1、分子生物學綜述肌萎縮側索硬化癥的基因分析和基因治療進展姓名：胡莉琴學號：416522811456專業：神經病學單位：南昌大學醫學部肌萎縮側索硬化癥的基因分析和基因治療進展ABSTRACT:OBJECTIVE: Explore amyotrophic lateral sclerosis in the virulence genes and gene therapy are reviewed.DATA SOURCES: An computer-based online search of Pubmed database was undertaken to indentify articles pu

2、blished in English between 1993 and 2011 by using the keywords of “amyotrophic lateral sclerosis,gene,gene therapy” Chinese relevant article published from 2005-2011 were searched with computer in WEI PU.STUDY SELECTION；The data were checked firstly, the articles on amyotrophic lateral sclerosis wer

3、e collected. Inclusive criteria: Research amyotrophic lateral sclerosis of virulence genes; Amyotrophic lateral sclerosis gene therapy research. Exclusive criterial:Drug therapy; repetitive studies and experiential and individual literature report.DATA EXTRACTION: Totally 116 articles in all on amyo

4、trophic lateral sclerosis were collected ,of which 32 articles were selected.DATA SYNTHESIS: The pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis and SOD1 gene mutations may be relevant. When SOD1 genetic change, its code of protein conformation also produces change, enzyme activity reduced, scavenging

5、 free radicals ability. In amyotrophic lateral sclerosis gene therapy, neural factor can promote motor neuron in the survival and growth and repair, iRNA can delay the motor neuron degeneration of the development.CONCLUSION: For amyotrophic lateral sclerosis to explore its pathogenesis, for ALS gene

6、 therapy to lay the foundation, thus heal ALS.KEYWORDS: amyotrophic lateral sclerosis ;gene; gene therapy摘要：目的： 探討肌萎縮側索硬化癥在致基因和基因治療方面的研究進展。資料來源：應用計算機檢索Pubmed1993-2011年的文章，檢索詞為“amyotrophic lateral sclerosis,gene,gene therapy”,限定語言種類為中英文，同時計算機檢索維普數據庫2005-2011年期間的相關文章。資料選擇：對資料進行初審，選取有關肌萎縮側索硬化癥方面的研究。納入選

7、標準：1.研究肌萎縮側索硬化癥的致病基因等方面的研究。2肌萎縮側索硬化癥的基因治療的研究。排除標準：1.藥物治療的研究。2.重復研究及經驗和個人報告文獻。資料提煉： 共檢索到116篇關于肌萎縮側索硬化癥致病基因及基因治療等研究的文獻，入選32篇。資料綜合： 肌萎縮側索硬化癥的發病機制可能和SOD1基因突變有關。當SOD1基因發生改變時，其編碼的蛋白質構象也發生變化，酶活性減低，清除自由基能力下降。在肌萎縮側索硬化癥的基因治療方面，神經因子可以促進運動神經元的存活和生長及其修復，iRNA可以延緩運動神經元的變性發展。結論：對于肌萎縮側索硬化癥要不斷探索其發病機制，為ALS的基因治療打下基礎，從而

8、治愈ALS。關鍵詞：肌萎縮側索硬化癥;基因；基因治療0 引言肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是運動神經元病的主要類型，以脊髓前角和腦干運動神經核的運動神經元以及錐體束的慢性進行變性，上下運動神經元同時受損為特征。男性患者多見，一般在4050歲起病，發病后35年死亡。主要表現為脊髓和腦干所支配的肌肉無力、萎縮、肌束震顫、球麻痹和錐體束征；感覺系統一般不受累。目前ALS的病因和發病機制不明，也無特效治療。而分子生物學研究的迅速發展為ALS提供了新的治療策略。本文就近年來關于ALS的基因突變和基因治療的研究進行了綜述。1.新致病基因的發現和遺傳學

9、研究的進展SOD1基因突變與ALS有關已經被公認，在散發病例中占1%-4%，在家族遺傳病例中占20%左右。在家族ALS中是否存在其他的基因突變一直是學者們研究的重點。美國的Brown對16個沒有SOD1基因突變的常染色體顯性遺傳的ALS家族進行基因連鎖分析，發現第16號染色體至少有3個新的突變位點，還提出16%的ALS患者可檢測到SMN2基因。 家族性的ALS(FALS)分12種亞型：ALS1-ALS8、合并ALS的額顳葉癡呆綜合征、X性連鎖遺傳的ALS、ALS癡呆帕金森綜合征、進行性下運動神經元病等1。在不同的人群，約12-13%FALS和2%-7%的散發性ALS（SALS）患者有銅鋅超氧化

10、物歧化酶（SOD1）基因突變2。國內李曉光等發現FALS的E133V和H46R基因突變位點；在AL中，發現了V29A、N861和V47A突變位點。樊東升等發現作為本病易感基因的VEGF啟動子區多態分布與歐美白人不同，且在中國人群中發現VEGF啟動子區多態分布與起病年齡明顯相關3。目前還發現3個與FALS相關的基因，ALS1基因的SOD1，ALS2基因Alsin和ALS4基因Senetaxin。中國目前尚未見一個FALS位點報道，僅發現1例SOD1突變4，提示中國ALS具有與西方不同的發病機制，有不同的基因導致中國FALS的發生。2 SOD1基因突變的特點SOD1基因組DNA長12kb，含有5個

11、外顯子編碼153個氨基酸，組成33ku的金屬酶蛋白，具有清除自由基和抗氧化的功能。在FALS患者中，SOD1基因的2號外顯子編碼區發生插入突變導致mRNA的轉錄提前終止，使翻譯至第36號密碼子時遇到終止密碼子TAA，從而使SOD1蛋白質翻譯提前終止。正常的SOD1蛋白由153個氨基酸組成，而突變后的SOD1蛋白質為35個氨基酸組成的短肽。新突變的SOD1二級結構基本上保持了野生型SOD1中對應區域的二級結構，但改變了SOD1蛋白結構的整體活性，導致突變的SOD1蛋白的抗氧化損傷作用減弱，自由基產生增多，使細胞膜、線粒體、軸突受損，影響軸漿運輸5、6。3 基因治療3.1 神經營養因子的治療 隨著

12、對ALS研究的不斷深入，神經營養因子在ALS 治療中的作用逐漸受到重視，如睫狀神經營養因子（CNTF）、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、腦源性神經營養因子（BDNF）以及膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）等。多項研究表明，CNTF可延緩Wobbler小鼠疾病的發展，減少肌萎縮，促進運動神經元存活和生長7、8，但臨床結果不滿意9、10。研究表明，IGF-1可以促進神經元修復，增加損傷后脊髓運動神經元的存活率11。Sakowsk等通過對ALS患者進行IGF-1治療后發現，它可以延緩ALS的進展且對身體無副作用【12。但最近一項研究表明，皮下IGF-1治療并不能延緩ALS疾病的進展13。BND

13、F 在大腦神經元及膠質細胞中合成，可以明顯增大神經元胞體和促進軸突的生長。體外研究證實，100ng/ml的BDNF可有效地促進膽堿乙酰轉移酶免疫反應性運動神經元的存活14。GDNF不僅促進正常運動神經元的存活、降低細胞凋亡中自然發生的神經元死亡，還對受損的運動神經元具有營養保護作用。GDNF的神經營養保護作用比BDNF高75倍，比CTNF高650倍，是目前發現的活性最強的運動神經元神經營養因子。Mohajen等發現GDNF還能促進運動神經元存活和生長15。Storkebaum16將基因重組的VEGF經腦室內注入到ALS大鼠體內，發現治療鼠的發病時間和生存期分別延長17d和22d。但對人類ALS

14、的治療試驗尚在進行中，需進步觀察其療效和副作用。3.2 抗凋亡的基因治療細胞凋亡是ALS等的標志之一。對進行性運動神經元病（PMN）的模型，轉入表達抗凋亡的Bcl-2或膠質細胞源性的神經營養因子基因可預防運動神經元的凋亡，但對動物的生存期沒有影響。Anna等研究者17將PMN小鼠與帶顯性突變Wlds基因的小鼠雜交，產生的PMN/Wlds鼠狀和生存期較PMN小鼠有一定程度改善，推測可能與Wlds基因產物減輕PMN小鼠逆向轉運缺陷有關。3.3 RNA抑制基因表達的治療 2001年出現的RNA干擾技術（RNA interference,RNAi）,又稱基因沉默技術，是通過破壞細胞源性mRNA來阻止相

15、應基因表達，保護細胞免受病毒和其它遺傳因子的影響。Maxwell等18 的研究提示,在體外培養的小鼠成神經細胞瘤細胞 中穩定表達的人突 變SOD1使細胞對細胞毒的刺激( 環胞菌素- A) 很敏感，當用RNAi特異性減少突變SOD1表達時，可有效對抗環孢素-A引起的細胞死亡。Ralph和Raoul等19、20利用設計的一種慢病毒載體攜帶特異性抑制突變SOD1的RNAi，并將其注入ALS模型鼠的肌肉或脊髓內。檢測證實動物體內突變SOD1的表達顯著減少，腦干和脊髓中運動神經元的存活率明顯提高，同時可以有效的提高ALS模型鼠的運動能力以及延長其壽命。Xie等的研究結果提示，靶向抑制前列腺凋亡反應基因4

16、（Par-4）可能對變性運動神經元具有神經保護作用。Par-4來自脊髓前角的突觸小體和后突觸致密區，可能是導致運動神經元變性的級聯事件中的一個關鍵性環節。利用RNAi技術降低Par-1表達，可減低由突變SOD1引起的突觸小體處caspase-3活性和線粒體障礙，從而減緩神經元變性的發展。3.4 其它 最近發現ALS患者有編碼神經絲重鏈(NF-H)的基因突變，因此利用腺病毒載體介導人類神經絲輕鏈(NF L) 基因可以治療過度表達NF- H鼠，其發病和生存期平均延長了6周左右。由于神經絲輕鏈對神經絲重鏈介導 的ALS發病有保護作用，故推測其也可能具有一定的治療作用21。Jiming認為如果NF水平

17、增加出現在神經元的胞體內而不是軸突等處，可緩解ALS。并推測N F蛋白能減低運 動神經元中突變SOD1蛋白的毒性，原因可能是大量NF蛋白形成了一個有效的蛋白池來吸收氧自由基等毒性物質， 而避免后者對其他細胞器的損傷。4 結論 由于ALS發病機制可能涉及突變SOD1的“獲得毒性”、興奮性氨基酸毒性、線粒體障礙、軸突運輸障礙、氧化損傷及細胞凋亡等方式，因此有效的ALS治療策略應盡可能的兼顧多方面，且將副作用減到最低限度。從理論上講，致病基因的分析能夠為我們進一步認識疾病的病因學、摸清疾病的發病機制、闡明疾病的病理生理過程和開發藥物治療新靶點提供線索， 從而解決ALS在診療方面所帶來的諸多困惑。近年

18、來，盡管基因治療方法的基礎研究取得了一定成績，但離臨床應用還有很大距離。當前，ALS的臨床治療應以提高其生存率，緩解其痛苦為標準，不斷提高基因診療技術，使ALS患者得到早期診斷、早期治療，延長患者壽命，提高患者生活質量，盡可能治愈ALS。5.參考文獻1. Kunst C B.Complex genetics of amyotrophic laterl scerosis J.Am J Hum Gener,2004,75:933.2. Voterra A ,Trotti D,Tromba C,ct al.Glutamate uptaker inhibition by oxygen free rad

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