1、模擬微重力環境下層狀修復體與軟骨細胞復合培養的實驗研究         10-05-04 14:15:00     編輯：studa20            作者：張世浩，朱立新，靳安民，嚴樂平，王九現，黃銳，朱書濤 【摘要】  目的探討模擬微重力作為軟骨組織工程培養方法的作用和膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣（trical cium phosphate

2、，TCP）層狀梯度修復體作為關節軟骨組織工程支架的可行性。方法體外培養新西蘭大白兔關節軟骨細胞并擴增,吸附于多孔膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣層狀梯度修復體上，模擬微重力和普通環境下三維立體分別培養3周,通過生長曲線、倒置相差顯微鏡、組織學、掃描電鏡及免疫組織化學檢測微重力對軟骨細胞培養的影響和支架在三維立體培養對軟骨細胞的表型、增殖及功能的影響。結果軟骨細胞/修復體體外培養3周,軟骨細胞模擬微重力培養組明顯比普通培養組在層狀修復體上分布均勻，修復體中心軟骨細胞數量明顯較多，并分泌細胞基質，包裹在軟骨細胞周圍，型膠原免疫組織化學染色陽性。結論模擬微重力環境有利于軟骨細胞在三維支架上的均勻增殖，有望成

3、為軟骨組織工程中的一種重要培養方法；膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣層狀梯度修復體，細胞相容性良好,有望成為一種比較理想的關節軟骨組織工程支架材料。 【關鍵詞】  微重力; 層狀修復體; 軟骨細胞; 組織工程    Abstract：ObjectiveTo evaluate the feasibility of the minic microgravity as a method and the layered cylindric collagenchitosantricalcium phosphate composite as a scaffold for t

4、he cartilage tissue engineering after an observation of how it absorbs the chondrocytes and affects the cell behavior.MethodThe chondrocytes were isolated and multiplied in vitro,and then the chondrocytes were seeded onto the  porous collagenchitosantricalcium phosphate composite scaffold and w

5、ere cultured in both minic microgravity and ordinary environment for 3 weeks.The effects of the composite scaffold on the cell adhesivity,proliferation,morphological changes and synthesis of the extracellularmatrix were observed by the growth curve,phasecontrast microscopy,histology,scanning electro

6、n microscopy and immunohistochemistry.ResultThe chondrocytes that adhered to the scaffold increased significantly and secreted  extracellular matrix in the center of the porous scaffold around the chondrocytes under minic microgravity compared with ordinary environment.Immunohistochemistry of t

7、ype collagen was positive.ConclusionThe minic microgravity environment will be a good method for the cartilage tissue engineering.And the layered cylindric collagenchitosantricalcium  phosphate composite scaffold has a good cellular compatibility.It will be an ideal scaffold for the cartilage t

8、issue engineering.    Key words：microgravity；  layered composite；  chondrocyte；  tissue engineering    關節軟骨損傷一直是骨科面臨的難題之一。關節軟骨本身缺乏營養血管，再生細胞和體液因子少，軟骨的細胞/基質比低，一旦關節軟骨損傷，其再生能力十分有限。此外，再生軟骨的生物化學和機械性能不等同于正常軟骨，容易退變和侵蝕。組織工程修復軟骨手段的目的是將修復物質運送到受損部位并且固定于該位置以達到有效的修復 。從

9、研究結果來看，雖然研究者們應用了多種方法研究生物材料、種子細胞和修復，但修復關節軟骨的長期效果并不令人滿意，存在著組織工程軟骨中心強度低、難以和宿主正常軟骨整合、軟骨和軟骨下骨的斷裂分層問題等難題13。作者希望通過最近新興的模擬微重力技術，將軟骨組織工程中應用廣泛的膠原、殼聚糖與TCP有機復合,模仿體內關節軟骨的分層結構,增加支架材料的力學強度，構建層狀梯度復合材料，并將擴增的兔關節軟骨細胞植入其中人工培養,觀察軟骨細胞在膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣層狀梯度修復體中的黏附、增殖、生長情況及生物學性狀變化,以評價微重力培養方法在軟骨組織工程的實用性及該復合材料作為關節軟骨組織工程支架的可行性。

10、60;   1  材料和方法     1.1  主要試劑和儀器    DMEM/F12、DHanks 、胰蛋白酶、EDTA (Sigma公司，美國)；型膠原酶(Gibco公司，美國)；胎牛血清（杭州四季青公司）；四氮唑藍（上海思吉生物制品有限公司，中國）、型膠原抗體、S-100抗體、SABC試劑盒（武漢博士德公司）；12、24孔培養板（CorningCostar公司，美國）；旋轉培養儀（Synthecon公司，美國）；離心機（Sigma公司，美國）；酶標測定儀（Metertech公司，臺灣）；C

11、O2培養箱（Heraers Hera cell，德國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；膠原/殼聚糖/磷酸三鈣層狀梯度修復體由華南理工大學材料學院制作提供，直徑5 mm，高5 mm圓柱形，上層以膠原/殼聚糖為主,下層以膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣為主,兩層之間逐漸過度，沒有明顯界限，平均孔徑為100 m,孔隙率90%。    1.2  兔關節軟骨細胞體外分離培養    1.3  修復體預處理    膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣層狀梯度修復體經環氧乙烷消毒備用，實驗前取12個置于12孔

12、培養板,DHanks洗3遍,每次20 min,再用DMEM/F12 液浸泡過夜。    1.4  細胞和支架復合普通培養    選擇生長狀態良好的第2、3 代細胞消化離心,用含10% 胎牛血清的DMEM/F12液配制成軟骨細胞濃度為 1×107/ml,滴入經DMEM/F12液預濕的復合支架中,每個支架加入300 l，將培養板放入5%CO2濃度、飽和濕度、37培養箱內30 min，然后每孔加入1.0 ml DMEM/F12完全培養基繼續培養。隔日換液,培養3周， 進行相關檢測。    1

13、.5   細胞和支架復合模擬微重力培養    選擇生長狀態良好的第2、3 代軟骨細胞消化離心,用含10% 胎牛血清的DMEM/F12液配制成軟骨細胞濃度為 1×107/ml,滴入經DMEM/F12液預濕的復合支架中,每個支架加入300 l，置于孵箱中30 min后將細胞支架復合物放入微重力旋轉培養儀中，加滿DMEM/F12完全培養基，置于5%CO2濃度、飽和濕度、37培養箱內繼續培養。隔日換液1/3,培養3周,進行相關檢測。    1.5  檢測指標    2

14、60; 結  果    2.1  軟骨細胞形態    體外單層培養的軟骨細胞剛接種時呈球形,懸浮在培養液中,24 h后開始貼壁,細胞呈扁平狀,大多數為三角形，少量多角形,48 h后可見細胞分裂相,約1周后細胞鋪滿培養瓶瓶壁,折光度降低,呈“鋪路石”樣（圖1）,可進行傳代。第2、3代細胞S100免疫細胞化學染色胞漿內呈陽性反應（圖2）。    2.2  生長曲線    軟骨細胞和材料復合后，除第1 d兩組之間無顯著性差異外（P=0.857），其余6個時間點兩組之間有顯著性差異（P=0.007,0.002,0.001,0.000,0.000,0.000），微重力組均比培養板組增殖