1、重組的DM分子是在DM連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng) 中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接 酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DM連 接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒(méi)有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連 接起來(lái)。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過(guò)提高T4噬菌體D7A 連接酶濃度或増加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA連接酶催化 DNA連接反應(yīng)分為3步：首先，T4 DNA連接酶與輔因子ATP形成W-ATP復(fù)

2、合物；然 后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5'磷酸基和3'軽基切口的D對(duì)上，使DNA腺昔化; 最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來(lái)。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷 相連。很多DNA聚合酶在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)會(huì)在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3'端加上一 個(gè)突出的堿基A。pUCm-T載體是一種已經(jīng)線性化的載依，載體每條鏈的3'端帶有一 個(gè)突出的T。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進(jìn)行正確的AT配對(duì), 在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的 重組載體。連接反應(yīng)的溫度在37T時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這

3、個(gè)溫度下粘末端的氫鍵 結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16£,連接12-16h （過(guò)夜），這樣既 可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。二.感受態(tài)制備原理細(xì)菌在0 ° C CaC4低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易 吸收外源DNA的感受態(tài)。三.B-半乳糖甘酶顯色反應(yīng)選擇法LacZ基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個(gè)基因，可以編碼B半乳糖核昔酶。半乳糖核昔酶是由4個(gè)亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解.用X-Gal為底物 進(jìn)行染色時(shí)，呈藍(lán)色。現(xiàn)在一些待定的質(zhì)粒（比如pUC/PBS等），常帶有B-半乳糖核昔酶的調(diào)控序列 和B半乳糖核昔酶N端1

4、46個(gè)氨基酸（a肽段）的編碼序列，在這個(gè)編碼序列里還 插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)（HCS），它并不影響lacZ的表達(dá)。另外，常用的大腸桿菌帶有 B半乳糖核昔酹C端部分序列（0肽段），的編碼序列。在各自獨(dú)立的情況下，這 些質(zhì)粒與大腸桿菌各自編碼的卩一半乳糖核昔酶片段都沒(méi)有酶的活性。只有當(dāng)攜帶a 肽編碼信息的克隆載體成功進(jìn)入宿主細(xì)胞，在培養(yǎng)基誘導(dǎo)物IPTG的誘導(dǎo)下，載體質(zhì) 粒能夠合成B半乳糖核昔酶N端（a肽段），這樣就與宿主細(xì)胞合成的半乳糖 核昔酶C端部分序列（B肽段）互補(bǔ)，形成完整的B半乳糖核昔酶活性蛋白。而當(dāng)外源基因插入到此種載體質(zhì)粒lacZ的多克隆位點(diǎn)后，會(huì)造成lacZ基因不能 表達(dá)，從而不能合成B

5、半乳糖核昔酶；而對(duì)于空載體，lacZ基因正常表達(dá)，通過(guò)a 互補(bǔ)合成B半乳糖核昔酶，分解培養(yǎng)基里的色素底物X-gal,最終形成藍(lán)色的化合 物，出現(xiàn)藍(lán)色菌斑。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：清洗，5個(gè)100ml錐形瓶（外加1個(gè)小的），6副培養(yǎng)皿，3個(gè)小試劑瓶, 接種環(huán)，涂布棒。準(zhǔn)備100ml超純水。溶液:LB300ml（液體50ml+50ml,固體100ml）,0. lmol/L CaC12 10ml, lOOmg/mlAmp 1 ml, 20mg/mlX-gal 1 ml, 200mg/ml IPTG 1 ml o大腸桿菌菌液lml。感受態(tài)細(xì)胞連接產(chǎn)物4管4x5= 20ul 做 4 份目的基因T載體T4連接酶10x沖

6、液4 x 4uL4xluL4x0. 5uL4xluL滅菌：5個(gè)lOOnd錐形瓶（外加1個(gè)小的），6副培養(yǎng)皿，3個(gè)小試劑瓶，接種 環(huán)，涂布棒，10ml超純水，LB培養(yǎng)基 1.5mlEP管，大小槍頭，過(guò)濾用具2副0. lmol/L CaC12實(shí)際配置20mg/ml X-gal X-gal為5-漠-4-氯-3引喙-B-D半乳糖昔。用二基甲醜 胺（DMF）溶解X-gal配制成的20mg/ml （取0. 02gX-gal,用DMF定容為lml）的貯存 液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光 照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20X：o X-gal溶液無(wú)須過(guò)濾除菌。（DMF二

7、甲基甲酰胺； Dimethylfo r mam ide； NtNDi methyl formamide； DMF； CAS： 68-12-2 理化性質(zhì)：無(wú)色、 淡的胺味的液體。分子式C3-H7-N-0o分子量73. 10。相對(duì)密度0.9445（25°C）。熔點(diǎn) -61°Co沸點(diǎn)152. 8°Co ） 溶于DMSO,溶解度可達(dá)20mg/mlo也溶于DMF溶于DMSO, 溶解度可達(dá)20mg/mlo也溶于DMF200mg/ml IPTG在0. 8ml蒸榴水中溶解0. 2g IPTG后，用蒸館水定容至lml,用 0. 22u m濾器過(guò)濾除菌，貯存于-20。（2。LB培養(yǎng)基

8、：配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)該在950 ml去離子水中加入：腹化蛋白腺10g酵母提取物 5g NaCl 10R揺動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解用5mol/LNa0H調(diào)pH至7. 3用去離子水定容至 1L在15psi高壓下蒸汽滅菌20min. （ 100mlLB培養(yǎng)基加入15g瓊脂粉為固體培養(yǎng) 基）0. lmol/LCaC12:取0. 11098g氯化鈣固體定容至10mlAmp （lOOmg/ml）:溶解0. lg氨節(jié)青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定 容至lml,用0.22 m m濾膜過(guò)濾除菌.實(shí)驗(yàn)過(guò)程（一）.目的基因片段與載體連接器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙 面離心管架，臺(tái)式

9、離心機(jī)，干式恒溫氣浴。試劑T載體，T4 DNA連接酶，連接酶緩沖液，無(wú)菌dd Water。操作步驟PCR產(chǎn)物與T載體直接連接：（1）事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在1416。C。（2）取4個(gè)滅菌的200ul M量離心管，加入：（需要調(diào)整）4ml目的基因； lml T 載體；0.5ml T4 DNA 連接酶（TAKARA, 350U/ul） ； lml 連接酶緩沖液 10 x buffer ； 3. 5 ml dd Water 總量 10ml 體系。（3）述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14° C干式恒溫儀（或14° C 水中）中保溫過(guò)夜（12-16h） &l

10、t;>（4）連接后的產(chǎn)物可以立即用來(lái)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或置4° C冰箱備用。（二）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備細(xì)菌轉(zhuǎn)化儀器：旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml微量離心管， 1.5ml微量離心管，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)， 超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)，恒溫?fù)u床，培 養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，濾膜和過(guò) 濾器試劑：E. coli 粛護(hù),LB 培養(yǎng)基,0. 1 mol/L CaC12 溶液，無(wú)菌 dd Water , LB培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無(wú)菌dd water, IPTG,

11、 X-galo步驟（1）在超凈工作臺(tái)中，將lml大腸桿菌菌液加入100ml LB液態(tài)培養(yǎng)基（不含 抗菌素），37X2搖床培養(yǎng)過(guò)夜。（2）取0.5ml上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50mL LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37°C下 250r/min 搖床培養(yǎng) 2'3h,測(cè)定 0D590 為 0. 35、0. 4 左右（<0.40.6,細(xì)胞數(shù)<108/mL, 此為關(guān)鍵參數(shù)！）。（注意：此步搖菌的時(shí)候，要有一管不加菌的LB培養(yǎng)液同時(shí)搖 菌）（3）將lml菌液加入到4支1.5mL預(yù)冷無(wú)菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置 10min,然后于 4°C, 5000rpm 離心 5min。（

12、4）將離心管倒置以倒盡上清液，加入lml冰冷的0. 1 mol/L CaC12溶液， 立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。（5）4乜，5000rpm離心5min,棄上清液后，用100 u L冰冷的0. 1 mol/L CaC12 溶液垂懸，插入冰中放置2h,可以直接用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，或立即放入-4攝氏度冰柜中 保藏。（6）事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42弋。（7）從-70£超低溫冰柜中取出一管（100 PL）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融 化后插入冰上，冰浴5、10min。（8）加入5uL連接好的質(zhì)粒混合液（DNA含量不超過(guò)100ng）,輕輕宸蕩后敖 置冰上20min。（9）輕輕搖勻

13、后插入42乜水浴中90s進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置 3min。（10）在超凈工作臺(tái)中向上述各管中分別加入300 p L LB培養(yǎng)基（不含抗菌素） 輕輕混勻，然后固定到揺床的彈簧架上37乜宸蕩lh。（11）在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液200 uL,分別滴到含合適抗菌素（Amp 100ug/L）的固體LB平板培養(yǎng)皿中，再在平板上滴加40 pL 20mg/ml X-gal, 7 u L 200mg/nil IPTG,用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：一個(gè)不含抗生素作為 對(duì)照組，玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂，菌液涂皿操作時(shí)， 應(yīng)避免反復(fù)來(lái)回涂布，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)菌的細(xì)胞

14、壁有了變化，過(guò)多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使 細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。）。（12）在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37X：恒溫培養(yǎng)箱中30min直到表 面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過(guò)來(lái)敖入37乜恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜。（13）在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面。（14）觀察平板上長(zhǎng)出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開(kāi)為好。注意白色菌 斑O（三）轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定器材旋渦混合器，小鑲子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管， 雙面離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)， 酒精燈，無(wú)菌牙簽，搖菌管。試劑LB培養(yǎng)基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試

15、劑，酶切需要 的限制性且酶及其緩沖液，65%甘油（65%甘油,0. lmol/LMgS04, 0. 025mol/L Tris Cl pH8. 0） o操作步驟 方法一：快速PCR篩選法（1）在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取4個(gè)邊緣清晰的白色菌落，并用記號(hào)筆 在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫(huà)圈做標(biāo)記編號(hào)。（2）在0. 2ml PCR微量離心管中配制25u 1反應(yīng)體系。dd water 16 u 110XPCR buffer （不含 MgC12） 2. 5 p 125mM MgC12 1. 5 U12. 5mmol/L dNTP 2 u 1 （每種 dNTP 終濃度 0加M）10 u mol/L Pr

16、imer 1 1 u 1 （12.525pmoles ）10umol/L primer2 1 u 1 （12.525pmoles）模板質(zhì)粒 用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗Taq 酶 0.5U1 （ 1. 5u）總體積25 y 1（2）根據(jù)廠商的操作手冊(cè)設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序（本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)設(shè)置為WZ）： 94°C5min 94°Clmin 60°Clmin 72°C IminSOsgoto29 times 72°C10min（2）PCR結(jié)束后，取10u 1產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時(shí)比 對(duì)）。觀察膠上是否有預(yù)計(jì)的主要產(chǎn)物帶。（3）按照編號(hào)找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。根據(jù)需要進(jìn)行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒（4）提取到的質(zhì)粒與原先的空載體（或已知分子量的質(zhì)粒）再對(duì)比電泳，以進(jìn) 步確認(rèn)。方法二：提質(zhì)粒再PCR或酶切鑒定（1）在超凈工作臺(tái)中取3支無(wú)菌揺菌管，各加入3mL LB （含50mg/mL氨節(jié)青寄 素），用記號(hào)筆寫(xiě)好編號(hào)。（2）在超凈工作臺(tái)中將70%乙醇浸泡的小躡子頭用酒精燈烤過(guò)，鍍?nèi)∫恢o(wú)菌牙 簽。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上的一個(gè)白色菌落，然后將牙簽放入盛有 3mLLB