1、-研究論文-兔IL-6基因真核表達載體的構建及其對pcDNA-VP60DNA疫苗佐劑效應研究張夏蘭(重慶市巴南區動物疫病預防控制中心，重慶401320)摘要：為研究兔白介t6(interleukin6.IL-6)真核表達質粒(pcDNA.】L4)對核酸疫苗免疫效果的影響，本文構建了真核表達質pcDNA-IL-6,并將其與核酸疫苗pcDNA-VP60聯合免疫家兔，以pcDNA-VP60和質粒載體pcDNA3.1(+)作對照.用血兼抑制試驗檢測試驗兔體內特異性抗體水平。結果表明：真核重組質UpcDNA-IL-6時重組質粒pcDNA-VP60均具有免疫增強作用，從免疫后7d到70d,pcDNA-VP

2、60/pcDNA-IL6聯合免疫組杭體水平均高于pcDNA-VP60免疫組，是異具有顯著統計學意義。關鍵詞：兔病毒性出血癥；DNA疫苗；佐劑；白細胞介素6中圖分類號：S852.659.1文獻標志碼：A文童編號：1674-6422(2012)05-0012-04ENHANCEMENTOFEUKARYOTICEXPRESSIONPLASMIDpcDNA-IL-6ONIMMUNERESPONSEOFDNAVACCINEpcDNA-VP60AGAINSTRABBITHEMORRHAGICDISEASEVIRUSZHANGXia-Ian(ChongqingBananAnimalDiseaseContro

3、lCenter,Chongqing401320,China)Abstract:ToinvestigatetheeffectofeukaryoticexpressionplasmidpcDNA-IL-6ontheimmuneresponseofDNAvaccineagainstRabbithemorrhagicdiseasevirus(RHDV),eukaryoticexpressionplasmidpcDNA-VP60expressingRHDVVP60proteinwereconstructedandinoculatedintorabbitsaloneorsimultaneouslywith

4、pcDNA-IL-6.Hemagglutinationinhibition(HI)testwasusedtodetectRHDVantibodylevel.TheresultsindicatedthatpcDNA-IL-6enhancedtheimmuneresponseofpcDNA-VP60.TheHIantibodylevelinpcDNA-VP60+pcDNA-IL6groupwassignificantlyhigherthanpcDNA-VP60alonegroup(P<0.01)asdetectedfrom7to70dayspostinoculation,theantibod

5、ylevelofgrouppcDNA-VP60+pcDNA-IL6wassignificantlyhigherthangrouppcDNA-VP60andgrouppcDNA3.1(P<0.05orP<0.01)Keywords:Rabbithemorrhagicdisease(RHD);DNAvaccine;adjuvant;interleukin6(IL-6)收稿日期：2012-06-22作者簡介：張夏蘭，女，碩士，獸醫師，主要從事畜禽傳染病研究和動物疫病預防控制工作白介素6(interleukin6,IL-6)是一種多功能細胞因子，又稱為B細胞分化因子、干擾素J32及肝細胞刺

6、激因子。哺乳動物的白介素6具有廣泛的生物學活性，兒乎能影響免疫系統的所有細胞，在調節免疫應答、影響急性期的蛋白應答和造血功能等方面發揮重要作用，并與其他細胞因子相互協調，共同構成復雜的細胞因子網絡。研究表明，IL-6具有免疫佐劑效應，能增強免疫應答，但將細胞因子重組蛋白作為免疫佐劑，其主要缺陷是半衰期短，活性易受內環境如PH值、各種水解酶及血漿蛋白的影響"T。有資料顯示，細胞因子基因真核表達質粒在機體內部可產生與自身機體細胞因子十分相似的生物學活性'7。同時以重組質粒表達的細胞因子，即細胞因子分子佐劑，可以克服重組蛋白的缺陷，從而在DNA疫苗這個領域中得到更多的重視和研究。分

7、子佐劑一次少量接種即可在機體內長時間低量表達，而且表達產物接近天然構象，是體內存在的免疫效應因子，對機體無毒副作用。因此，本研究構建了真核表達質粒pcDNA-IL-6,并與PCDNA-VP60聯合免疫試驗兔，分析其對家兔免疫應答的影響。1材料與方法1.1試驗動物農戶處購買的1月齡左右的兔病毒性出血癥(rabbithaemorrhagicdisease,RHD)非免疫兔30Ho1.2質粒和菌種重組質粒pMD18-T-IL-6和真核表達質粒pcDNA-VP60系本人構建并保存。1.3試劑人“O”型紅細胞由雅安市血站提供；Lipofecter脂質體轉染試劑盒購自碧云天生物技術研究所；溶菌酶PEG80

8、00、NH4AC、異丙醇、NaOH、胰蛋白腺、酵母抽提物、小牛血清、葡萄糖、醋酸鈉、冰乙酸、氯仿、苯酚、無水乙醇均為分析純。1.4真核表達質粒pcDNA-IL-6的構建將重組質粒pMD18-T-IL-6轉化JM109感受態細菌，37f培養12h后，抽提質粒并純化。重組質粒經限制性內切酶HwdDI和丘ORI雙酶切后，回收IL-6基因，與經同樣雙酶切處理的pcDNA3.1(+)質粒進行連接。連接體系如下：IL-64.5頭L、pcDNA3.10.5冬、SoltionI5.0aL,加到反應管中，混勻，16P連接過夜。將連接產物轉化JM109細菌，37*t培養12h后，抽提質粒。經過酶切和PCR鑒定為陽

9、性的重組質粒，送寶生物(大連)有限公司進行測序。重組質粒命名為pcDNA-IL-6。15質粒的大提取及純化用含Amp的LB液態培養基對含有pcDNA3.1(+)、pcDNA-IL-6和PCDNA-VP60質粒的大腸桿菌JM109進行大最培養,按照堿裂解法進行質粒的大量抽提，并采取PEG(聚乙二醇)沉淀法對質粒進行純化。方法均參照文獻9進行。1.6質粒的脂質體包被質粒/脂質體復合物的制備，按照文獻10方法進行。分別制備pcDNA3.1/脂質體復合物、pcDNA-IL-6/pcDNA-VP60/脂質體復合物(兩種質粒的比例為3:10)和pcDNA-VP60/脂質體復合物。1.7動物分組及免疫篩選3

10、0只1月齡非免疫兔，隨機分成3組，分別通過腿部肌肉分點注射。免疫pcDNA3.1/脂質體復合物、pcDNA-IL-6/pcDNA-VP60/脂質體復合物和pcDNA-VP60/脂質體復合物,質粒免疫劑最為500ng,免疫2次，兩次免疫時間間隔20d。分別于免疫后d7、14、21、28、35、70對各組試驗兔耳靜脈采血，分離血清，檢測特異性免疫抗體。免疫d70后用兔病毒性出血癥病毒(Rabbithaemorrhagicdiseasevirus,RHDV)滴度10'的活病毒進行攻毒，劑量為0.5mL/只，腿部肌肉注射。攻毒后觀察1周內試驗兔的發病、死亡情況，計算攻毒保護率。1.8特異性抗體

11、的檢測及分析采用血凝抑制(HI)試驗(GBm496.54-2(X)8):取“V”型96孔微量反應板1塊，用微量吸液器每孔加生理鹽水2SHL,隨后取待測兔血清25nL,從第1排1孔開始,依次倍比稀釋至第1排最后1孔，棄掉2SjiLo將兔病毒性出血癥血凝抗原稀釋成4單位，每孔加4單位兔病毒性出血癥血凝抗原25|iL,放震蕩器上混勻，置濕盒內，37X：作用10min后，每孔加1%人。型血紅細胞25jiL,再放微量震蕩器上混勻，置濕盒內，37P作用30min后觀察結果，以能完全抑制紅細胞凝集的血清最高稀釋倍數作為血清的血凝抑制價。同時設陰陽性對照。應用SPSS11.0按方差分析法對同一時間段不同組別、

12、不同時間段同一組織試驗兔的血清特異性抗體含量進行統計學處理。2結果2.1真核表達質粒pcDNA-IL-6構建結果通過質粒PCR、HindHI和EcoRI雙酶切鑒定結果表明，1L-6基因成功克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+沖。測序結果顯示克隆到pcDNA3(+)上的基因大小為726bp,與目的基因大小一致(圖1);且插入的基因序列與目的基因片段，完全吻合，即IL-6基因按照正確的閱讀框架插入到PCDNA3.1(+)質粒中，pcDNA-IL-6真核表達質粒構建成功。2.2特異性抗體檢測結果pcDNA-IL-6/pcDNA-VP60/脂質體復合物和pcDNA-VP60/脂質體復合物免疫試驗兔之

13、后，均產生了不同程度的特異性抗體。2000750Ml123M2bp726f圖1pcDNA-IL-6雙酶切及PCR鑒定結果Fig.lIdentificationofpcDNA-IL-6digestedbyrestrictionenzymeandPCRresult1:pcDNA-IL-6雙酶切產物；2,3：PCR結果；Ml:DNA分子量標準(DL2000);M2:DNA分子量標準(DL15000)1:pcDNA-IL-6digestedbyrestrictionenzymeHindHIandEcoRI;2,3:PCRresult;Ml:DNAMarker(DL2000);M2:DNAMarker(

14、DL15000)各實驗組與對照組相比,均具有極顯著統計學意義（P<0.01）。其中，pcDNA-lL-6/pcDNA-VP60/脂質體復合物免疫組產生的抗體水平高于免疫pcDNA-VP60/脂質體復合物組。首免后特異性抗體逐步上升,免疫d28,pcDNA-IL-6/pcDNA-VP60/脂質體復合物誘導抗體達到峰值水平，而pcDNA-VP60/脂質體復合物在免疫后d3S,其抗體水平才達到峰值（表1）。2.3pcDNAIL-6的免疫佐劑效應真核表達質粒pcDNA-IL-6對pcDNA-VP60的佐劑效應在二免后1周表現出來，免疫后第28、35、70d,pcDNA-VP60DNA+pcDNA

15、-IL-6免疫誘導產生的抗體水平高于pcDNA-VP60DNA免疫誘導產生的抗體水平（圖2）,差異具有顯著統計學意義（P<0.01）。2.4攻毒試驗結果攻毒dl,對照組有實驗兔死亡，d2未注射pcDNA-IL-6真核質粒組的實驗兔開始死亡,d4之后無實驗兔死亡（表3）。對病死兔進行制檢,其病理變化表現為:氣管和支氣管黏膜充血肝腫大,呈黃褐色，質脆；脾臟腫大，呈黑紫色；腎呈暗紅色,2086420n1i-堪金岑表1特異性抗體檢測結果TabletAntibodyresponsesinducedbydifferentmethods組別（Group）Od7d14d21d28d35d70dpcDNA

16、3.10.60±0.540.80±0.440.60±0.540.60±0.540.60±0.540.60±0.540.60±0.54pcDNA-VP600.80±0.833.60±0.545.8()±0.838.00±1.009.00±1.0010.40±0.5410.40±0.54pcDNA-IL-6/pcDNA-VP600.80±0.833.80±0.838.00±1.009.40±0.5411.60±

17、0.5411.60±0.8911.80±1.09圖2pcDNA3.1,pcDNA-VP60和pcDNA-IL-6/pcDNA-VP60免疫后兔血清抗體變化曲線Fig.2HIantibodytitercurveinrabbitsimmunizedwithpcDNA3.1,pcDNA-VP60andpcDNA-IL-6/pcDNA-VP60表3攻毒保護試驗統計結果Table3TheresultofprotectivetestagainstRHDVinrabbits蛆別Group試驗免數（只）No.oftotalrabbits病死兔數（只）No.ofdeadrabbits保護率（

18、%）ProtectionratepcDNA3.110100pcDNA-VP6010460%pcDNA-IL-6/pcDNA-VP6（）100100%被膜下和切面有大量出血點；肺表面有大小不等的出血塊，嚴重者甚至整葉肺出血；膀胱內有黃褐色較濃稠的尿液；淋巴結腫大。3討論中國國內至今還沒有成熟的RHDV抗體ELISA檢測試劑盒，血凝抑制試驗是比較傳統的一種血清抗體檢測方法，因其操作簡單、穩定性好，在RHDV抗體的檢測上得以廣泛應用，故本研究選擇血凝抑制試驗(GB仃1496.54-2008)作為試驗兔血清抗體檢測方法。本研究用pcDNA-IL-6與pcDNA-VP60聯合免疫實驗兔，對免疫后各實驗組

19、抗體動態變化的分析發現，pcDNA-IL-6在疫苗誘導免疫應答的過程中都表現出了明顯的佐劑效應。抗體水平變化的總體趨勢是：從免疫后7d到70d,pcDNA-IL-6+pcDNA-VP60DNA疫苗誘導產生的抗體滴度顯著高于pcDNA-VP60DNA疫苗，差異具有極顯著統計學意義(PvO.Ol)o免疫后70d,pcDNA-VP60DNA+pcDNA-IL-6免疫組抗體水平沒有降低，pcDNA-VP60核酸疫苗免疫組的抗體水平明顯下降，此時前者比后者抗體水平高出4倍以上，差異具有極顯著統計學意義(PvO.Ol)o試驗結果表明pcDNA-IL-6與疫苗聯合免疫時可促進機體產生快速持久的免疫應答，pc

20、DNA-IL-6對pcDNA-VP60DNA疫苗免疫具有明顯免疫佐劑效應。攻毒試驗結果表明，攻毒保護率與機體的抗體水平基本一致。抗體水平高的實驗兔的保護率也高，相反產生抗體水平低的實驗組兔在受到強毒攻擊時保護率就低。說明分子佐劑pcDNA-IL-6在增強DNA疫苗的免疫力、抵抗強毒攻擊等方面發揮重要作用。參考文獻郭斯，金寧一，張應玖.等.共表達HIV-1與IL-6核酸疫苗質粒誘導小鼠免疫原性的研究U1.中華徽生物學和免疫學雜志，2002,22(2):174.1 郭斐，陸柔劍，孫朝暉，等.非復制重組痘苗病毒中白細胞介素6的表達及其對重組病毒免疫效果的形響J.中華實驗和臨床病毒學雜志,2002.16(2):136-141.3J龍章富，高榮，孟民杰，等.脂質體包裹豬白細胞介素6基因對豬帶絳蟲抗原基因