1、先天性巨結腸患兒一氧化氮合酶的免疫組織化學觀察先天性巨結腸是兒科較常見的疾病，新生兒的發病率為1/20 0001/30 0001。其病理表現主要為結腸遠端神經節細胞完全缺乏。現已證實一氧化氮（NO）是人類腸道非腎上腺非膽堿能神經的遞質，能有力地松弛平滑肌。我們采用一氧化氮合酶（NOS）免疫組織化學方法間接反應NO的情況，以了解在先天性巨結腸擴張段，移行段，狹窄段NOS的分布狀況，探討NO在先天性巨結腸發病中的意義。 一、材料與方法1標本的收集與處理：收集1998年內先天性巨結腸新鮮標本10份，患者年齡10 d3歲，其中新生兒5例。每例分別取擴張段，移行段，狹窄段3個部位全層腸壁。先天性巨結腸的

2、診斷均依據病史，體征，鋇灌腸綜合判斷確診，術后均經常規病理檢查證實。2免疫組織化學染色技術：所有標本均做6 m厚冷凍連續切片，免疫組織化學采用SP法染色，NOS多克隆抗體選用Santa Cruz公司產品，神經元特異性烯醇化酶（NSE）、S-100蛋白單克隆抗體選用Zymed公司產品，顯示系統選用Histostain-SP試劑盒，DAB顯色。所有染色均用已知陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。所有標本同時行常規石蠟切片，HE染色。3免疫組織化學結果判斷：以腸壁粘膜下及肌間神經叢內NOS、S-100、NSE 陽性著色的神經節細胞、神經纖維的有無，增生或減少作為觀察指標。二、結果1大體觀察：

3、結腸的一部分顯著擴張、肥厚，直徑可達56 cm。而狹窄部分直徑僅為1 cm，腸壁無明顯增厚。移行段直徑界于擴張段和狹窄段之間。2HE染色：擴張段粘膜下層及肌間神經叢內均可見清晰的神經節細胞，部分神經節細胞內可見到尼氏小體。移行段：粘膜下層和肌間神經節細胞少，且明顯變性，胞膜不清，胞質濃染，尼氏小體消失，細胞核固縮。狹窄段：各層均未見神經節細胞，粘膜下及肌間神經纖維較擴張段顯著增粗。3免疫組織化學染色：NOS陽性的神經節細胞和神經纖維分布于擴張段和移行段的肌間神經叢及粘膜下神經叢內。以擴張段最多。擴張段：在肌間神經叢及粘膜下神經叢內出現NOS及NSE強陽性的神經節細胞（1）。且二者的分布基本一致

4、。S-100蛋白對此神經節細胞無免疫反應。在肌間神經叢、環行肌、縱行肌內及粘膜下可見NSE、S-100、NOS陽性神經纖維。這些纖維呈黃褐色，以S-100蛋白更清晰。三者均在環形肌分布最多,粘膜下層最少。S-100及NSE陽性纖維在各層均多于NOS陽性纖維，前兩者分布相似。移行段：肌間神經叢及粘膜下神經叢內有NOS和NSE陽性的神經節細胞，但明顯少于擴張段。粘膜下及肌層內NOS陽性的神經纖維亦少于擴張段。而S-100和NSE陽性的神經纖維與擴張段比較無明顯減少。狹窄段：各層均缺乏NOS和NSE陽性的神經節細胞。粘膜下及肌間僅見少量NOS弱陽性的神經纖維，大部分神經纖維呈NOS陰性反應。但NSE

5、，S-100蛋白仍成強陽性表達， 且神經叢較擴張段明顯增粗。1擴張段肌間神經叢神經節細胞NOS表達SP法400三、討論1990年Bult等2證實刺激胃腸道的非腎上腺非膽堿能神經可引起NO的釋放。由于NO半衰期很短，常規方法不易測到，但可通過對NOS的檢測間接反應NO的情況。本實驗通過NSE、S-100染色來顯示腸道神經節細胞及神經纖維的分布，將其作定位與NOS染色對照觀察。其結果，NOS和NSE陽性的神經節細胞分布基本一致。在擴張段，陽性著色的神經節細胞明顯多于移行段。在狹窄段，未見NOS和NSE陽性的神經節細胞。 NOS陽性的神經纖維在擴張段明顯多于移行段，而在狹窄段僅見少量弱陽性表達的神經

6、纖維。NSE、S-100陽性的神經纖維在狹窄段非但沒有減少，而且有增生。許多學者已證實增生的神經纖維是引起腸道平滑肌收縮的膽堿能神經。這樣，在狹窄段就造成了引起腸道平滑肌松弛的非腎上腺非膽堿能神經和引起平滑肌收縮的膽堿能神經的失衡，導致該段腸管持續性痙攣，進而發生巨結腸。 本實驗結果與Larsson等3的實驗結果一致。Okelly等4用還原性輔酶依賴性黃遞酶NADPH-d觀察先天性巨結腸病人腸道NOS的分布，其結果亦與本實驗所用免疫組織化學結果一致。Hanani等5在對3例先天性巨結腸病人NOS的定量分析中發現，在狹窄段，3例病人的平均NOS活性明顯低于擴張段。擴張段的含量與非先天性巨結腸病人

7、十分相似。作者單位：胡曉麗（天津市兒童醫院病理科 300074）王學文（天津市兒童醫院病理科 300074）詹江華（天津市兒童醫院外科 300074）參考文獻1，劉彤華.食管、胃、腸和肛門.見:劉彤華,主編.診斷病理學.北京：人民衛生出版社,1995.96.2，Bult H，Boeckxstaens GE，Pelckmans PA, et al. Nitric oxide as an inhibitory non-adrenergic non-cholinergic neurotransmitter. Nature，1990，345：346-347.3，Larsson LT，Shen Z，Ek

8、blad E，et al. Lack of neuronal nitric oxide synthase in nerve fibers of aganglionic intestine：a clue to Hirschsprungs disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr，1995，20：49-53. 4，OKelly TJ, Davies JR,Tam PK, et al. Abnormalities of nitric- oxide- producing neurons in Hirschsprungs disease：morphology and implications. J Pediatr Surg，1994，29：294-299.5，Hanani M，Louzon V, Udass