1、作者單位:日本神戶市西區高琢臺日本SYSMEX株式會社學術部國際學術交流血細胞分析儀的溯源及國際參考方法藤本敬二為加強對血細胞分析儀的溯源及國際參考方法了解,作者主要對血細胞計數分析(紅細胞計數、白細胞計數、血小板計數、血紅蛋白以及紅細胞壓積的國際參考方法建立的過程和及其概要進行了闡述,并對國際參考方法與各實驗室目前方法學的溯源性進行了論述。在具體工作流程上,對使用人新鮮血或經過了穩定固化加工的血細胞確立檢驗結果溯源性方法及其注意事項進行了介紹,同時論述了室間質控和室內質控的重要性。1.血細胞分析和國際血液學標準化委員會的歷史:血細胞計數是臨床檢查中最基本最重要的項目,檢測內容包括紅細胞,白細

2、胞和血小板等血細胞計數項目以及血紅蛋白濃度的測定。血細胞計數最初是使用顯微鏡對顯微鏡視野內的各種細胞以人工目視的方法進行計數,但是,1953年Coulter公司的創始人,W1H1Cloulter成功的研制出世界第一臺自動“流體中懸浮顆粒分析儀”之后1,2,經過不斷的技術革新,其自動化技術逐步應用于血細胞分析儀中。另外,作為一種簡便的檢測血液中紅細胞濃度的方法,可將全血放入試管中,經過離心分離后測量沉淀的紅細胞體積與樣品體積的比例,即所謂的紅細胞壓積(Packed Cell Volume,PVC。現在,紅細胞壓積的檢測也已經成為自動血細胞分析儀的檢測指標之一。紅細胞中的血紅蛋白具有輸送氧氣功能,

3、其定量檢測最初使用試管進行檢測的,現在該方法也已經實現自動化,已成為自動血細胞分析的指標之一。這類可實現血細胞分析自動化的裝置通常被稱之為血細胞分析儀或Hematology Analyzer,最初在歐洲和北美被迅速普及。1963年,在歐洲血液學會里斯本會議(葡萄牙上,召開了題為“血細胞分析技術及其標準化”的研討會,大家發現,被認為是比顯微鏡檢查準確度高的各種自動血細胞分析儀的檢測結果大相徑庭(室間差異,為了解決這個問題,大會設立了國際血液學標準化委員會(International Council for Standardization in Haematology。其中的血紅蛋白檢測專家組和血

4、液細胞分析專家組一直在展開各種活動,致力于確立血紅蛋白檢測的國際參考方法和血液細胞分析的國際參考方法。2002年末,血細胞分析的基本指標紅細胞、白細胞、血小板分析及血紅蛋白濃度以及PCV檢測的國際參考方法都已確立。2.血細胞分析(紅細胞、白細胞、血小板國際參考方法概略:紅細胞和白細胞的國際參考方法制定于1994年3。檢測系統中的所有血液流路部分都采用加工后多年不會變形的石英玻璃部件,定量部使用水銀壓力計。為了最大程度減少流體檢測中的誤差,設計盡可能簡單,檢測原理為電阻法。根據檢驗原理,需要對全血樣品進行數萬倍的稀釋,為了最大程度減少稀釋過程中的誤差,要使用A級的精密燒瓶和精密吸管。儀器對同時通

5、過檢測部位的細胞不具有修正功能,但可對一系列不同稀釋比例的標本進行校準。利用不同濃度的標本同時通過檢測部位的細胞數的比例不同的原理,以連續稀釋的檢測結果計算出無限稀釋倍率濃度時的檢測結果(在該濃度下,可認為沒有細胞同時通過檢測部,并將該結果確定為所測標本的“真值”。血小板的國際參考方法于2001年4確定。在此之前曾對各種方法經過長期的討論,由于各種方法各有優劣都沒有得到通過,新的參考方法是采用流式細胞術以單克隆抗體(CD41和CD61對全血進行識別,得到紅細胞總數和血小板總數的比率。再根據血小板和紅細胞的比率,乘以紅細胞參考方法所檢測得到的紅細胞真值來間接計算出血小板的真值。3.血紅蛋白的定量

6、和PCV國際參考方法簡介:血紅蛋白的定量是血細胞分析項目之中最早確立國際參考方法的指標,隨后又進行過多次改定5。檢測時使用商品化的分光光度計,采用氰化高鐵血紅蛋白法進行檢測。檢測結果的準確度除了取決于分光光度計的質量,還有賴于檢測所用的石英比色杯的精度,標本的稀釋精度,以及是否根據參考方法中的規定對試劑進行調整,是否按照規定使用清潔的過濾網對標本進行測試前的過濾等。在過去,實驗室中一直以精密毛細管法作為PCV的參考方法6,但是由于精密毛細管的一端需要封入黏土(seal,而且精密毛細管中血液各組分的交界部分不清晰或不均一,造成紅細胞的沉積部分越到下方越容易因為壓縮過度而脫水變形,越往上越容易混入

7、白細胞,血小板或血漿(trapped plasma,所以,人們一直在探討可以代替精密毛細管法的新方法,2001年新的參考方法確立了7。該法同精密毛細管法相比,從開始操作開始到往精密毛細管內吸入紅細胞的步驟是相同的,但是計算時卻慎重地避開了精密毛細管的上部和下部僅取中央部分,通過國際參考方法測定該部位的血紅蛋白濃度。其結果與國際參考方法測得的全血的血紅蛋白濃度的比率為PCV。只是這種測定方法在檢驗室里實際操作中還有很多困難,所以,目前正在討論更具有可行性的適用于檢驗室的參考方法。41血細胞分析結果的溯源性:如上所述,由于確立了血細胞分析儀的基本檢測指標紅細胞,白細胞,血小板,血紅蛋白,PCV 的

8、國際參考方法,一般醫療機構血細胞分析儀的檢測結果在理論上可以溯源至國際參考方法(圖1。 圖1確保多實驗室結果可溯源性的流程圖 具體的操作流程是,首先使用國際參考方法對加入抗凝劑EDTA2K 的正常人新鮮血液進行檢測,其結果作為該標本的各指標的真值。然后使用要校準的血細胞分析儀(下稱檢測系統,對同一標本進行檢測,并對檢測結果進行修正使其與國際參考方法的檢測結果相同。此時,該檢測系統(B 與國際參考方法具有可溯源性,即A =B 。但是,如果將某一區域內所有相同的檢測系統(C 都使用上述的同一份新鮮健康人血液進行檢測,并把檢測結果修正到與國際參考方法一致,實際操作中會存在許多困難。為了解決這一問題,

9、可用已溯源到國際參考方法的檢測系統(B 檢測可以長期保存的固定后的血液,然后再用其他相同的檢測系統(C 檢測該樣品,并把所得結果修正到與(B 相同,此時,市場上相同的檢測系統便可以同與國際參考方法可溯源的儀器進行間接溯源,即B =C 。A =B ,B =C ,所以A =C ,從而使市場上的檢測系統都可以與國際參考方法進行溯源。用C 在對其他檢測系統D 進行溯源性校準時,可以假定C 為A ,如果兩者之間使用新鮮健康人血液具有互換性的話,再用固化后的血液進行調整使C =D ,那么,A =B ,B =C ,C =D ,則A =D ,即D 也與國際參考方法具有可溯源性。進而再繼續構筑一系列這樣的流程,

10、就可以推進各國、各地域的標準化,最終實現各單位間檢測結果的標準化。51標準化的目的及目前所存在的問題:按照上述方法,理論上可使所有的血細胞分析儀實現標準化,實現所有患者的檢測結果達到標準化這一目標。但為實現這一目標需要有一個前提條件,就是所有的血細胞分析儀均使用上述方法與國際參考方法進行溯源。而目前的現狀是,由于各廠家生產的血球分析儀采用的檢測原理和試劑的性質不同,造成結果的潛在差異8,9。尤其對于一些特殊標本,在不同的檢測系統中得到的數值有時會與真正的數值出現差異。為此,檢測分析儀的生產廠家和經銷商有責任向用戶長期穩定地提供該檢測系統的特殊標本檢測結果及各種相關信息。而且為了能夠長期地保持這

11、種可溯源性,需要客觀上保證該溯源體系中的所有檢測系統每年、每日、每時處于穩定狀態。為此,各檢測系統一旦進入溯源體系就都有必要積極地進行室內質控和室間質控。目前,中國衛生部臨床檢驗中心和各省的臨床檢驗中心正在共同努力構筑上述的溯源體系,筆者雖然力微,但也愿意為該事業貢獻自己的一份力量,每當看到中國檢驗醫學專家和有關人士對這項事業的高漲熱情,極大地使命感引起我的思考,總能使我想起中國唐詩選第一首,魏徵的名詩述懷中的一節“人生感意氣,巧名誰復論”的詩句。讓我們共同努力促進溯源體系的構筑和完善。參考文獻1Coulter WH.United states patent ,1953,20:26526508

12、.2Lewis SM.Harmonization and standardization of the blood count 2the role of the ICSH cytometry panel 2,Sysmex J Int ,1999,9:127.3ICSH Cytometry Panel :Reference method for the enumeration of erythrocytes and lucocytes ,Clin lab Haemat ,1994,16,1312138.4ICSH Cytometry Panel.Platelet counting by the

13、RBC/patelet Ratio Method 2A reference Method 2.Am J Clin Pathol ,2001,115,4602464.5ICSH HG B Expert Panel.Recommendation for reference method for haemoglobinometry in human blood and specifications for international haemiglobincyanide standard.J Clin Pathol ,1996,49,2712274.6NCCLS :Procedure for determining facked cell volume by the microhematocrit 2000.NCCLS Publication H72A3.7ICSH Cytometry Panel.Recommendation for Reference method for the packed cell volume.Lab Hematol ,2001,7:1482170.8Cornbleet J.Spurious results from automated hematology cell