1、細(xì)菌的生理生化反應(yīng)實驗一目的與意義一般來說，對一株從自然界或其他樣品中分離純化的未知菌種的鑒定要做以下幾個方面工作。個體形態(tài)觀察，進(jìn)行革蘭氏染色，分辨是 G（+）菌還是 G（-）菌。并觀察其形狀、大小、有無芽孢及其位置等；菌種形態(tài)觀察，主要觀察其形態(tài)、大小、邊緣情況、隆起度、透明度、色澤、氣味等特征；做動力試驗，看他能否運(yùn)動及其鞭毛著生類型（端生、周生） ；做生理生化反應(yīng)及做血清學(xué)反應(yīng)實驗。最后根據(jù)以上實驗項目的結(jié)果，通過查閱微生物分類檢索表，給未知菌進(jìn)行命名。此實驗為生理生化反應(yīng)實驗， 就是使不同種類的細(xì)菌在對營養(yǎng)物質(zhì)的利用、代謝產(chǎn)物的種類、代謝類型等方面表現(xiàn)出差異，故利用這些差異作為細(xì)菌分

2、類作為細(xì)菌分類鑒定的重要依據(jù)。 要求在此實驗中了解細(xì)菌在不同底物環(huán)境中各種代謝途徑和產(chǎn)物， 加深理解細(xì)菌生化反應(yīng)原理；根據(jù)細(xì)菌在培養(yǎng)基中生理生化特點，學(xué)會鑒定細(xì)菌。生理生化反應(yīng)的項目很多。本實驗結(jié)合腸道桿菌科的分類鑒定，選作其中重要的幾項實驗。二材料與用具1.菌種：大腸桿菌、沙門氏菌。2.培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖）糖發(fā)酵半固體培養(yǎng)基（添加溴甲酚紫試劑）、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、 童漢氏蛋白胨水培養(yǎng)基、檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基（添加溴麝香草酚藍(lán)變色范圍pH6.8 綠pH7.6藍(lán)）、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基。3.試劑：甲基紅指示劑、40%NaOH、吲哚檢驗試劑（對二甲基氨基苯甲醛）、雙氧水等。4.用具

3、。酒精燈、接種環(huán)、接種針、試管等。三實驗內(nèi)容與方法1.糖（醇）類發(fā)酵實驗多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源及能源， 但各種菌因含有不同發(fā)酵糖（醇）類的酶，故表現(xiàn)出有的能分解或不分解某些糖類，有的分解糖產(chǎn)酸，并產(chǎn)氣，或只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，可根據(jù)這些特點鑒別細(xì)菌（培養(yǎng)基中指示劑溴甲酚紫 pH6.8 以上呈紫色， pH5.2 以下呈黃色）。大腸桿菌與沙門氏菌的生理生化鑒定區(qū)別操作：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖）糖發(fā)酵半固體培養(yǎng)基 （添加溴甲酚紫試劑）中，無菌操作，穿刺接種， 37培養(yǎng) 1 天。記錄：陰性 不產(chǎn)酸（紫色）；陽性 產(chǎn)酸（黃色）。2.甲基紅（ M ·R）實驗?zāi)承┚谔谴x過程中，分解糖類，產(chǎn)

4、生丙酮酸，繼而再分解為各種酸，使培養(yǎng)基 pH 下降至 4.5 以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，為陽性反應(yīng)；若分解糖產(chǎn)酸少，或所產(chǎn)生的酸轉(zhuǎn)換為其他物質(zhì)，則培養(yǎng)基 pH 在 4.5 以上，加入指示劑呈黃色，為陰性。操作：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中， 無菌操作，斜面取菌接種， 37 培養(yǎng) 2 天。觀察時加入甲基橙試劑。3.維培（ V P）二氏實驗?zāi)承┚軓钠咸烟?丙酮酸 縮合、脫羧為乙酰甲基甲醇，繼而再有些堿存在時氧化成雙乙酰， 雙乙酰與培養(yǎng)基中蛋白胨中的精氨酸胍基起作用，產(chǎn)生粉紅色化合物 （加入肌酸或肌酐等胍基化合物可加速此反應(yīng)）。操作：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中， 無菌操作，斜面取菌接種， 37 培養(yǎng) 2

5、 天。觀察時加入與培養(yǎng)基等量的 40%KOH 溶液。記錄：粉紅色 陽性；無反應(yīng) 陰性。4.吲哚（靛基質(zhì)）產(chǎn)生實驗?zāi)承┘?xì)菌具有色氨酸水解酶， 能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，后者與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，生成紅色的玫瑰吲哚化合物。操作：童漢氏蛋白胨水培養(yǎng)基中， 無菌操作，斜面取菌接種，37培養(yǎng) 2 天。觀察時加入吲哚試劑，搖勻。記錄：有玫瑰環(huán) 陽性；無反應(yīng) 陰性。5.檸檬酸鹽利用實驗?zāi)承┚脵幟仕猁}為碳源，在有水存在的情況下，將檸檬酸鹽水解為檸檬酸和強(qiáng)堿。 由于細(xì)菌不斷利用檸檬酸生成CO2，使培養(yǎng)基中檸檬酸濃度下降，強(qiáng)堿化合物濃度上升，導(dǎo)致pH 值由中性變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中指示劑發(fā)生綠轉(zhuǎn)藍(lán)的變

6、化。操作：檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基（添加溴麝香草酚藍(lán)變色范圍pH6.8 綠pH7.6 藍(lán)）中，無菌操作，劃線接種， 37培養(yǎng) 2 天。記錄：藍(lán) 陽性；綠 陰性。6.三糖鐵實驗有些菌分解糖產(chǎn)生H2S，H2S 與 Fe3+反應(yīng)生成 FeS 黑色沉淀。且糖被分解產(chǎn)酸使培養(yǎng)基呈黃色，表面進(jìn)一步氧化呈紅色。操作：三糖鐵培養(yǎng)基中，無菌操作，先進(jìn)行穿刺接菌，再進(jìn)行劃斜面接菌， 37培養(yǎng) 2 天。記錄：產(chǎn)生黑色物質(zhì) 陽性；無反應(yīng) 陰性。四現(xiàn)象總結(jié)：（1）糖發(fā)酵試驗大腸桿菌能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇；沙門氏菌能利用葡萄糖和甘露醇，不能利用蔗糖和乳糖。（2）甲基紅試驗大腸桿菌與沙門氏菌均為陽性反應(yīng)。（3）維培二氏試驗大腸桿菌與沙門氏菌均為陰性反應(yīng)。（ 4）吲哚試驗大腸桿菌具有色氨酸水解酶，可生成紅色的玫瑰吲哚化合物；沙門氏菌為陰性。（5）檸檬酸鹽利用試驗大腸桿菌為陰性；沙門氏菌為陽性。（6）三塘鐵試驗：大腸桿菌不利用含硫氨基酸，不產(chǎn)生H2S，也即沒有黑色沉淀，且斜面為紅色，底部呈黃色；沙門氏菌可利用含硫氨基酸，產(chǎn)生H2S，生成 FeS 黑色沉淀，且斜面為紅色，底部呈黃色。菌種糖發(fā)酵試驗甲基 V.P吲哚檸檬三 糖葡萄乳蔗糖甘露紅試試驗 酸鹽鐵試糖糖醇驗