1、一、槍頭和EP管等的消毒滅菌1、 用去離子水配制0.1% （千分之一）的DEPC （劇毒物），須在通風櫥中小心 使用，避光，密閉4C保存；DEPC水是用DEPC（diethypyrocarbonate ，焦碳酸二乙酯）處理過并經高溫高壓消毒的 MiliQ 純水。經檢測不含 RNase、DNase 和 proteinase。2、 將槍頭和EP管放入0.1%的DEPC內，保證槍頭和EP管內都充滿0.1%的 DER3、避光、靜置、過夜（12-24 h ）4、裝槍頭和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，將槍頭或者EP管內的DEPC水 大致去除干后，裝起，包好5、121 攝氏度，30min6 180攝氏度

2、，干燥數個鐘頭（至少 3小時以上）。 注意：a、處理DEPC時需要戴乳膠手套、口罩！b、或者不用DEPC消毒，13 0C, 90min高壓滅菌（許多實驗室高溫滅 菌兩次）二、RNA提取注意事項1、組織RNA抽提失敗的兩大現象是：RNA降解和組織內雜質的殘留。關于降解問題，首先看一下為什么從培養細胞中抽提 RNA不容易降解。現有的 RNA抽提試劑，都含有快速抑制Rnase的成分。在培養細胞中加入裂解液，簡 單的混勻，即可使所有的細胞與裂解液充分混勻， 細胞被徹底裂解。細胞被裂解 后，裂解液中的有效成分立即抑制住細胞內的Rnase所以RNA得以保持完整。也就是說，培養細胞由于很容易迅速與裂解液充分

3、接觸， 所以其RNA不容易被 降解；反過來講，組織中的RNA之所以容易被降解，是因為組織中的細胞不容 易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制RNA活性的同 時能使組織變成單個細胞，降解問題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效 的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數比較多的時候 更加會有此感覺。這樣就產生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考 慮細胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase活性這個問題，而是祈禱破碎組織的速 度比細胞內的Rnase降解RNA的速度快。電動勻漿器效果較好，玻璃勻漿器 效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現象的。因此，

4、如果抽提出 現降解，原來用電動勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動 勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎100%能獲得解決。影響后續實驗的雜質殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法相應也不同。總之，如果出現降解 現象或者組織內雜質殘留現象，則必須對具體實驗材料的抽提方法/試劑進行優化。優化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動物，取相應部分的材料用于 RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白質 -用嘴碾磨， 腸胃抽提。2、抽提RNA的目的RNA用于不同的后續實驗，其質量要求不盡相同。cDNA文庫構建要求RNA 完整而無酶反應抑制物殘留； Northern 對 RN

5、A 完整性要求較高，對酶反應抑 制物殘留要求較低； RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高， 但對酶反應抑制物殘 留要求嚴格。投入決定產出； 每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，勞民傷財。3、樣品的收集/保存-影響降解的因素樣品離開活體 / 或者原來的生長環境后，樣品中的內源酶即會開始降解 RNA ，降解速度與內源酶含量及溫度有關。傳統上，只有兩個辦法可以徹底抑 制內源酶活性： 立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿； 切成小塊后立即投入液 氮冷凍。 這兩個辦法都要求操作快速。 后者適合所有的樣品， 而前者只適合細胞 及內源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。 具體地講， 植物組織，肝臟，胸

6、腺， 胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。4、樣品的破碎及勻漿 -影響降解和得率的因素樣品的破碎是為了徹底勻漿， 勻漿是為了使 RNA 徹底完整地釋放出來。 細 胞無須破碎即可直接勻漿， 組織需要破碎后才能勻漿， 酵母菌和細菌需要先用相 應的酶破壁后才能勻漿。 內源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中 通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程； 植物組織， 肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦， 脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將 組織的破碎和勻漿分開操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾 磨，最可靠的勻漿方法是使用電動勻漿器。

7、 使用液氮碾磨要特別注意一點： 在整 個碾磨過程中，樣品不得融化，因為冷凍后內源酶更容易起作用。5、裂解液的選擇 -影響操作方便程度，內源雜質殘留的因素常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點是要結 合純化方法一起考慮。 只有一個例外： 高內源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂 解液，以增加滅活內源酶的能力。6、純化方法的選擇 -影響內源雜質殘留，抽提速度的因素對于干凈的樣品，如細胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結果。 但對于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細菌等雜質含量很高的樣品，選擇合 適的純化方法是至關重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 R

8、NA 后續酶反應的雜質， 但價格較貴； 使用經濟而經典的純化方法， 如 LiCl 沉 淀等，也可以獲得滿意的結果，但操作時間長。7、RNA 抽提的“三大紀律八項注意” 紀律一：杜絕外源酶的污染。 注意一：嚴格戴好口罩，手套。注意二：實驗所涉及的離心管， Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。 注意三：實驗所涉及的試劑 /溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。紀律二：阻止內源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。注意五：選擇合適的裂解液。 注意六：控制好樣品的起始量。紀律三：明確自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系統在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。 注意八： R

9、NA 抽提成功的唯一經濟的標準是后續實驗的一次成功，而不是得率。8、RNase 污染的 10 大來源1）手指頭，手指頭是外源酶的第一來源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外， 口罩也必需戴， 因為呼吸也是一個重要的酶來源。 戴手套口罩的另外的好處是保 護實驗人員。2） 槍頭，離心管，移液器-單純的滅菌是不能滅活 Rnase的，所以槍頭和離 心管要用 DEPC 處理，即使是標明為 DEPC 處理過的。移液器最好是專用的， 用前用 75% 的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。3）水 /緩沖液一定要確保無 Rnase 污染。4）實驗臺面最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。5）

10、內源Rnase所有組織均含內源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。 液氮保存 /碾磨方法的確不方便，但對有一些內源酶含量很高的組織，卻是唯一 的辦法。6）RNA 樣品 RNA 抽提產物可能都會含痕量的 Rnase 污染。7）質粒抽提質粒抽提往往用 到 Rnase 降解 RNA ， 殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化， PCI 抽提。8）RNA 保存即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會導致 RNA 降解。長期保存 RNA 的最好辦法是鹽 /醇懸液，因為醇在低溫時抑制所有的酶活性。9） 陽離子 （Ca, Mg）在含這些離子時，80C加熱5分鐘會導致RNA被剪 切，故如

11、果 RNA 需要被加熱， 保存液需要含螯合劑 （1mM Sodium Citrate， pH 6.4）。10） 后續實驗所用的酶酶均有可能被Rnase 污染。9、RNA 抽提的 10 大竅門1：快速阻止 Rnase 活性樣品收集后快速冷凍，裂解時快速操作滅活Rnase。2：選擇合適的抽提方法高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。3：預判質量要求 Northern， cDNA 文庫構建對完整性要求高，RT-PCR， RPA（ Ribonuclease protection assa）y 對完整性要求不是很高。 RT-PCR 對純度 （酶 抑制物殘留） 要求很高。4：徹底勻漿是提高得率和降

12、低降解的關鍵。5：檢查 RNA 的完整性電泳檢測， 28S：18S =2：1 是完整的標志， 1：1 對大 部分實驗也是可以接受的。6：去除 DNA 用于 RT-PCR， array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。 7:降低外源酶的污染-不能從外面又導入酶。8：低濃度的核酸濃縮時， 要加入助沉淀試劑。 但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污 染。9：徹底溶解 RNA ，必要時可以 65C 加熱 5 分鐘。10:合適的保存方法 -短時間可以-20C保存，長期請保存于 -80C。 提高 RNA 得率首先要意識到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。高豐度 （2-4ug/mg）

13、的如肝 臟，胰腺，心臟，中豐度 （0.05-2ug/mg） 的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺， 卵巢，低豐度 （0.05ug/mg） 的如膀胱，骨，脂肪。1:裂解細胞使 RNA釋放出來-RNA如果不被釋放出來，得率是會降低的。 電動勻漿比其它勻漿方法效果更好， 但也可能需要結合其它得方法， 如液氮搗碎， 酶消化 （ Lysozyme/Lyticase） 2:抽提方法的優化。基于苯酚的方法的最大問題是分層不徹底和部分 RNA 的 丟失（不能全部將上清取出） 。分層不徹底是因為核酸和蛋白質含量高，可以用 增加裂解液使用量或者降低樣品量解決。 脂肪組織要增加一步氯仿抽提。 RNA 的 丟失可以用反抽方法

14、或者去除有機層后再離心的方法降低。 基于柱離心式方法的 最大問題是樣品過量。10、經典抽提小技巧1 ）Phenol 純化:將等體積的 1 : 1 Phenol/Chloroform 加入，劇烈混允 1-2 分 鐘。高速離心 2 分鐘。小心取上清 （80-90%）。決不能取到中間層。可以使用 等體積的反應液加入 Phenol/Chloroform 中，同樣再取出上清。將兩次的上清混 在一起用于核酸沉淀， 可以提高得率。 混允時不能太溫和， 也不要試圖取出全部 上清。2）70-80% 乙醇洗滌:洗滌時，一定要將核酸懸浮起來，才能保證殘留的鹽被 洗去。同時，在倒掉乙醇后，立即高速離心數秒，再用移液器

15、去除殘留的乙醇。 室溫靜置 5-10 分鐘后，溶解。11、特殊組織的抽提1 ）纖維組織:心臟 /骨骼肌等纖維組織抽提 RNA 關鍵在徹底破碎組織。這些組 織細胞密度低，故單位重量的組織 RNA 的含量就少，最好用盡可能多的起始量。 一定要在冷凍條件下將組織徹底磨碎。2）蛋白 /脂肪含量高的組織:腦 /植物脂肪含量高， PCI 抽提后，上清含白色絮 狀物。必須用氯仿再次對上清進行抽提。3）核酸/核酶含量高的組織: 脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。 在冷凍條件下碾磨 組織，再快速勻漿，能有效滅活核酶。但如果裂解液太粘稠 （因為核酸含量高 的緣故）， PCI 抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此

16、問題。多次 PCI 抽提可以去除更多殘留的 DNA 。如果加入醇后馬上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。溶解后用酸性 PCI 再次抽提，可以去除 DNA 污染。4）植物組織:植物組織比動物組織更為復雜。一般，大家都是在液氮條件下對 植物進行碾磨的， 所以內源酶作用使 RNA 降解的現象不常見。 如果降解問題不 能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內含雜質導致。 許多植物的內含雜質都會導致 殘留，之所以殘留，往往是因為這些雜質與 RNA 有一些相似性： 你沉淀我沉淀， 你吸附我吸附。 這些特點決定了它們是非常強的酶抑制劑。 目前，商品化的 RNA 抽提試劑經過小量調整， 可以適合幾乎所有的動物組織，

17、 但卻沒有一種商品化的 RNA 抽提試劑，可以適合大部分植物組織。12、樣品凍融的影響冷凍的樣品可能較大， 用于抽提 RNA 之前，需要切割。 切割過程中樣品往往出 現融化 （可能是部分融化）。冷凍的樣品抽提 RNA 前可能還要稱重， 這個過程 肯定會出現融化。 有時候， 液氮碾磨過程中也會出現樣品的融化； 或者冷凍樣品 不經過液氮碾磨直接加入裂解液中，在徹底勻漿前肯定會出現融化。實驗表明， 冷凍組織在融化過程中比新鮮組織更容易發生 RNA 的降解。可能的原因是： 凍 融過程破壞了細胞內的結構，使內源酶更容易與 RNA 直接接觸。13、RNA 質量的判斷通常，使用電泳判斷 RNA 的完整性，使

18、用 A260/A280 判斷 RNA 的純度。理 論上，完整的 RNA 擁有 28S：18S = 2.7：1 的比例，大部分資料則強調 28S： 18S = 2：1 的比例。事實是，除了細胞外，從其它樣品中抽提的 RNA 幾乎都 得不到2： 1的比例 （此結論使用 Agile nt Bioa nalyzer獲得）。RNA的電泳結 果受許多因素的影響，包括二級結構，電泳條件，上樣量，被 EB 飽和的程度 等。使用非變性電泳檢測 RNA，以DNA Marker做對照，如果2kb處的28S和 0.9kb 處的 18S 條帶清晰，且 28S： 18S > 1 ，該完整性可以滿足絕大部分后續 實驗

19、要求了。 A260/A280 是一個給大家帶來許多困惑的指標。首先要明確該指 標用于核酸的原始含義是：純的 RNA，其 A260/280 = 2.0左右。純 RNA是 因'， A260/A280 = 2 是果'。現在大家卻在拿 A260/A280 當因'用，認 為“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是純的”，自然會產生困惑。有興趣的話， 可以在您的 RNA 樣品中加入一點抽提中經常使用的試劑， 如苯酚，異硫氰酸胍， PEG 等，再測 A260/A280 比值。現實是，許多抽提 RNA 時使用的試劑，以 及樣品中的許多雜質都在 A260 和 A280 處附近有吸收，對 A260/A280 產生 影響。目前最具有指導性的做法是：對 RNA 樣品在 200-300 nm 范圍掃描。純 RNA 的曲線具有如下特點：曲線平滑， A230 和 A260 是兩個拐點， A300 接 近 0， A260/A280 = 2.0 左右， A260/A230 = 2.0 左右。如果沒有掃描數據，也一 定要測定 A260/A230 比值，因為該比值對所有影響酶反應的雜質的殘留更敏 感。要考慮設備的線形范圍（A260要處于0.1 - 0.5之間）。另外有兩個有用的