物鏡與被檢標(biāo)本距離的裝置，通過調(diào)節(jié)粗、細(xì)螺旋便可清晰地觀察到標(biāo)本。光學(xué)系統(tǒng)主要包括目鏡、物鏡、聚光鏡和反光鏡等，較好的顯微鏡有內(nèi)光源。目鏡一般由兩塊透鏡組成，不同的目鏡上刻有5×、10×和15×等字符以表示該目鏡的放大倍數(shù)；物鏡是顯微鏡中很重要的光學(xué)

3、部件，由多塊透鏡組成，根據(jù)物鏡的放大倍數(shù)和使用方法的不同，分為低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡等。被檢物體經(jīng)顯微鏡的目鏡和物鏡放大后的總放大倍數(shù)是物鏡的放大倍數(shù)和目鏡放大倍數(shù)的乘積。 2.1.2 油鏡油鏡是實(shí)驗(yàn)室常用的顯微鏡之一，清晰度略高于普通光學(xué)顯微鏡，用于觀察衣原體，細(xì)菌，細(xì)胞器等較細(xì)微的結(jié)構(gòu)。使用油鏡時(shí)，需在玻片上滴加香柏油。這是因?yàn)橛顽R的放大倍數(shù)較高，而透鏡很小，光線通過不同密度的介質(zhì)物體（玻片空氣透鏡）時(shí)，部分光線會發(fā)生折射而散失，進(jìn)入鏡筒的光線少，視野較暗，物體觀察不清。如在透鏡與玻片之間滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），則使進(jìn)入油鏡的光線增多，視野亮度增強(qiáng)

4、，物象清晰。2.2 微生物形態(tài)的觀察2.2.1 個(gè)體形態(tài)鏡檢細(xì)胞形狀、大小、排列，革蘭氏染色反應(yīng)，運(yùn)動性，鞭毛位置、數(shù)目，芽孢有無、形狀和部位，莢膜，細(xì)胞內(nèi)含物；放線菌和真菌的菌絲結(jié)構(gòu)，孢子絲、孢子囊或孢子穗的形狀和結(jié)構(gòu)，孢子的形狀、大小、顏色及表面特征等。2.2.2 菌落特征在固體培養(yǎng)基平板上觀察菌落生長的性狀（形狀、光澤、透明度、顏色、質(zhì)地等）。2.3 革蘭氏染色革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，這種染色法是由一位丹麥醫(yī)生Hans Christian Gram于1884年所發(fā)明，最初是用來鑒別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關(guān)系。未經(jīng)染色之細(xì)菌，由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小，

5、故在顯微鏡下極難觀察陽性紫色陰性紅色陽性紫色陰性紅色。染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，而用以分類鑒定。通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍

6、呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。2.4 無菌操作用于防止微生物進(jìn)入人體組織或其它無菌范圍的操作技術(shù)稱為無菌操作。如外科手術(shù)需防止細(xì)菌進(jìn)入傷口。在各種生物實(shí)驗(yàn)中,為了防止微生物地生長和繁殖影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,也要在無菌的環(huán)境下進(jìn)行。3 實(shí)驗(yàn)儀器及材料3.1 實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺，顯微鏡。3.2 實(shí)驗(yàn)材料細(xì)菌裝片，擦鏡紙，香柏油，擦鏡液，菌液，結(jié)晶紫染液，盧戈氏碘液，95%乙醇，蕃紅染液。4 實(shí)驗(yàn)步驟4.1 使用油鏡觀察細(xì)菌裝片（1）將光線調(diào)至最強(qiáng)程度（聚光器提高，光圈全部開放）。（2）轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使鏡筒上升，滴香柏油1小滴（不要過多，不要涂開）于接物鏡正下方標(biāo)本上。（3）轉(zhuǎn)動接

7、物鏡轉(zhuǎn)換盤，使油鏡頭于鏡筒下方。（4）俯身鏡旁側(cè)面在肉眼的觀察下，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使油鏡頭徐徐下降浸入香柏油內(nèi)，輕輕接觸玻片為止。（5）慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使油鏡頭徐徐上升至見到標(biāo)本的物象為止。（6）轉(zhuǎn)動微調(diào)節(jié)器，使視野物象達(dá)到最清晰的程度。（7）左手徐徐移動推進(jìn)器，并轉(zhuǎn)動微調(diào)節(jié)器以觀察標(biāo)本。（8）標(biāo)本觀察完畢后，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器將鏡筒升起，取下標(biāo)本玻片。立即用擦鏡紙將鏡頭上的香柏油擦凈。4.2 革蘭氏染色（1）左手持菌液試管,右手持接種環(huán)在火焰中灼燒,冷卻后從試管中取菌液一滴,在潔凈載玻片上做一涂膜。（2）在空氣中自然干燥。（3）用鑷子夾住涂片一端,在火焰上連續(xù)通過三次，以載玻片在手背上試感覺不燙為宜

8、。（4）滴加數(shù)滴結(jié)晶紫染液于細(xì)菌涂片上，染色1分鐘，水洗。（5）用盧戈氏碘液覆蓋涂片1分鐘，水洗。（6）滴加95%的乙醇，輕輕搖動玻片進(jìn)行脫色，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，水洗。（7）滴加蕃紅染液復(fù)染2分鐘以上，水洗，吸干鏡檢。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1 細(xì)菌裝片的觀察（1）金黃葡萄球菌：呈球形或近似球形，個(gè)體微小。（2）四聯(lián)球菌：以四個(gè)球菌排呈方形。（3）枯草芽孢桿菌：桿狀，單個(gè)或鏈狀排列，有的細(xì)胞中間可見橢圓形芽孢。（4）螺菌：弧形，兩頭染色深，中間稍淺，將孔徑光闌稍調(diào)小可見很細(xì)微的鞭毛。（5）大腸桿菌：桿狀。（6）破傷風(fēng)梭菌：有的細(xì)胞沒有芽孢，呈梭形染色較淺半透明。有芽孢的細(xì)胞呈蝌蚪狀，芽孢很大位于菌體頂端，芽孢邊緣染色深，中間稍淺。（7）固氮菌：菌體呈圓形，周圍有無固定形態(tài)的莢膜。5.2 革蘭氏染色觀察大腸桿菌在革蘭氏染色后呈紅色，故為革蘭氏陰性菌，而金黃色葡萄球菌在革蘭氏染色后呈紫色，故為革蘭氏陽性菌。5.3 菌落觀察分別觀察了平板劃線