1、.喹啉、異喹啉類生物堿發(fā)光探針與ctDNA相互作用的研究【摘要】：第一章:簡(jiǎn)述了DNA的組成及結(jié)構(gòu)特征;小分子與DNA相互作用的主要模式及影響因素;生物堿的結(jié)構(gòu)與性質(zhì);以光譜法為主,對(duì)應(yīng)用于生物堿等小分子與DNA相互作用領(lǐng)域的各種分析技術(shù)的研究理論及現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。第二章:在不同極性和不同酸度介質(zhì)中考察了巴馬汀的熒光光譜和紫外光譜特性。隨著溶劑極性的增加,巴馬汀的溶解性增大,吸收峰強(qiáng)度明顯增大且紅移。巴馬汀的熒光發(fā)射光譜受溶劑極性的影響也很顯著。隨著溶劑極性的降低,熒光發(fā)射光譜的第二個(gè)發(fā)射帶紫移并且熒光強(qiáng)度顯著提高,而第一個(gè)發(fā)射帶幾乎不受影響。由于本身熒光較弱,pH對(duì)巴馬汀溶液的吸收和熒光光譜

2、影響都較小。量子產(chǎn)率在二氯甲烷和乙腈溶劑中達(dá)到最大。結(jié)果表明,巴馬汀對(duì)周圍介質(zhì)環(huán)境的敏感程度較高。第三章:以鹽酸巴馬汀作為探針,采用紫外吸收光譜、熒光光譜方法為主要手段,結(jié)合電化學(xué)方法系統(tǒng)地研究了溶液中巴馬汀與小牛胸腺DNA的相互作用,探討了作用方式和作用機(jī)理。化合物與目標(biāo)靶分子結(jié)合后,熒光發(fā)射強(qiáng)度、吸光度和熒光偏振等光譜參數(shù)產(chǎn)生了變化。巴馬汀本身熒光很弱,但有DNA存在時(shí),熒光被顯著增強(qiáng)。雖然吸收光譜表明巴馬汀與ctDNA之間符合嵌插模式,但熒光偏振、陰離子猝滅實(shí)驗(yàn)卻更符合溝槽鍵合。研究表明,巴馬汀與ctDNA相互作用的模式為混合模式,即嵌插、溝槽和靜電三種作用方式都不同程度存在,其中溝槽鍵

3、合是主要作用方式。巴馬汀的異喹啉端可能插入到DNA雙螺旋的堿基對(duì)中,分子的另一部分伸出溝槽外。利用熒光滴定數(shù)據(jù),計(jì)算巴馬汀與ctDNA的結(jié)合常數(shù)為2.52(±0.15)×104L/mol,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為0.16。第四章:以固體基質(zhì)發(fā)光光譜法,研究了鹽酸巴馬汀的光譜性質(zhì),詳細(xì)考察了實(shí)驗(yàn)條件對(duì)鹽酸巴馬汀固體基質(zhì)室溫?zé)晒?PS-RTF)和磷光光譜(PS-RTP)的影響。實(shí)驗(yàn)表明,以未經(jīng)任何預(yù)處理的慢速定量濾紙做基質(zhì),巴馬汀能直接產(chǎn)生強(qiáng)的RTF而不產(chǎn)生磷光;以TIAc做重原子微擾劑,巴馬汀則可發(fā)射出強(qiáng)的室溫磷光,最大激發(fā)波長(zhǎng)為350nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為522nm、615nm。當(dāng)重原子

4、濃度高于2mol/L、pH值在6-7時(shí),巴馬汀的PS-RTP信號(hào)最強(qiáng)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下提出了巴馬汀的PS-RTP測(cè)定法。在此基礎(chǔ)上,利用PS-RTP和PS-RTF光譜法,詳細(xì)研究了巴馬汀與ctDNA的非共價(jià)復(fù)合作用,探討了它們之間的作用機(jī)理和作用模式,進(jìn)一步確定巴馬汀與DNA之間的作用方式為混合模式。第五章:以固體基質(zhì)發(fā)光光譜法,研究了鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿的光譜性質(zhì),詳細(xì)考察了實(shí)驗(yàn)條件對(duì)它們PS-RTF、PS-RTP的影響。小檗堿和藥根堿能直接在慢速定量濾紙上產(chǎn)生強(qiáng)的室溫?zé)晒狻INO_3做重原子微擾劑,小檗堿可發(fā)射強(qiáng)的磷光,其最大激發(fā)波長(zhǎng)_(ex)為353nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)em為520nm

5、、619nm。而藥根堿未觀察到磷光發(fā)射。在此基礎(chǔ)上,利用固體基質(zhì)室溫發(fā)光光譜,結(jié)合流體中吸收光譜和熒光光譜法,詳細(xì)研究了小檗堿和藥根堿與ctDNA的非共價(jià)復(fù)合作用,求出了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn),并考察了DNA對(duì)小檗堿和藥根堿的熒光及磷光偏振的影響,探討了它們之間的作用方式和作用機(jī)理。結(jié)果表明,兩種生物堿與DNA的作用方式均為嵌插模式;結(jié)合常數(shù)分別為1.84(±0.12)×104L/mol和0.95(±0.08)×104L/mol,與DNA的作用大小為小檗堿藥根堿。第六章:采用紫外光譜、熒光光譜、熒光偏振,熱變性等手段,對(duì)白屈菜紅堿和血根堿與ctDNA的鍵合作

6、用、作用方式進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn),在pH=5.40時(shí),白屈菜紅堿和血根堿以離子形式存在,DNA的加入可使白屈菜紅堿和血根堿的熒光強(qiáng)度顯著發(fā)生變化。紫外光譜出現(xiàn)明顯的減色和紅移現(xiàn)象,證明兩者與DNA的相互作用方式是嵌插方式。熒光偏振和DNA變性實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)白屈菜紅堿和血根堿是通過嵌插方式與ctDNA相互作用的,即兩種生物堿分子可以插入到DNA雙螺旋中。在一定離子強(qiáng)度下,該嵌插作用會(huì)減弱。熒光滴定實(shí)驗(yàn)測(cè)得白屈菜紅堿和血根堿與DNA的本征鍵合常數(shù)分別為2.98(±0.10)×105L/mol和8.86(±0.18)×105L/mol,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別約為0.21

7、0和0.18。此外,循環(huán)伏安曲線表明,兩種化合物與DNA之間還存在著非特異性的靜電作用。第七章:采用熒光光譜法和吸收光譜法,在接近人體生理?xiàng)l件的Tris-HCl緩沖溶液中研究了鹽酸嗎啡與ctDNA的相互作用。考察了濃度、酸度和溫度等因素對(duì)鹽酸嗎啡與ctDNA的相互作用的影響,探討了相互作用方式和作用機(jī)理。離子強(qiáng)度影響、陰離子猝滅劑(亞鐵氰化鉀)、熒光偏振實(shí)驗(yàn)及DNA變性實(shí)驗(yàn)均表明,鹽酸嗎啡與DNA的相互作用屬嵌插模式,DNA對(duì)鹽酸嗎啡的猝滅機(jī)理屬靜態(tài)猝滅。相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為5.65×103L/mol和1.08,表明鹽酸嗎啡與DNA的結(jié)合能力不大,可以和DNA形成11

8、的絡(luò)合物。第八章:考察了QN的熒光光譜特性。選用QN為發(fā)光探針,采用紫外光譜、熒光光譜、熒光偏振等光譜方法研究了QN與ctDNA的相互作用,考察了影響其相互作用的各種因素,探討了作用機(jī)理和作用方式。研究發(fā)現(xiàn),該探針在與目標(biāo)靶分子結(jié)合后其光譜參數(shù)產(chǎn)生了變化,如熒光發(fā)射強(qiáng)度、熒光量子產(chǎn)率和偏振等。DNA存在時(shí),QN的熒光被顯著猝滅,吸收光譜出現(xiàn)減色現(xiàn)象。QN與DNA的本征鍵合常數(shù)為1.25×105L/mol,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為0.15,一分子的QN可以和大約3個(gè)堿基對(duì)作用。初步證實(shí)QN是通過嵌插方式與ctDNA作用的。QN和QD與ctDNA的作用模式和作用強(qiáng)度類似。第九章:總結(jié)全文,提出下一步

9、工作設(shè)想。【關(guān)鍵詞】：喹啉生物堿異喹啉生物堿發(fā)光探針紫外-可見吸收光譜小牛胸腺DNA【學(xué)位授予單位】：XX大學(xué)【學(xué)位級(jí)別】：博士【學(xué)位授予年份】：2008【分類號(hào)】：Q503【目錄】：中文摘要21-24英文摘要24-27第一章緒論27-631.1DNA與小分子的相互作用27-331.1.1DNA的結(jié)構(gòu)特征27-291.1.2小分子與DNA的相互作用模式29-331.1.2.1非共價(jià)作用29-321.1.2.2共價(jià)作用32-331.1.2.3剪切作用331.1.2.4影響因素331.2生物堿的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)33-381.2.1生物堿的結(jié)構(gòu)33-361.2.2生物堿的理化性質(zhì)36-371.2.3生物堿

10、的藥理性質(zhì)37-381.3小分子探針與DNA相互作用的常用方法的研究進(jìn)展38-501.3.1紫外可見吸收光譜法39-401.3.2熒光光譜法40-431.3.3室溫磷光光譜法43-451.3.4圓二色譜法45-461.3.5核磁共振譜法46-471.3.6拉曼光譜法47-481.3.7質(zhì)譜法481.3.8非光譜法48-501.4本論文的研究意義及主要內(nèi)容50-511.5本論文的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)51參考文獻(xiàn)51-63第二章鹽酸巴馬汀的紫外吸收和熒光光譜行為研究63-732.1前言632.2實(shí)驗(yàn)部分63-642.2.1儀器與試劑63-642.2.2實(shí)驗(yàn)方法642.2.2.1紫外吸收光譜測(cè)量642.2.2

11、.2熒光光譜測(cè)量642.2.2.3熒光量子產(chǎn)率測(cè)量642.3結(jié)果與討論64-702.3.1溶劑對(duì)鹽酸巴馬汀光譜的影響64-672.3.1.1溶劑對(duì)吸收光譜的影響64-652.3.1.2溶劑對(duì)熒光光譜的影響65-672.3.2pH對(duì)鹽酸巴馬汀光譜的影響67-682.3.2.1pH對(duì)吸收光譜的影響672.3.2.2pH對(duì)熒光光譜的影響67-682.3.3鹽酸巴馬汀的熒光量子產(chǎn)率68-702.4結(jié)論70參考文獻(xiàn)70-73第三章鹽酸巴馬汀與ctDNA相互作用的光譜法研究73-913.1前言73-743.2實(shí)驗(yàn)部分74-763.2.1儀器與試劑74-753.2.2實(shí)驗(yàn)方法75-763.2.2.1吸收光譜

12、滴定753.2.2.2熒光光譜滴定753.2.2.3KI猝滅實(shí)驗(yàn)753.2.2.4熒光偏振測(cè)量75-763.2.2.5磷酸鹽效應(yīng)和鹽效應(yīng)763.2.2.6DNA變性實(shí)驗(yàn)763.2.2.7電化學(xué)實(shí)驗(yàn)763.3結(jié)果與討論76-873.3.1巴馬汀與ctDNA相互作用的吸收光譜76-783.3.2巴馬汀與ctDNA相互作用的熒光光譜78-793.3.3巴馬汀與ctDNA相互作用的實(shí)驗(yàn)條件考察79-803.3.4離子強(qiáng)度的影響80-813.3.5磷酸鹽效應(yīng)81-823.3.6KI猝滅效應(yīng)82-833.3.7熒光偏振考察833.3.8ctDNA的變性83-843.3.9結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)843.3.1

13、0循環(huán)伏安法表征84-863.3.11作用模式探討86-873.4結(jié)論87參考文獻(xiàn)87-91第四章固體基質(zhì)上鹽酸巴馬汀的發(fā)光性質(zhì)及與ctDNA相互作用的研究91-1034.1前言91-924.2實(shí)驗(yàn)部分92-934.2.1儀器與試劑924.2.2實(shí)驗(yàn)方法92-934.2.2.1PS-RTP光譜的測(cè)量92-934.2.2.2PS-RTF光譜的測(cè)量934.2.2.3PS-RTP壽命的測(cè)量934.2.2.4陰離子猝滅實(shí)驗(yàn)934.3結(jié)果與討論93-1014.3.1巴馬汀的PS-RTP和PS-RTF光譜93-944.3.2影響巴馬汀RTP和RTF的因素94-984.3.2.1濾紙種類944.3.2.2重

14、原子種類94-954.3.2.3重原子濃度95-964.3.2.4pH964.3.2.5干燥條件96-984.3.2.6PS-RTP穩(wěn)定性984.3.3巴馬汀的PS-RTP分析法98-994.3.4巴馬汀與DNA相互作用的RTP和RTF光譜表征99-1014.3.4.1PS-RTP和PS-RTF光譜99-1004.3.4.2DNA對(duì)磷光壽命的影響1004.3.4.3猝滅劑的影響100-1014.4結(jié)論101參考文獻(xiàn)101-103第五章小檗堿和藥根堿與ctDNA相互作用的光譜法研究103-1175.1前言103-1045.2實(shí)驗(yàn)部分104-1065.2.1儀器和試劑104-1055.2.2實(shí)驗(yàn)方

15、法105-1065.2.2.1吸收光譜滴定1055.2.2.2熒光光譜滴定1055.2.2.3PS-RTP光譜測(cè)量1055.2.2.4PS-RTF光譜測(cè)量105-1065.2.2.5PS-RTP壽命測(cè)量1065.3結(jié)果與討論106-1135.3.1溶液中小檗堿和藥根堿與DNA相互作用的研究106-1085.3.1.1熒光光譜1065.3.1.2結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)106-1075.3.1.3紫外吸收光譜107-1085.3.2固體基質(zhì)上小檗堿和藥根堿的光譜行為108-1115.3.2.1PS-RTP、PS-RTF光譜108-1095.3.2.2濾紙種類對(duì)RTP、RTF的影響1095.3.2.3

16、重原子種類對(duì)RTP的影響1095.3.2.4重原子濃度對(duì)RTP的影響109-1105.3.2.5干燥條件對(duì)RTP、RTF的影響110-1115.3.3DNA與小檗堿相互作用的RTP光譜111-1125.3.4DNA與藥跟堿相互作用的RTF光譜1125.3.5DNA對(duì)小檗堿磷光壽命的影響1125.3.6DNA對(duì)小檗堿和藥根堿熒光偏振的影響112-1135.4結(jié)論113參考文獻(xiàn)113-117第六章兩種苯駢菲啶類生物堿與ctDNA相互作用的光譜法研究117-1356.1前言117-1186.2實(shí)驗(yàn)部分118-1206.2.1儀器與試劑118-1196.2.2實(shí)驗(yàn)方法119-1206.2.2.1吸收光

17、譜滴定1196.2.2.2熒光光譜滴定1196.2.2.3鹽效應(yīng)1196.2.2.4亞鐵氰化鉀猝滅實(shí)驗(yàn)119-1206.2.2.5熒光偏振測(cè)量1206.2.2.6熱變性實(shí)驗(yàn)1206.2.2.7電化學(xué)實(shí)驗(yàn)1206.3結(jié)果與討論120-1306.3.1白屈菜紅堿和血根堿與ctDNA相互作用的吸收光譜特征120-1226.3.2白屈菜紅堿和血根堿與ctDNA相互作用的熒光光譜特征122-1236.3.3白屈菜紅堿和血根堿與ctDNA相互作用條件的考察123-1246.3.4離子強(qiáng)度對(duì)相互作用的影響124-1256.3.5陰離子猝滅效應(yīng)125-1266.3.6熒光偏振1266.3.7ctDNA變性12

18、6-1276.3.8循環(huán)伏安表征127-1296.3.9結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)1296.3.10分子模擬129-1306.4結(jié)論130-131參考文獻(xiàn)131-135第七章鹽酸嗎啡與ctDNA相互作用的光譜法研究135-1477.1前言135-1367.2實(shí)驗(yàn)部分136-1377.2.1儀器與試劑1367.2.2實(shí)驗(yàn)方法136-1377.2.2.1酸度的影響136-1377.2.2.2熒光光譜滴定1377.2.2.3紫外吸收光譜滴定1377.2.2.4NaCl的影響1377.2.2.5亞鐵氰化鉀猝滅實(shí)驗(yàn)1377.2.2.6溫度對(duì)熒光光譜的影響1377.2.2.7熒光偏振測(cè)量1377.2.2.8DNA的變性實(shí)驗(yàn)1377.3結(jié)果與討論137-1447.3.1鹽酸嗎啡與ctDNA作用后的熒光光譜137-1387.3.2鹽酸嗎啡與ctDNA作用后的吸收光譜138-1397.3.3鹽酸嗎啡與