1、大鼠腎小球系膜細胞表型的增齡性變化 作者：卓莉 蔡廣研 劉伏友 傅博【摘要】 目的 觀察大鼠腎小球系膜細胞隨增齡細胞表型及功能的變化特點。 方法 取3、12、24月齡健康雄性Wistar大鼠原代系膜細胞進行培養，MTT法檢測細胞增殖能力，進行SAgal染色，采用RTPCR和Western印跡法分別檢測p21WAF1/CIP1/SDI1基因及蛋白質的表達變化，并用免疫熒光法檢測系膜細胞中p21WAF1/CIP1/SDI1的表達與定位。 結果 大鼠腎小球系膜細胞增殖能力隨增齡逐漸減弱(P<0.05)，SAgal染色陽性率隨增齡逐漸增加(P<0.05)，p21WAF1/C

2、IP1/SDI1 mRNA及蛋白質表達隨增齡逐漸增加(P<0.05)。免疫熒光結果示p21WAF1/CIP1/SDI1主要在細胞核內表達，熒光強度隨增齡逐漸增強 (P<0.05)。 結論 大鼠腎小球系膜細胞隨增齡細胞形態、增殖能力與衰老相關蛋白表達發生明顯改變，出現了復制性衰老表型。 【關鍵詞】 系膜細胞；衰老；細胞表型；p21WAF1/CIP1/SDI1【Abstract】 Objective To investigate the characteristic of rat mesangial cells with advancing age. Methods M

3、ale Wistar rats aged of 3, 12, 24 months were used. The rat mesangial cells were processed for MTT assay and senescence associated galactosidase (SAgal) staining. The expression and location of p21WAF1/CIP1/SDI1 in mesangial cells were studied by immunofluorescence. The mRNA and protein levels of p2

4、1WAF1/CIP1/SDI1 were detected by Western blot and/or RTPCR, respectively. Results The ability of proliferation was decreased in rat mesangial cells with advancing age(P0.05).The expression of senescence associated galactosidase activity was increased in mesangial cells with advancing age. Percentage

5、s of SAgal staining positive cells were (11.9±3.6)% versus (39.0±4.0)% versus (86.9±7.4)% (P0.05) in young, middle and aging glomerular mesangial cells. The p21WAF1/CIP1/SDI1 protein showed localization in nucleus in mesangial cells, and the staining intensity of p21WAF1/CIP1/SDI1 in

6、mesangial cells in old animals was markedly increased, as compared to that in young and middle age rats (P0.05).The mRNA levels of p21WAF1/CIP1/SDI1 was significantly increased in mesangial cells in old animals, as compared to that at the age of 3 and 12 months, meanwhile the p21WAF1/CIP1/SDI1 prote

7、ins expression were dramatically increased with advancing age (P0.05). Conclusions The cellular phenotype and function are changed in rat mesangial cells with advancing age. The rat mesangial cells appear replicative senescence with advancing age. 【Key words】 Mesangial cells; Senescence; Phenotype；p

8、21WAF1/CIP1/SDI1多數學者認為，器官衰老是由于其固有細胞功能減退所導致，腎小球系膜細胞作為腎臟最重要的固有細胞之一，具有調節腎血流量，分泌細胞外基質、炎癥介質等功能，其表型和功能的改變在腎臟衰老進程中必然發揮著重要的作用。為了能客觀真實地反映腎小球系膜細胞隨衰老的變化，排除體外培養環境對細胞表型的影響，本研究應用自然衰老的24月齡大鼠，體外培養原代的腎小球系膜細胞，觀察系膜細胞是否隨機體增齡而衰老，以及老年大鼠系膜細胞p21WAF1/CIP1/SDI1表達的變化，為進一步研究系膜細胞衰老的作用機制奠定基礎。1 材料與方法1.1 原代大鼠系膜細胞培養 不同鼠齡雄性Wistar大鼠解

9、放軍總醫院實驗動物中心提供，SCXK(京)2005001315只，分3月齡組、12月齡組及24月齡組，每組各5只，無菌條件下取雙側腎臟，剝離腎包膜，用剪刀把腎皮質剪成碎塊，放于重疊的3層不銹鋼篩網上研磨，鏡下觀察，若見98%以上的腎小球脫去包曼氏囊，視野中基本上無腎小管存在，即可停止沖洗。收集第2層篩網上的組織移入離心管，V型膠原酶消化后，應用15胎牛血清的RPMI 1640培養液，37、5CO2條件下培養原代的系膜細胞，約7 d后第1次傳代，傳代的細胞24 h全部貼壁，生長迅速，形態為梭形或不規則星形，34 d已匯合成片，純度極高，經鑒定結蛋白(Desmin)陽性、抗因子抗體陰性，傳至第3代

10、，用于實驗。1.2 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細胞增殖能力 系膜細胞生長至80融合，0.25胰酶消化，計數后接種于96孔板，2 000個細胞/孔，細胞貼壁后，繼續培養24、48、72、96、120 h，加入MTT(5 mg/ml)10 l 孵育4 h后，加二甲基亞礬（DMSO）200 l/孔裂解細胞，避光10 min，于492 nm波長記錄吸光度值。1.3 衰老相關半乳糖苷酶活性（SAgal）染色 接種于6孔板中的各組細胞，待細胞生長至80匯合，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，于室溫固定細胞5 min，PBS液清洗3次后，加上新配制的含1mg/ml 5溴4吲哚D半乳糖苷（Xgal）（美國

11、Progrma公司）的SAgal染液，置37（無CO2）溫育1216 h，PBS液清洗3次后，觀察細胞胞漿中藍色沉淀，用數碼相機拍照。1.4 RNA提取及反轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）分析 利用Trizol一步法提取腎小球系膜細胞總RNA，進行RTPCR。采用的引物序列如下：p21WAF1/CIP1/SDI1上游引物為：5 CTG CCA GCT GCC CCT CTA TTT TG 3，下游引物：5 CAT CTT GGC CTG GCT CCT TGT A 3，產物片段大小為373 bp；選用大鼠甘油醛3磷酸脫氫酶（GAPDH）為參照，上游引物：5 TGC ACC ACC AAC TGC

12、 TTA GC3，下游引物：5GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG3，產物片段大小為191bp(北京賽百盛公司合成)。反應條件為94(5 min)變性94(45 s)58退火(45 s)延伸72(45 s)×30個循環72(7 min)。用AlphalmagerTM 2200凝膠圖像分析系統(美國Alpha公司)，進行半定量分析。1.5 蛋白質提取及Western印跡 將收集的細胞加入200 l預冷的蛋白抑制率(RIPA)裂解液進行勻漿，4 12 000min離心25 min，吸取蛋白，經Micro BCA Protein Kit測蛋白濃度。取100 g總蛋白，加2

13、×十二烷基磷酸鈉（SDS）上樣緩沖液，100變性 5 min。進行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分離，將膠中蛋白轉印至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉4 h，加p21WAF1/CIP1/SDI1小鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司產品)4過夜，二抗室溫孵育1 h，Tris緩沖液（TBST）洗后用化學發光顯影(ECL)(美國Santa Cruz公司產品)顯色。所得結果以actin (美國Santa Cruz公司產品)為參照，用UVP2000 凝膠圖像分析系統(美國基因公司)進行半定量分析。1.6 大鼠原代系膜細胞間接免疫熒光染色 不同組細胞貼壁后，用3多

14、聚甲醛2%蔗糖37固定10 min，PBS洗3 遍，冰上透化10min，PBS洗3遍，1牛血清白蛋白（BSA）冰上封閉10 min，p21WAF1/CIP1/SDI1小鼠單克隆抗體，37孵育1 h，4過夜，含吐溫20的TBST洗10遍，TRITC標記的山羊抗小鼠IgG，避光室溫孵育1 h，TBST洗10遍，熒光顯微鏡下照相。1.7 統計學處理 使用SPSS11.0軟件進行統計分析，計量資料使用x±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析。2 結果2.1 不同月齡大鼠原代系膜細胞生長及表型特征 3、12及24月齡大鼠的原代系膜細胞均為長梭形或不規則星形，貼壁后生長迅速，約34 d后可傳第

15、1代。傳代后，3、12月齡大鼠的系膜細胞仍保持旺盛的增殖能力，約23 d傳1代，3月齡大鼠系膜細胞可傳20代左右；而12月齡大鼠系膜細胞可傳10代以上。24月齡大鼠的系膜細胞生長速度明顯較3及12月齡大鼠系膜細胞減慢，約57 d才可傳1代，群體倍增時間較前者系膜細胞延長1倍以上。而且傳至第23代后，細胞肥大，形態變扁平、伸展，代謝減慢、生長停滯，失去增殖和傳代能力。2.2 不同月齡大鼠原代系膜細胞增殖能力 MTT法檢測結果顯示，24月齡大鼠系膜細胞72，96及120 h的OD值（0.314±0.05，0.385±0.06及0.456±0.08）顯著低于3月齡大鼠系

16、膜細胞（0.430±0.03，0.556±0.04及0.671±0.05）及12月齡大鼠系膜細胞（0.425±0.04，0.543±0.05及0.657±0.06）相應時間點的OD值（P0.05）；3月齡與12月齡間比較無統計學差異(P0.05)。2.3 不同月齡大鼠原代系膜細胞SAgal染色 結果顯示，3月齡大鼠的系膜細胞染色陽性率很低，僅為(11.9±3.6)%，系膜細胞SAgal染色陽性率隨增齡逐漸增高，12月齡組為(39.0±4.0)%，而24月齡組細胞陽性率高達(86.9±7.4)%。3組間兩兩

17、相比，差異有統計學意義（均P<0.05），表明大鼠的系膜細胞在機體內確實隨年齡增長而發生衰老。2.4 RTPCR檢測原代系膜細胞p21WAF1/CIP1/SDI1 mRNA的表達 RTPCR檢測結果顯示，3，12，24月齡大鼠原代系膜細胞p21WAF1/CIP1/SDI1 mRNA的相對值分別為1±0.03，1.14±0.05，1.34±0.05，3組間兩兩相比，差異有統計學意義（P<0.05），p21WAF1/CIP1/SDI1 mRNA的表達隨增齡而增加。2.5 Western印跡檢測原代系膜細胞p21WAF1/CIP1/SDI1蛋

18、白質的表達 應用Western印跡，進一步檢測了p21WAF1/CIP1/SDI1的蛋白質表達水平隨增齡出現的變化。結果顯示與p21WAF1/CIP1/SDI1mRNA的表達一致，3，12，24月齡大鼠原代系膜細胞p21WAF1/CIP1/SDI1蛋白質的表達隨增齡增加(1±0.04 vs 1.22±0.04 vs 2.03±0.10)（P<0.05）。2.6 不同月齡大鼠原代系膜細胞間接免疫熒光染色結果 p21WAF1/CIP1/SDI1主要在大鼠系膜細胞胞核內表達，隨著年齡增長表達的熒光強度逐漸上升，3月齡組大鼠系膜細胞熒光較弱，12月齡組稍有增

19、強，24月齡組表達非常強，各組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。圖1 不同月齡大鼠原代系膜細胞p21WAF1/CIP1/SDI1免疫熒光染色結果(×200)（略）3 討論 衰老是遺傳決定的自然演進過程，一切細胞均有內在的預定程序決定其壽命。正常細胞在體外培養時，其分裂次數存在“Hayflick”極限，亦稱最大分裂次數。這種正常細胞在體外分裂潛能受限制的現象即稱為復制性衰老，而這一現象提示復制性衰老可能是生物體生命周期在細胞水平的重演。有關體內細胞是否存在復制性衰老，這一問題仍有爭議，但大多數生物學家認為復制性衰老與生物體整體衰老相關，是體內衰老現象的一種體

20、外反映。隨著生物體年齡的增加，衰老細胞不斷在體內積聚。體外細胞培養中的復制性衰老可以反映體內衰老發生的過程，其特征包括：不可逆地喪失增殖能力，出現細胞體積增大、胞體變平，功能上發生有選擇的、特異改變，例如某些衰老基因表達的變化等。 腎臟衰老的發生機制是一個非常復雜的過程，有學者認為其固有細胞功能的減退是導致腎臟衰老的重要原因和體現；而腎小球系膜細胞作為腎臟最重要的固有細胞之一，具有調節腎血流量，分泌細胞外基質、炎癥介質等功能，其表型和功能的改變在腎臟衰老進程中也發揮著重要的作用，故本研究應用自然衰老的24月齡大鼠，體外分離培養原代的腎小球系膜細胞，并與3、12月齡大鼠的系膜細胞進行對比研究，觀

21、察不同月齡的腎小球系膜細胞細胞表型、功能的改變及p21WAF1/CIP1/SDI1的表達情況。結果顯示，24月齡大鼠的系膜細胞增殖能力明顯低于3月及12月齡組，且出現肥大等形態改變；此外，細胞SAgal的陽性率明顯高于3月齡及12月齡大鼠。 p21WAF1/CIP1/SDI1基因可能是人類可分裂細胞中控制衰老進程的主導基因之一，在衰老細胞中的表達量是增殖細胞中的1020倍，p21WAF1/CIP1/SDI1mRNA的增加與老化的表型及細胞增殖的喪失密切相關。當增殖細胞的生長因子去除或接觸抑制時，p21WAF1/CIP1/SDI1基因的表達明顯增加；再用血清刺激時，p21WAF1/CIP1/SD

22、I1mRNA水平在靜止細胞中起初增加，隨后在進入S期前降到較低水平。與此相比，衰老細胞中p21WAF1/CIP1/SDI1mRNA水平并沒有降低，表明該基因在維持衰老細胞表型中發揮重要作用2。眾多研究皆表明，p21WAF1/CIP1/SDI1在衰老細胞中高表達，可作為細胞衰老的特征之一3，4。而在本研究中，亦發現p21WAF1/CIP1/SDI1在大鼠系膜細胞核內表達，且隨著月齡的增加，其基因及蛋白質的表達也逐漸增強。故而，目前研究結果都表明伴隨著增齡，大鼠系膜細胞確實逐漸出現了復制性衰老。 綜上所述，大鼠系膜細胞隨機體增齡出現衰老，其細胞的表型及功能都發生了相應的改變，這可能是腎臟器官衰老的重要體現和功能減退的發生原因之一。然而，細胞及器官衰老都是多因素綜合作用的結果，其過程相當復雜，故有關腎臟衰老的發生機制仍需要更多及更加深入的研究。【參考文獻】 1 Dimri GP，