1、大鼠急性脊髓損傷熱休克蛋白47的表達(dá)變化 作者：何玉寶 楊晨 楊有庚 任憲盛【摘要】 目的 研究老年大鼠急性脊髓損傷（SCI）中熱休克蛋白47(HSP47)的表達(dá)情況。方法 用54只Wistar大鼠制作鉗夾型SCI模型，在SCI后3 d及每周評(píng)價(jià)BBB評(píng)分，并在1、3、5 w用免疫組化方法分析脊髓中HSP47的表達(dá)情況。結(jié)果 正常Wistar大鼠脊髓組織低表達(dá)HSP47，在SCI后表達(dá)明顯提高，且在第5周仍有上升趨勢(shì)（P0.01）。脊髓損傷后灰質(zhì)、白質(zhì)分界不清，細(xì)胞凋亡明顯，HSP47主要在血管及靠近軟脊膜處白質(zhì)中表達(dá)。結(jié)論 老年Wistar大鼠SCI 后HSP47表達(dá)增加，HSP47可能參與

2、到SCI的病理改變過(guò)程中。 【關(guān)鍵詞】 急性脊髓損傷；熱休克蛋白47；鉗夾型急性脊髓損傷模型老年患者由于脊柱和間盤(pán)的退行性改變，急性脊髓損傷（SCI）發(fā)病危險(xiǎn)更高。膠質(zhì)瘢痕是脊髓損傷修復(fù)的阻礙因素之一1，而熱休克蛋白47（HSP47）在瘢痕形成的過(guò)程中起到重要的作用2。但是對(duì)于HSP47在SCI后的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)免疫組化技術(shù)研究SCI后HSP47的改變，探索治療脊髓損傷的新靶點(diǎn)。1 資料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠（清潔級(jí)）54只，鼠齡12個(gè)月，體重200250 g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器HSP47（1200，Santa Cruz

3、公司），膠質(zhì)細(xì)胞酸性蛋白(GFAP，150）、神經(jīng)絲蛋白(NF，1100，武漢博士德生物工程有限公司)，UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒（鼠/兔）、DAB顯色試劑盒（福州麥新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），多聚賴氨酸（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），甲苯胺藍(lán)（北京化學(xué)制劑公司），石蠟配量機(jī)、石蠟包埋機(jī)、手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）等。1.3 大鼠鉗夾型SCI模型的建立3 54只大鼠隨機(jī)分為正常組，假手術(shù)組，SCI組，每組18只。假手術(shù)組單純行T10椎板減壓；SCI組接受T10節(jié)段的脊髓鉗夾損傷。10%水合氯醛腹腔注射(0.25 ml/100 g體重)，麻醉滿意后，取俯臥位，固定，

4、以肋骨下緣為中心背部剪毛，消毒，按肋骨確定椎體序列，在T8T12水平剪開(kāi)皮膚，長(zhǎng)約3 cm。剪開(kāi)深筋膜，尖刀緊貼棘突骨面縱形分離椎旁肌，直達(dá)椎板表面，顯露出T9T11的椎板和棘突，直至關(guān)節(jié)突。上自動(dòng)撐開(kāi)器，血管鉗固定T9T10棘突，蚊式止血鉗咬除棘突、椎板至關(guān)節(jié)突內(nèi)側(cè)面，暴露出脊髓硬脊膜，并用動(dòng)脈夾鉗夾脊髓，發(fā)現(xiàn)鉗夾后尾巴抽搐癱瘓。明膠海綿止血徹底后局部撒青霉素粉末20萬(wàn)U，逐層縫合肌肉、深筋膜、皮膚，再次消毒。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，每日2次人工排尿，直至恢復(fù)排尿，大約23 w。青霉素每次5萬(wàn)U/100 g體重，2次/d，腹腔注射1 w。1.4 BBB評(píng)分4所有動(dòng)物分別在SCI后3 d及每周評(píng)價(jià)BBB

5、評(píng)分。將動(dòng)物置于直徑為2 m的圓形平臺(tái)上，觀察記錄其后肢的行走及肢體活動(dòng)。評(píng)分分3部分：第1部分為07分，評(píng)判動(dòng)物后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)；第2部分為813分，評(píng)判后肢的步態(tài)及協(xié)調(diào)功能；第3部分為1421分，評(píng)判運(yùn)動(dòng)中爪的精細(xì)動(dòng)作，3項(xiàng)滿分為21分。1.5 HE染色、尼氏染色和免疫組化染色正常組、假手術(shù)組和SCI組在1、3和5 w分別處死6只。10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g體重)，達(dá)深度麻醉后，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，自左心室通過(guò)靜脈導(dǎo)管至升主動(dòng)脈，切開(kāi)右心房，快速灌注100 ml 0.01 mmol/L PBS緩沖液沖洗血管，待右心耳留出液體基本無(wú)色，繼以150 ml含10%中性福爾馬林

6、緩沖液灌注固定。自背部打開(kāi)椎管，取出脊髓損傷區(qū)為中心的脊髓組織長(zhǎng)約2 cm，并以10%中性福爾馬林緩沖液4下固定24 h后，以脊髓損傷區(qū)為中心修塊，長(zhǎng)約3 mm。然后各級(jí)酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。切片機(jī)以脊髓損傷區(qū)為中心切片，片厚2.0 m。切片脫蠟至水，行HE、尼氏染色和SP法染色5。各級(jí)酒精脫水、二甲苯透明、樹(shù)膠固封。用0.01 mmol/L PBS緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照。1.6 HE染色、尼氏染色和免疫組化染色結(jié)果判定HE染色后細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。尼氏染色后尼氏體呈紫藍(lán)色，胞核呈藍(lán)色。免疫組化陽(yáng)性表達(dá)為胞漿內(nèi)或者軸突內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在低倍鏡（10倍）下選取陽(yáng)性表達(dá)

7、密集區(qū)，在高倍鏡（400倍）下觀察細(xì)胞形態(tài)、染色定位和程度。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取6張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同重疊視野，輸入計(jì)算機(jī)分析累積光密度值。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用LDS檢驗(yàn)法對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果由SPSS13.0輸出。2 結(jié) 果2.1 BBB評(píng)分正常組和假手術(shù)組大鼠雙后肢BBB評(píng)分均為21分，SCI組損傷后3 d BBB評(píng)分為0.67±0.48，表明SCI模型成功；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，評(píng)分逐漸上升，表明損傷正在修復(fù)，見(jiàn)圖1。2.2 免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖2。HE、尼氏染色可見(jiàn)正常組和假手術(shù)組脊髓灰質(zhì)呈典型的蝴蝶形狀，灰質(zhì)和白質(zhì)邊界清晰，而SCI組脊髓正

8、常形態(tài)消失，空腔形成，灰質(zhì)和白質(zhì)分界消失，神經(jīng)纖維排列紊亂、減少，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、凋亡，膠質(zhì)細(xì)胞增生。HSP47主要表達(dá)在血管周?chē)翱拷浖鼓ぬ幇踪|(zhì)中。免疫組化累積光密度值分析見(jiàn)表1。與正常組和假手術(shù)組相比，SCI組HSP47表達(dá)水平高，且隨時(shí)間的改變表達(dá)量增加（P0.05）。表1 各組大鼠脊髓中HSP47光密度的比較（略)3 討 論 SCI后血管完整性和通透性遭到破壞，血管周?chē)黾拥男湍z原一方面占據(jù)了本來(lái)就很狹小的椎管空間，另一方面阻礙重建的血管與周?chē)?xì)胞氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，在血管重建過(guò)程中起到阻礙的作用。型膠原的生成利于膠質(zhì)瘢痕的形成而妨礙了脊髓神經(jīng)元的軸突再生，不利于軸突穿過(guò)膠質(zhì)瘢痕

9、。 實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明HSP47和膠原合成有關(guān)6。研究表明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，HSP47不僅參與型膠原的正確折疊，而且還阻止不正確折疊。HSP47在隨后型膠原的分泌、加工和纖維化形成中起關(guān)鍵作用；在HSP47/細(xì)胞中應(yīng)用基因敲除技術(shù)證明了HSP47在型膠原分子成熟中的重要性7。 SCI后盡管出現(xiàn)了細(xì)胞變性、壞死和凋亡，細(xì)胞數(shù)目減少，但是HSP47表達(dá)明顯升高，主要分布在血管周?chē)翱拷浖鼓ぬ幇踪|(zhì)中，進(jìn)一步證實(shí)了HSP47的表達(dá)增加阻礙了血管的再生。SCI后第1周HSP47即出現(xiàn)升高趨勢(shì)，且在第5周仍有上升趨勢(shì)，說(shuō)明針對(duì)HSP47為靶點(diǎn)的治療應(yīng)該在SCI后立即給予干預(yù)，且應(yīng)該持續(xù)到第5周以上。【參考文獻(xiàn)】 1

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