1、重組重組DNA技術與基因工程技術與基因工程A 酵母作為表達外源基因受體的特征6 外源基因在酵母中的表達 酵母（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞半知菌類（半知酵母），共由56個屬、500多個種組成。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達系統，則酵母菌是最成熟的真核生物表達系統。酵母的分類學特征真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母）、擔子菌綱（擔子酵母）、A 酵母作為表達外源基因受體的特征6 外源基因在酵母中的表達酵母表達外源基因的優勢全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便能將外源基因表達產物分泌至培養基中具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統大規模發

2、酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產內毒素，美國FDA認定為安全的基因工程受體系統（Generally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最簡單的真核模式生物B 酵母的宿主系統6 外源基因在酵母中的表達提高重組蛋白表達產率的突變宿主抑制超糖基化作用的突變宿主減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主廣泛用于外源基因表達的酵母宿主廣泛用于外源基因表達的酵母宿主目前已廣泛用于外源基因表達和研究的酵母包括：酵母屬 如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克魯維酵母屬 如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）畢赤酵母

3、屬 如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母屬 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）漢遜酵母屬 如多態漢遜酵母（Hansenula polymorpha）其中釀酒酵母的遺傳學和分子生物學研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達外源基因最理想。提高重組蛋白表達產率的突變宿主能導致釀酒酵母中重組蛋白產量提高或質量改善的突變類型：ssc1ssc2rgr1ose1ssc11 rho-突變類型生物效應作用位點改善重組蛋白分泌鈣離子依賴型的ATP酶提高重組蛋白表達轉錄后加工轉錄水平提高重組蛋白表達轉錄水平提高重組蛋白表達改善重組蛋白分泌羧肽酶Y轉錄水平提高重組

4、蛋白表達抑制超糖基化作用的突變宿主能抑制超糖基化的突變類型mnnalgoch突變類型生物效應 許多真核生物的蛋白質在其天門冬酰胺側鏈上接有寡糖基團，它們常常影響蛋白質的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側糖鏈兩部分組成。 酵母菌普遍擁有蛋白質的糖基化系統，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。甘露糖生物合成缺陷型天門冬酰胺側鏈糖基化缺陷型外側糖鏈添加缺陷型減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主泛素介導的蛋白質降解作用蛋白酶體LysHOOCUbiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3 Lysubiquitin liga

5、se E3 Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統的編碼基因酵母菌共有四個泛素編碼基因：UBI 1 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對數生長期表達 穩定期關閉UBI 2 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對數生長期表達 穩定期關閉UBI 3 編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 對數生長期表達 穩定期關閉UBI 4 編碼泛素五聚體 對數生長期關閉 穩定期表達酵母菌共有七個泛素連接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主泛素降解途徑衰減的釀

6、酒酵母在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表達，UBI 4-突變株能UBI 4缺陷型：正常生長，但細胞內游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突變株是外源基因表達理想的受體。UBA 1缺陷型：UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導的蛋白降解。Ubc4 - ubc5 雙突變型：七個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效。C 酵母的載體系統6 外源基因在酵母中的表達酵母克隆表達質粒的構建酵母中的野生型質粒酵母中的野生型質粒釀酒酵母中的2m環狀質粒幾乎所有的釀酒酵母中都含有2m雙鏈同源重組REP1RAFST

7、BoriREP2FLPIRIRAB環狀質粒，拷貝數達50至100個。IRs 反向重復序列，600 bp，重組FLP 編碼產物驅動IRs的同源重組REP 編碼產物控制質粒的穩定性STB REP的結合位點接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等均與2m質粒類似。酵母克隆表達質粒的構建含有ARS的YRp質粒的構建 ARSkb，染色體上每30-40kb就有一個ARS元件。酵母菌自主復制型質粒的構建組成包括復制子、標記基因、提供克隆位點的大腸桿菌質粒DNA。 以ARS為復制子的質粒稱為YRp 上述兩類質粒在釀酒酵母中的拷貝數最高可達200個，但培養幾代 以2m質粒上的復制元件為復

8、制子的質粒稱為YEp后，質粒的丟失率高達50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。酵母克隆表達質粒的構建含有CEN的YCp質粒的構建 CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關的序列 將CEN DNA插入含ARS的質粒中，獲得的新載體稱為YCp YCp質粒具有較高的有絲分裂穩定性，但拷貝數只有1 - 5個含有TEL的YAC質粒的構建酵母克隆表達質粒的構建含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質粒的構建 在大腸桿菌質粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標記基因，構建出來的質粒稱為Yip。目的基因表達盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區域。D

9、 酵母的轉化系統6 外源基因在酵母中的表達轉化質粒在酵母細胞中的命運酵母菌的轉化程序用于轉化子篩選的標記基因酵母的轉化程序酵母原生質體轉化法 早期酵母菌的轉化都采用在等滲緩沖液中穩定的原生質體轉化法在Ca2+和PEG的存在下，轉化細胞可達原生質體總數的1-2%。但該程序操作周期長，而且轉化效率受到原生質再生率的嚴重制約。 原生質體轉化法的一個顯著特點是，一個受體細胞可同時接納多個質粒分子，而且這種共轉化的原生質體占轉化子總數的25-33%。酵母的轉化程序堿金屬離子介導的酵母完整細胞的轉化 釀酒酵母的完整細胞經堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質粒DNA，而且具有下列特

10、性：吸收線型DNA的能力明顯大于環狀DNA，兩者相差80倍共轉化現象極為罕見酵母的轉化程序酵母電擊轉化法 酵母菌原生質體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質粒DNA，但在此過程中應避免使用PEG，它對受電擊的細胞具有較很大的負作用電擊轉化的優點是不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養條件適用范圍廣，而且轉化率可高達105 / mg DNA。轉化質粒在酵母細胞中的命運單雙鏈DNA均可轉化酵母菌，但單鏈的轉化率是雙鏈的10-30倍；含有復制子的單鏈質粒進入細胞后，能準確地轉化為雙鏈并復制；不含復制子的單鏈質粒進入細胞后，能高效地同源整合入染色體這對于體內定點突變酵母基因組極為有利；克隆在YIp整合型質粒上的

11、外源基因，如果含有受體細胞的染色體DNA的同源序列，會發生高頻同源整合，整合子占轉化子總數的50-80%。用于轉化子篩選的標記基因 用于酵母菌轉化子篩選的標記基因主要有營養缺陷型互補基因和顯性基因兩大類： 營養缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE 但對于多倍體酵母來說，篩選營養缺陷型的受體非常困難。營養缺陷型的互補基因用于轉化子篩選的標記基因 顯性標記基因 顯性標記基因的編碼產物大都是毒性物質的抗性蛋白 aph 氨基糖苷轉移酶 抗G418 cat 氯霉素乙酰轉移酶 抗氯霉素 dhfr 二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 銅離

12、子螯合物 耐受銅離子 suc2 蔗糖轉化酶 耐受高濃度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑標記基因編碼產物遺傳表型E 酵母的表達系統6 外源基因在酵母中的表達外源基因在酵母菌中表達的限制因素酵母菌啟動子的可控性酵母菌表達系統的選擇酵母啟動子的可控性 溫度控制型啟動子a - a a 型啟動子：釀酒酵母有a和a a兩種單倍體，分別由MATa和MATa aa 型啟動子hmla a2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型啟動子 受體細胞基因組 重組質粒a 型啟動子hmla a2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型啟動子a a2a a12535兩個等位基因決定。a a1因子決定a

13、 a細胞特征表達a a2因子阻遏a細胞特征表達a1-a2阻遏a a細胞特征表達編碼a a2因子的基因突變型hmla a2-102能產生a a2變體，它能滅活a1，同時阻遏a型酵母啟動子的可控性釀酒酵母超誘導型啟動子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導效果不明顯，基因基底水平表達GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導時，GAL4高效表達，GAL1、GAL1、GAL10超高效表達GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由 G A L 1 G A L 7 和 G A L 1 0基因編碼外源基因在酵母中表達的限制因素外源基因穩態mRNA的濃度外源基因mR

14、NA的翻譯活性酵母菌對密碼子的偏愛性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個密碼子編碼的。酵母表達系統的選擇 釀酒酵母的基因表達系統最為成熟，包括轉錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫釀酒酵母表達系統酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達。 釀酒酵母表達系統的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達系統來彌補。酵母表達系統的選擇 乳酸克魯維酵母的雙

15、鏈環狀質粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產的高效表達穩定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也乳酸克魯維酵母表達系統能穩定遺傳40代以上。 乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優于釀酒酵母表達系統。酵母表達系統的選擇 巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養菌，能在低廉的含甲醇培養基中生巴斯德畢赤酵母表達系統長，甲醇可高效誘導甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達，因此生長迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子、表達的可誘導性是巴斯德畢赤酵母表達系統的三大優勢。但甲醇易揮發，操作條件差。 由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復制型載體，所以外源基因的表達序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情

16、況下，外源基因的有經濟價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統中獲得成功表達。高效表達在很大程度上取決于整合拷貝數的多寡。目前已有50余種具酵母表達系統的選擇 多型漢遜酵母也是一種甲基營養菌。其自主復制序列HARS已被克多型漢遜酵母表達系統隆，并用于構建克隆表達載體，但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細胞有絲分裂時顯示出不穩定性。所不同的是，HARS質粒能高頻自發地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以連續整合100多個拷貝， 目前，包括乙型肝炎表面抗原在內的數種外源蛋白在該系統中獲得因此重組多型漢遜酵母的構建也是采取整合的策略。成功表達。F 利用重組酵母生產乙肝疫苗6 外源基因在酵母中的表達 由

17、乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴重的傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當一部分人可能轉化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產對預防病毒感染具有重大的社會效益，而利用重組酵母大規模生產乙型疫苗為其廣泛應用提供了可靠的保證。乙型肝炎病毒的結構與性質 乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，具有感染力的病毒顆乙型肝炎病毒的結構粒呈球面狀，直徑為42 nm，基因組僅為3.2 kb。病毒顆粒的主要結構蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內的蛋白成份

18、包括核心抗原（HBcAg）、病毒DNA 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的1000倍。包裝蛋白共有三種轉膜糖蛋白：S、M、L多肽。乙型肝炎病毒的結構與性質乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因ATGATGATGTAA108 aa55 aa226 aapreS1preS2SS 多肽226 aaM 多肽281 aaL 多肽399 aa乙型肝炎病毒的結構與性質 乙肝病毒在體外細胞培養基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫傳統乙肝疫苗的制備苗是從病毒攜帶者的肝細胞質膜上提取出來的。雖然這種質膜來源的疫苗具有較

19、高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規模產業化。產乙肝表面抗原的重組釀酒酵母 20世紀80年代開始選擇釀酒酵母表達重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動子控制下，轉化子能表達出具有免疫活性的重組蛋白，它在細胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結構和形態均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。 目前，由釀酒酵母生產的重組HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化重組產物的最終產量可達細胞總蛋白量的1%-2%。 進一步的研究表明，M多肽和L多肽對S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構成的復合型乙肝疫苗還可以誘導那些對S抗原缺乏響應的人群的免疫反

20、應。產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母的構建PARS2Bgl II5 AOX1HBsAgPHIS43 AOX1Bgl IIpBSAG15111 kbBgl II5 AOX1 HBsAgPHIS43 AOX1his+的轉化子重組分子轉化his-的受體細胞染色體DNA產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母重組巴斯德畢赤酵母的性能 由于巴斯德畢赤酵母染色體DNA上還擁有第二個乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養基上生長。 重組菌首先在含有甘油的培養基中培養，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導HBsAg表達，最終S蛋白的產量可達細胞可溶性蛋白總量的3%在大規模的生產

21、過程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個240L的發酵罐中培養，最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬份乙肝疫苗。G 酵母糖蛋白生產的人源化改造6 外源基因在酵母中的表達 除抗體外，哺乳動物絕大多數糖蛋白的半衰期和功能依賴于糖鏈末端的唾液酸，其它裸露的末端糖（如甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖等）會被糖特異性的受體或凝集素清除。由于不少藥用糖蛋白需要唾液酸化，因此其生產目前只能依靠哺乳動物受體，因為后者能進行人樣化的N-糖基化反應，包括在末端加唾液酸的能力。酵母和絲狀真菌作為重組蛋白表達系統，與哺乳動物細胞相比，具有較高的重組蛋白表達率、較短的發酵周期、能在化學成分確定的培養基中生

22、長等很多優勢。然而，野生型酵母往往將高甘露糖型的多糖鏈加在蛋白質上，直接影響表達產物在人體內的穩定性與功效。ERER兩種多糖合成途徑的比較人類糖蛋白側鏈多聚糖的成熟，涉及下列基因編碼的酶系：MnsI： a-1,2-甘露糖苷酶 IMnsII：a-1,2-甘露糖苷酶 IIGnTI： -1,2-N-乙酰葡糖胺轉移酶 IGnTII：-1,2-N-乙酰葡糖胺轉移酶 IIGalT： -1,4-半乳糖苷轉移酶SiaT： a-2,6-唾液酸苷轉移酶巴斯德畢赤酵母細胞中不存在上述酶系。巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephe

23、n R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006敲除4個基因，摧毀巴斯德畢赤酵母原有的超糖基化系統： Doch1，Dpno1，Dmnn4B，Dbmt2導入9個基因，構建人的糖基化系統： UgnT：小鼠的UDP-N-乙酰葡糖胺轉運蛋白 UgnT：克魯維酵母的UDP-N-乙酰葡糖胺轉運蛋白 MnsI：小鼠的a-1,2-甘露糖苷酶 I MnsII：果蠅的a-1,2-甘露糖苷酶 II GnTI：人的-1,2-N-乙酰葡糖胺轉移酶 I GnTII：大鼠的-1,2-N-乙酰葡糖胺轉移酶 II GalE：裂殖酵母的半乳糖差向異構酶 GalE：果蠅的UDP-半乳糖轉運蛋

24、白 GalT：人的-1,4-半乳糖苷轉移酶YSH577rEPO巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPOJC308 WTRDP750-1,N-GlcNAc-1,4-GlcNAc-1,2-GlcNAc-1,4-Mana-1,6-Mana-1,3-Mana-1,2-Man-1,4-Gal巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Ste

25、phen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPO再導入5個基因，構建末端唾液酸的添加系統： GNE：人的UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶 / SPS：人的N-乙酰甘露糖胺丙酮酸-9-磷酸合成酶 CSS：人的CMP-唾液酸合成酶 CST：小鼠的CMP-唾液酸運輸因子 ST： 人的唾液酸轉移酶與酵母II型轉膜定位肽 遺憾的是，YSH577株并未像預期的那樣在糖基末端有效添加唾液酸。N-乙酰甘露糖胺激酶融合體巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Ste

26、phen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPO改善唾液酸化反應的效率：優化GNE、SPS、CSS、CST基因的密碼子；構建其它形式的唾液酸轉移酶（ST）融合肽，發現來自小鼠a-2,6-ST的催化功能域與釀酒酵母甘露糖基轉移酶1將上述五個基因全部克隆在一個表達載體上，并用該表（Mnt1）的靶向信號肽相融合的嵌合體，特別有效；達載體轉化YSH577株，獲得YSH597株。巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et

27、al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPOJC308 WTYSH597-1,N-GlcNAc-1,4-GlcNAc-1,2-GlcNAc-1,4-Mana-1,6-Mana-1,3-Mana-1,2-Man-1,4-Gala-2,6-SiaRDP750重組巴斯德畢赤酵母分泌的rEPO的鑒定JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551YSH577rEPO重組rEPO的HPLC圖譜分析：重組巴斯德畢赤酵母分泌的rEPO的鑒定JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551YSH577rEPO重組

28、rEPO的血細胞比容分析：YSH551株YSH597株注射第 8 天注射第15天H 酵母轉錄機器的基因工程綜合改造6 外源基因在酵母中的表達 化石能源的日益消耗大大促進了可再生型生物燃料（如乙醇等）的開發與生產。然而，大規模發酵生產燃料乙醇的關鍵是酵母對高濃度乙醇和葡萄糖的耐受性。長期以來，人們普遍關注的是對乙醇生物合成基因和耐受基因的遺傳操作，這些努力雖然取得了顯著的進步，但似乎觸及了極限。基因工程改良能否突破這一極限呢？Hal Alper等人提出的所謂轉錄機器綜合基因操作戰略（Global transcription machineryengineering，gTME）讓我們看到了新的希望

29、。釀酒酵母轉錄機器的定向改造在釀酒酵母中，乙醇生物合成基因與其他看家基因一樣，由RNA聚合酶 II 負責轉錄。RNA聚合酶 II 系統包含 75 種一般轉錄因子或共激活因子，其中最關鍵的是TFIID復合物，包含TATA-BOX結合蛋白（TBP，由基因 SPT15 編碼）及其及 14 種激活因子（TAFs）。有證據顯示，TATA-BOX結合蛋白的突變會改變RNA聚合酶對啟動子的特異性識別性質，進而影響眾多不同基因的表達譜。這便是轉錄機器綜合基因操作戰略的Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2006理論基礎。TATA-BOXTBPTAFsTFIID complex釀酒酵母轉錄機器的定向改造 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2006利 用 易 錯 P C R 技 術 構 建SPT15的突變文庫，轉入釀酒酵母標準單倍體BY4741株，該單倍體含有內源性野生型的SPT15染色體拷貝。然后在逐次提高的高濃度乙醇和葡萄糖存在下篩選耐受突變株。當篩選壓力增加到6%的乙醇和120g/L的葡萄糖時，獲得spt15-300突變株，它相對野生株的耐受倍數達13倍