1、膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)年級(jí)專業(yè)： 14 臨床輸血姓名：寧立軍合作者：牛愷文黃可秀實(shí)驗(yàn)室：第六實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的得分：學(xué)號(hào)： 3140704004組別：第七組朱晉輝指導(dǎo)老師：羅軍一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)革蘭氏染色并在油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)菌的生化反應(yīng)和細(xì)菌的血清學(xué)反應(yīng)等手段區(qū)別和鑒定膿汁標(biāo)本中和糞便標(biāo)本中細(xì)菌，檢測(cè)病原微生物，并進(jìn)行細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)器材1 器材接種環(huán)接種針打火機(jī)馬克筆物顯微鏡電爐試管（帶棉塞）皮筋尺子錐形瓶高壓蒸汽滅菌器酒精燈電熱恒溫培養(yǎng)箱稱量紙藥勺牛皮紙鑷子玻片吸水紙橡2 試劑藥品普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 蒸餾水 膿汁標(biāo)本 糞便標(biāo)本 石蠟油生理鹽水 結(jié)晶紫 盧戈碘液 95%乙

2、醇 稀釋復(fù)紅 葡萄糖微量發(fā)酵管（ 2 支） 乳糖微量發(fā)酵管（ 2 支） 青霉素抗菌素紙片鏈霉素抗菌素紙片慶大霉素抗菌素紙片兔血漿福氏志賀菌診斷血清三、方法與步驟1 培養(yǎng)基制備稱取一定量的肉湯培養(yǎng)基，至于三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水，煮沸一次，趁熱分裝；稱取一定量的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，至于三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水，煮沸三次（煮至剛剛冒泡，立刻置于臺(tái)面，半分鐘后再煮），使完全溶解，趁熱分裝。（平板培養(yǎng)基：以無(wú)菌操作，傾注平皿10ml，瓊脂完全凝固后，平板倒放， 4冰箱保存?zhèn)溆谩Ｐ泵媾囵B(yǎng)基：培養(yǎng)基趁熱斜放，培基不超過(guò)試管長(zhǎng)度的2/3 ，瓊脂凝固以后， 4冰箱保存?zhèn)溆谩＃┵N上標(biāo)簽后滅菌使用。2 空氣與

3、人體體表細(xì)菌學(xué)檢查根據(jù)空氣中細(xì)菌氣溶膠粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)以后，計(jì)數(shù)菌落形成單位（CFU），了解空氣的污染情況。平板蓋打開(kāi)，蓋朝下放在平板旁，瓊脂平板暴露15 分鐘即可。在普通平板上接種手指上的細(xì)菌。第1 格為洗手前，第2 格為洗手后，第3 格為消毒后，第4 格空白對(duì)照。3 細(xì)菌分離培養(yǎng)接種前，接種環(huán)燒灼滅菌。取標(biāo)本在平板表面上方密集涂布 5 10 mm2 。燒掉接種環(huán)上多余的標(biāo)本。冷卻后，應(yīng)用分區(qū)劃線分離法，將膿汁標(biāo)本接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（2 份），糞便標(biāo)本接種于伊紅美藍(lán)平板（2 份）。接種完畢后，接種環(huán)燒灼滅菌。將平板倒置37培養(yǎng)18 24h,觀察

4、結(jié)果。4 細(xì)菌的群體生長(zhǎng)特性觀察和純化培養(yǎng) 觀察細(xì)菌分離培養(yǎng)物中菌落特征，并記錄。選取平板上相同的菌落數(shù)多的，典型的，容易挑取的單菌落。通過(guò)無(wú)菌操作輕刮取菌，接種于斜面培養(yǎng)基中。接種完畢，灼燒接種環(huán)，斜面培養(yǎng)基置于37培養(yǎng)過(guò)夜。5 細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)特征的觀察 斜面培養(yǎng)物的觀察革蘭氏染色：取潔凈載玻片，用滅菌操作后的接種環(huán)取生理鹽水 1-2 環(huán)于玻片上，挑取細(xì)菌培養(yǎng)物少許與鹽水輕輕抹勻。待涂片干燥后在酒精燈火焰外側(cè)快速來(lái)回2-3回合，使標(biāo)本固定，進(jìn)行染色。結(jié)晶紫染液初染1 分鐘后水洗，蘆戈氏碘液媒染一分鐘后水洗，95%酒精脫色20-30s ，水洗，稀釋復(fù)紅復(fù)染一分鐘后水洗。待標(biāo)本晾干后滴加香柏油，

5、油鏡下觀察。通過(guò)無(wú)菌操作，分別在斜面培養(yǎng)物中挑取菌苔少許，立即移入肉湯培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調(diào)和， 使菌液混合語(yǔ)培養(yǎng)基中，混勻。接種完畢，試管口通過(guò)火焰2-3 次滅菌，塞好棉塞。 接種環(huán)灼燒后放下。6 細(xì)菌的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)通過(guò)無(wú)菌操作，用滅菌接種針刮取新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物少許，分別接種在葡萄糖發(fā)酵微量管中和乳糖發(fā)酵微量管內(nèi)。將微量管平放在平皿內(nèi)，37培養(yǎng)過(guò)夜后觀察結(jié)果。7 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)取干凈玻片一張，在左右兩邊分別滴加兔血漿1-2 滴，生理鹽水1 滴。將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒滅菌冷卻后，取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物少許，在生理鹽水中研磨混勻成細(xì)菌懸液。用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌懸液1 環(huán)

6、，或挑取細(xì)菌培養(yǎng)物少許，在兔血漿中輕輕抹勻。稍等片刻，觀察結(jié)果。8 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)取潔凈的載玻片一張，將磨面近端設(shè)為對(duì)照區(qū)，滴加生理鹽水15ul 。遠(yuǎn)端設(shè)為試驗(yàn)區(qū)，滴加福氏志賀菌診斷血清15ul ，用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔，研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻。載玻片來(lái)回傾側(cè)，讓菌液充分混勻，凝集速度更快、結(jié)果更清楚。9 半固體穿刺培養(yǎng)接種針滅菌處理后挑取菌苔少許，垂直刺入半固體培養(yǎng)基中心，可刺達(dá)近底管處，但不要到達(dá)管底，然后沿原路退出。接種完畢， 試管口迅速通過(guò)火焰2-3 次滅菌， 塞好棉塞。接種針灼燒后放下。37培養(yǎng)過(guò)夜。10 細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)接種環(huán)取菌液在平板培養(yǎng)基表面，拉出 2 條細(xì)菌接種線，使

7、呈“十字形” 。平板密集劃線接種細(xì)菌。設(shè)計(jì)三點(diǎn)，呈等邊三角距離， 點(diǎn)距離平皿邊緣約15mm。作標(biāo)記： 青、鏈、慶。鑷子火焰消毒，夾取相應(yīng)的藥物紙片，平貼在已設(shè)定的位置上，按壓，鑷子火焰滅菌。 37 18 24 小時(shí)培養(yǎng)， 觀察結(jié)果。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1、空氣與人體體表細(xì)菌學(xué)檢查（1）空氣： 菌落數(shù)： 16 個(gè)，采集地點(diǎn)：廁所。由CFU/m3 50,000N ÷ AT 86N(直徑 7cm 平板）實(shí)驗(yàn)室空氣細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)。N：平板上的菌落數(shù)，A：平板面積 (38.5cm2) ， T：采樣時(shí)間(15 分鐘 )分析討論：在課堂上，和其他組比較發(fā)現(xiàn)，微生物實(shí)驗(yàn)室中空氣細(xì)菌是比較多的，而廁所反而菌落

8、少，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室是封閉的， 而且人流量大， 故而空氣中的細(xì)菌也就多了，廁所人流量少，反而干凈。（ 2）人體體表：手指皮膚的細(xì)菌學(xué)檢查我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)還是普通洗手后，平板上菌落的數(shù)量與洗手前的是差不多的，甚至還多些，而消毒后的我們組兩個(gè)同學(xué)的沒(méi)發(fā)現(xiàn)菌落，空白對(duì)照出有兩個(gè)同學(xué)的都有一個(gè)菌苔洗前細(xì)菌種類多，洗后細(xì)菌種類少。分析討論： 對(duì)于普通洗手的同學(xué)來(lái)說(shuō)，由于暫駐細(xì)菌未能完全清洗干凈， 而常駐細(xì)菌又暴露了， 故洗手后測(cè)到的細(xì)菌反而多了， 對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)洗手的同學(xué)來(lái)說(shuō)， 暫駐細(xì)菌可能是完全洗凈， 但暴露的常駐細(xì)菌可能與暫駐細(xì)菌相當(dāng)或比之還多，因此出現(xiàn)該結(jié)果。而用碘酒消毒后未發(fā)現(xiàn)菌落，說(shuō)明碘酒消毒可以

9、消毒徹底。而空白對(duì)照說(shuō)明我們手指皮膚上的細(xì)菌比空氣中的多。2 細(xì)菌分離培養(yǎng)濃汁標(biāo)本平板糞便標(biāo)本平板膿汁標(biāo)本在普通平板上有黃色、白色兩種菌落，圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊、不透明。糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、淡粉紅色兩種菌落。紫黑色菌落具有金屬光澤、大而隆起、不透明。淡粉紅色菌落半透明。分析討論： 用伊紅美藍(lán)平板，從糞便標(biāo)本中分離出紫黑色具有金屬光澤和粉紅色半透明菌落，顯微鏡下均為G-桿菌，散在排列。紫黑色金屬光澤的產(chǎn)生是因?yàn)槿樘潜环纸猱a(chǎn)酸，酸使伊紅美和藍(lán)紫結(jié)合，產(chǎn)生紫黑金屬光澤菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大腸埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈現(xiàn)伊紅的顏色。粉紅色菌落是不能分解乳糖的

10、致病菌。3 細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)特征的觀察G- 桿菌G+球菌分析討論： 用伊紅美藍(lán)平板, 從糞便標(biāo)本分離，獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。顯微鏡下，均為G-桿菌，散在排列。用普通平板，從膿汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細(xì)菌，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀。4 細(xì)菌的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分析討論：糞便標(biāo)本分離菌糖發(fā)酵試驗(yàn)中， 紫黑色菌落菌種的葡萄糖和乳糖微量發(fā)酵管都為黃色，有氣體產(chǎn)生；粉紅色菌落菌種的葡萄糖微量發(fā)酵管為黃色，不產(chǎn)氣，乳糖微量發(fā)酵管無(wú)明顯變化。5 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)?zāi)撝瓨?biāo)本分離菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)中，黃色菌種菌液出現(xiàn)明顯凝塊，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性；白色菌種未出現(xiàn)凝集反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果

11、為陰性。分析討論： 通過(guò)血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，黃色菌種實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，為致病菌。6 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)玻片凝集試驗(yàn)中，粉紅色菌落菌種在福氏志賀菌診斷血清中出現(xiàn)片狀凝集現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性；而在生理鹽水中未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。分析討論： 通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，粉紅色菌落菌種與福氏志賀菌診斷血清發(fā)生凝集反應(yīng)，確定其為福氏志賀菌。7 半固體穿刺培養(yǎng)半固體培養(yǎng)基中，紫黑色菌落菌種擴(kuò)散生長(zhǎng)，培養(yǎng)基呈擴(kuò)散云霧混沌狀態(tài)；粉紅色菌落菌種沿穿刺線生長(zhǎng)，穿刺線邊緣整齊，周圍培養(yǎng)基清澈透明。分析討論： 半固體動(dòng)力試驗(yàn)表明紫黑色菌落菌種半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，有鞭毛；粉紅色菌落菌種半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果陰性，無(wú)鞭毛。8 細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)白色細(xì)菌

12、平板黃色細(xì)菌平板粉紅色菌種平板紫黑色菌種平板各菌落抑菌圈直徑青霉素頭孢曲松慶大霉素黃色菌種42mm25mm30mm白色菌種30mm22mm40mm紫黑色菌種無(wú)作用37mm26mm粉紅色菌種無(wú)作用36mm38mm分析討論： 由于青霉素針對(duì)的是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，因此對(duì)白色菌落和黃色菌落是高度敏感的，而頭孢曲松和慶大霉素都是廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌都較為敏感，因此對(duì)四種菌落都有較好的抑菌作用，這也說(shuō)明我們不能單從這些細(xì)菌的抗藥敏性實(shí)驗(yàn)中得出細(xì)菌的種屬，應(yīng)結(jié)合多個(gè)生化反應(yīng)進(jìn)行判斷。五、實(shí)驗(yàn)綜合討論1、用普通平板，從膿汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，油鏡下均為 G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串

13、狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌分別是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白 , 附著于菌體表面 , 形成凝塊。通過(guò)血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，為致病菌。用伊紅美藍(lán)平板，從糞便標(biāo)本中分離出紫黑色具有金屬光澤和粉紅色半透明菌落， 顯微鏡下均為 G-桿菌，散在排列。紫黑色金屬光澤的產(chǎn)生是因?yàn)槿樘潜环纸猱a(chǎn)酸，酸使伊紅美和藍(lán)紫結(jié)合，產(chǎn)生紫黑金屬光澤菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大腸埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈現(xiàn)伊紅的顏色。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。經(jīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)（

14、紫黑色菌落菌種分解葡萄糖和乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；粉紅色菌落菌種只能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）半固體動(dòng)力試驗(yàn)（紫黑色菌落菌種半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，有鞭毛；粉紅色菌落菌種半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果陰性，無(wú)鞭毛） 。對(duì)照常見(jiàn)腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征，判定它們分別是大腸埃希菌和福氏志賀菌。通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，粉紅色菌落菌種與福氏志賀菌診斷血清發(fā)生凝集反應(yīng)，進(jìn)一步確定其為福氏志賀菌。腸道桿菌科各菌屬生化反應(yīng)鑒別表葡萄糖乳糖麥芽糖甘露醇蔗糖半固體埃希菌屬+志賀菌屬+/-/+-沙門菌屬 /+-+霍亂弧菌+-+變形桿菌-+屬注： + 產(chǎn)酸或陽(yáng)性， 產(chǎn)酸產(chǎn)氣， - 陰性， +/-多數(shù)陽(yáng)性， -/+多數(shù)陰性 不確定。常見(jiàn)腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征葡萄糖乳糖半固體大腸埃希菌+福氏志賀菌+傷寒沙門菌+霍亂弧菌+幽門螺桿菌不分解糖類+變形桿菌+2、對(duì)照常用藥敏試驗(yàn)紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)，金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌對(duì)青霉素、慶大霉素、鏈霉素均敏感。大腸埃希菌對(duì)青霉素耐藥，慶大霉素、鏈霉素敏感，福氏志賀菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)慶大霉素、鏈霉素敏感。可得結(jié)論G+球菌對(duì)青霉素和鏈霉素敏感。G- 桿菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)鏈霉素敏感。 G+球菌和 G-桿菌對(duì)廣譜抗菌素慶大霉素都敏感。常用藥敏試驗(yàn)紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑 (m