1、熱休克反應對內毒素誘導的IP-10基因表達的影響 作者：梁秋娟，張華莉，涂自智【摘要】 目的 探討在RAW264.7巨噬細胞中熱休克反應(HSR)對大腸桿菌內毒素(脂多糖，LPS)誘導的干擾素誘導蛋白10(IP-10)表達的影響。方法 RAW264.7巨噬細胞分別給予不同劑量及不同反應時間的LPS處理，并行HSR后抽提總RNA進行RT-PCR實驗。結果 LPS可促進RAW264.7巨噬細胞中IP-10基因的轉錄，具有劑量依賴性;用濃度為600g/L的LPS刺激2h并行HSR時，IP-10的mRNA表達量最大。結論 HSR能促進LPS誘導的IP-10基因mRNA表達水平。 【關鍵詞】 熱休克反應

2、;內毒素類;干擾素誘導蛋白10Abstract: Objective To explore the effects of heat shock response (HSR) on RAW264.7 macrophages interferon induced protein 10 (IP-10) expression induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods RAW 264.7 Macrophage cells were exposed to LPS with different doses and for different reaction

3、time, and part of cells were treated with heat shock. Then total RNA were extracted respectively. The expression of IP-10 were detected by RT-PCR. Results LPS could enhance the transcrition of IP-10 in RAW264.7 macrophages, which showed dose reliability. When RAW264.7 macrophages were treated with L

4、PS at concentration of 600g/L and heat shock for 2h, IP-10 mRNA reached to a peak level. Conclusion HSR can promote the level of IP-10 mRNA induced by LPS.Key words: heat shock response; endotoxins; interferon induced protein-10熱休克反應(heat shock response，HSR)是生物細胞在高溫、毒物、自由基及感染等應激原作用下以基因表達變化為特征的一種防御適應

5、反應。作為機體重要的內源性防御機制，HRS通過激活熱休克因子1(heat shock factor 1, HSF1)后直接或間接調控某些炎癥介質、細胞因子的表達，如TNF-、IL-6、IL-1等。在以前的實驗中1，我們用野生型和HSF1基因敲除小鼠復制內毒素血癥動物模型，并進行HSR。小鼠自身免疫與炎癥疾病相關基因微陣列結果顯示，有多種炎癥相關基因在兩種小鼠中有差異性表達，其中包括干擾素誘導蛋白10(interferon-inducible protein 10，IP-10)，提示IP-10的表達可能受到HSR、HSF1的影響。在本實驗中，我們主要從細胞水平探討經LPS誘導表達的IP-10是否

6、受到HSR的影響。如果能發現IP-10與HSR之間的關系，并進一步找到其調節機制將可能為全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)的機制研究及防治提供理論依據。1 材料與方法1.1 材料 RAW264.7巨噬細胞株，購自上海細胞中心;細胞培養箱由美國SHELL LAB生產;新生小牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司;RPMI-1640 培養基購自Gibco公司;大腸桿菌內毒素(O111B4，脂多糖，LPS)購自Sigma公司;Trizol試劑購自美國GIBCO公司;Taq DNA Polymerase、AMV逆轉錄酶(Tak

7、ara)購自寶生物工程(大連)有限公司; PCR儀由英國Techgene生產;PCR引物甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)和待測基因IP-10由上海博亞生物公司合成，見表1。表1 用于RT-PCR的引物1.2 方法1.2.1 LPS刺激細胞 將細胞按1×106/瓶的密度接種在25cm2培養瓶中，用5ml含10% 小牛血清的RPMI 1640培養。24h后給予LPS刺激并置于37 5%CO2培養箱中，在指定的時間收集標本。1.2.2 熱休克處理 將細胞培養瓶口封閉好，置于溫度為42的恒溫水浴箱內1h，

8、收集標本。(LPS加熱休克處理組，于LPS處理的最后1h進行熱休克)。1.2.3 總RNA的提取 用Trizol試劑抽提細胞的總RNA，并用DNA 酶1消化除去總RNA中的痕量DNA;1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA。紫外分光光度計測量A(260nm/280nm)比值測定RNA的濃度。1.2.4 逆轉錄聚合酶鏈反應 用鳥類成髓細胞瘤病毒(AMV)逆轉錄酶合成第一鏈，反應條件如下：42反應1h，98變性5min;用1l的逆轉錄產物作為模板，進行PCR擴增：IP-10: 95變性45s，57退火30s，72延伸1min，擴增27個循環;GAPDH：95變性30s，57退火30s，72延伸30s，

9、擴增23個循環;以GAPDH作為內對照，PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.3 統計學處理 用Bandleader軟件對IP-10基因及GAPDH凝膠電泳條帶進行灰度掃描，計算IP-10與GAPDH條帶的灰度比值，數據以(±s)表示。采用SPSS 11.0軟件進行統計學分析，兩組間比較用t檢驗。2 結果2.1 HSR對不同劑量LPS誘導的IP-10 mRNA表達的影響 檢測表明，正常對照組細胞中，IP-10 mRNA表達量很低，單純熱休克處理可增加該基因的表達(lane.2)。用不同濃度LPS(400、600、800、1000g/L)處理RAW264.7巨噬細胞2h，可發現I

10、P-10的表達呈劑量依賴性(lane.3、5、7、9)，其中LPS處理劑量為600、800、1000g/L時，與正常對照組比較差異有顯著性(P<0.05)。在LPS處理后1h同時進行熱休克處理(42，1h)，與相應濃度單純LPS處理組比較，熱休克可以促進IP-10的mRNA水平，其中LPS劑量為0、400、600g/L時，熱休克組的促進作用差異有顯著性(P<0.05)，見圖1。2.2 HSR對LPS誘導的IP-10 mRNA表達的時效影響 與正常對照組比較LPS(600g/L)處理2h，巨噬細胞中IP-10表達明顯增多(lane.3，P<0.05)，4

11、h時表達有所下降。單純做熱休克(lane.6)及用LPS處理后做熱休克(lane.2，4)都能促進IP-10 mRNA的表達，且差異有顯著性(P<0.05)，見圖2。3 討論IP-10是一種早期炎癥細胞因子，屬于CXC類趨化因子家族的成員，由IFN-、LPS等誘導產生，在單核細胞、T細胞、內皮細胞等多種細胞中都有表達，在炎癥過程中參與調節細胞募集和活化2,3。在本實驗中我們發現：在正常RAW264.7細胞中，單純HSR或LPS處理后進行HSR都能促進IP-10的表達;用不同濃度的LPS進行處理時有一定的劑量依賴性，LPS處理濃度為600g/L時，HSR后能明顯促進該基因的表達;以

12、600g/L的LPS處理細胞不同時間點發現：LPS處理2h，IP-10 mRNA增多，同時還發現熱休克能明顯促進該時間點IP-10的表達，而到了4h，IP-10的表達已有所下降，但熱休克仍能促進該基因mRNA水平。以上實驗結果提示：IP-10確實是早期炎癥基因，HSR能促進早期炎癥因子IP-10的轉錄。HSR長期以來都被公認在SIRS中發揮內源性保護作用。例如：整體動物經亞致死性HSR后，可降低LPS感染后動物的死亡率，減輕內毒素所致的心、肺、肝、腸等組織器官的損傷，并降低微血管通透性4,5;大鼠內毒素血癥發生后再誘導HSR，同樣具有保護作用6。這些實驗結果提示：HSR對炎癥所致的損傷有保護作

13、用，發揮抗炎作用。但是在我們的研究中，作為起內源性保護作用的HSR卻能促進IP-10這一早期促炎因子的表達，這是否與HSR的抗炎作用相矛盾呢作為統一的整體，機體內環境處在平衡與失平衡的矛盾運動中，機體內在的調控網絡非常復雜，這也正是SIRS經長期研究后仍存在很多尚未解決的問題的原因所在。以往的研究也發現，HSR并不總是發揮抗炎作用，也能促進一些促炎因子的表達。例如Marcella等7發現，HSR促進LPS誘導的TNF-的表達;Wan等8發現，一種熱休克蛋白熱休克蛋白70類似蛋白1(heat shock protein 70 like protein 1， HSP70L1)，能促進IP-10的分

14、泌。因此在本研究中發現的HSR能促進早期炎癥因子IP-10的表達并不與HSR的內源性保護作用相違背。雖然，我們尚不能解釋HSR促進IP-10表達的原因和機制，但是本研究提示HSR在SIRS中不僅能發揮抗炎作用，也可能通過調控IP-10等炎癥相關基因的表達發揮了一定程度的促炎作用，以維持體內的抗炎和促炎反應的平衡，當然這其中的機制仍有待于更深入的研究。此外，即使我們已初步證明HSR能促進IP-10的表達，但是HSR通過什么方式來調控IP-10的表達其調控的機制如何這些問題仍需進一步研究。【參考文獻】 1 于鳳秀，張華莉，陳廣文，等.HSF1調控的炎癥相關基因的篩選及SOCS3基因的實驗驗證J.中

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