1、細胞培養(yǎng)實驗室操作準(zhǔn)則任何首次準(zhǔn)備開展細胞實驗的人員必須首先認真閱讀以下準(zhǔn)則，然后在已經(jīng)熟練掌握細胞培養(yǎng)操作技術(shù)人員的指導(dǎo)下開始進行細胞實驗，并在以后的實驗過程中嚴(yán)格遵守各項準(zhǔn)則。一、細胞實驗準(zhǔn)備1. 進入細胞房前要換鞋，穿無菌服（干凈實驗工作服），戴手套，接觸細胞前噴75%酒精消毒手套。2. 將所需實驗用品：培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基、空白培養(yǎng)基）、胰酶（含ETTA）、槍頭（1ml、200ul、10ul)、離心管，預(yù)先放置到超凈工作臺，打開紫外照射30min后開始細胞實驗。3. 觀察細胞前，用75%酒精紗布擦拭顯微鏡鏡頭及臺面，進行消毒后方可開始觀察細胞。4. 觀察細胞主要包括：細胞數(shù)量（匯合度）、

2、形態(tài)、分布情況（是否均勻）、有無漂浮的死細胞和污染等，觀察完及時放回培養(yǎng)箱。（如圖，匯合度約90%，分布均勻）5.每次開始細胞實驗前，需關(guān)閉紫外照射，打開超凈臺風(fēng)機及燈。用含75%酒精的紗布擦拭超凈工作臺。超凈臺內(nèi)物品放置情況：左側(cè)（各式槍頭，及可常溫放置的試劑如PBS等），右側(cè)（5ml槍頭及鑷子），廢棄瓶位于右上角，盡可能遠離操作區(qū)域，正前方為槍和酒精燈，培養(yǎng)基及胰酶放置左側(cè)便于取用。6.超凈臺在使用前后，都需用含75%酒精的紗布擦拭臺面至紗布上看不到明顯臟物為止，每天操作后廢液缸需清洗用紫外照射，此外，從外面拿進超凈臺的東西都要噴75%酒精消毒。7、每周四需更換培養(yǎng)箱中高壓過的超純水，每周

3、五對超凈臺（包括風(fēng)機）、細胞培養(yǎng)房衛(wèi)生進行打掃，每月對培養(yǎng)箱進行消毒清洗，確保細胞不受污染。8、檢查培養(yǎng)箱的CO2含量是否正常，如出現(xiàn)異常及時聯(lián)系細胞平臺相關(guān)負責(zé)人。9、5mL槍頭清洗高壓的流程:(1)用洗潔精將槍頭超聲一遍（2）更換干凈的自來水超聲清洗3遍（3）用超純水超聲清洗1遍（4）將槍頭撈出后再用超純水蕩洗3遍（5）放入烘干箱烘干（6）裝在鐵盒中，注意槍頭放置順序一致，放入高壓鍋，選擇橡膠類（7）高壓后放入烘干箱烘干后方可拿入細胞房使用1ml、200ul、10ul裝入槍盒后放入高壓鍋高壓烘干后方可拿入細胞房使用二、細胞傳代1. 細胞傳代前要觀察細胞，細胞匯合度達到80%-90%時可以進

4、行傳代。圖片2. 以25cm2培養(yǎng)瓶為例：打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，將蓋子地面朝下放在超凈臺臺面上，然后將培養(yǎng)瓶傾斜，用量程5ml的槍將舊培養(yǎng)基吸走，然后用量程1ml槍加1ml空白培養(yǎng)基輕輕搖勻清洗，用5ml槍將清洗的培養(yǎng)基吸走。注：75cm2加3ml空白培養(yǎng)基清洗3. 加入胰酶（含EDTA）500ul；然后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，注意讓所有細胞都要接觸到胰酶，放入37度培養(yǎng)箱消化。注：75大瓶加1500ul胰酶、6孔板加300ul胰酶、12孔板加200ul胰酶4. 消化時間長短根據(jù)不同細胞有不同選擇，鏡下觀察大部分細胞變圓，見大部分細胞脫落即可終止消化。5. 25cm2培養(yǎng)瓶加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化。注：

5、75cm2培養(yǎng)瓶加5ml完全培養(yǎng)基終止消化、6孔板加1.5ml完全培養(yǎng)基終止消化、12孔板加1ml完全培養(yǎng)基終止消化。6. 用5ml槍頭輕輕吹打細胞后，觀察底部大部分細胞已脫落，然后傾斜培養(yǎng)瓶，將細胞混懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管，800r/min條件下離心3min。7. 離心時，準(zhǔn)備新的培養(yǎng)瓶，標(biāo)記好細胞的名稱、日期、代數(shù)。8. 離心結(jié)束后，棄上清液。緩緩沿壁加入5ml新鮮的完全培養(yǎng)基，計數(shù)（方法參見后面）。9. 重懸細胞，用量程5ml槍，槍打到第一檔，深入管底部，輕輕吸取離心管底部的整個沉淀的細胞團和培養(yǎng)基，然后沿管壁緩慢勻速打下，槍頭隨著液面的的上升而逐漸上提，這樣可避免產(chǎn)生氣泡。按此方法反

6、復(fù)幾次，待細胞混勻后，吸取細胞混懸液，加入新培養(yǎng)瓶，按所需比例進行傳代即可。細胞傳代的比例是根據(jù)所需細胞的數(shù)量以及時間來決定。如需急用可用低的比例（1:2,1:3）傳代，并每天換液，如時間充裕，不用時可適量加大傳代比例（1:4,1:5），并3天換液，減少細胞的代數(shù)，暫時不用細胞只需留一小瓶培養(yǎng)即可。10. 進行十字型搖勻，有序放入培養(yǎng)箱中。注意事項：1、需要進行細胞實驗前，合理擴大培養(yǎng)，盡量安排在同一代數(shù)情況下做實驗。2、在進行細胞實驗時，不可同時處理兩種及以上細胞，避免交叉污染。三、細胞計數(shù)：（計數(shù)前操作與傳代相同）1、消化后的細胞充分混勻后，用10ul槍吸取l0ul細胞混懸液，再吸取10u

7、l臺盼藍，在1.5ml離心管中將兩者混和均勻后，將20ul混合液注入計數(shù)板。2、打開計數(shù)器，確認紅色指示燈亮起，藍色指示燈在第幾格，一般為第一格，旋轉(zhuǎn)選擇正確區(qū)域。3、打開計數(shù)軟件“count star”,標(biāo)明日期及細胞名稱，選擇比例1:1，細胞類型為，注意觀察細胞分布，如果不均勻，應(yīng)重新混勻后計數(shù)。4、記錄內(nèi)容：細胞總數(shù)，死細胞數(shù)，細胞活力（一般活力在95%以上）及活細胞數(shù)。（活細胞數(shù)用于計算接板所需的細胞量）5、將計數(shù)板及時從count star取出，關(guān)閉軟件，計數(shù)完成。四、細胞接種：1、細胞計數(shù)完后，正確計算所需的細胞量和培養(yǎng)基的量，取一潔凈的皿，將細胞混懸液和完全培養(yǎng)基分別加入皿內(nèi)。2

8、、混勻：先用5ml槍混勻，然后取排槍混勻后，先加一孔到96孔板中，去鏡下觀察分布是否均勻，如若不均勻需再次混勻，確保均勻后再加入。避免產(chǎn)生氣泡，如有少許氣泡可用10ul槍頭戳破。每次吸取液體后需觀察高度是否一致和準(zhǔn)確。3、對于接板的細胞，96孔板可先靜置一會再放入培養(yǎng)箱，避免搖動，以免細胞集中在中央。例如：需接一塊96孔板，細胞密度為0.5*105，細胞計數(shù)-活細胞數(shù)為5*105個/ml需稀釋的倍數(shù)為5*105除以0.5*105等于10倍，一塊96孔板需要12ml，故需細胞懸液的體積為12ml除以稀釋位數(shù)10等于1.2ml，其余的量用完全培養(yǎng)基補足。注意事項：無論是接種在6孔板、12孔板、24

9、孔板和96孔，培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶中，都需要先加入一孔、一個培養(yǎng)皿或一個培養(yǎng)瓶在鏡下觀察細胞懸液分布是否均勻，若發(fā)現(xiàn)細胞有抱團、成束現(xiàn)象需重新混勻后方可接種。附不同板底面積5、 細胞凍存：1、訂購新細胞之前需查閱相關(guān)的文獻，選擇合適的細胞，并仔細閱讀說明書（培養(yǎng)的條件包括培養(yǎng)基等），準(zhǔn)備好細胞培養(yǎng)所需的相關(guān)試劑及耗材。1、買來后傳一個25cm2小瓶，記為第一代-P0，若細胞狀態(tài)不好可每天換液，長滿后1:3傳3個小瓶，記為第一代P1，然后根據(jù)細胞的生長速度長滿后按1:6傳6個大瓶，記為P2，保種5大瓶，另一大瓶可開始用于實驗，以此類推，詳細記錄細胞的代數(shù)。凍存時寫上細胞名稱、凍存日期及細胞的代數(shù)。2

10、、細胞消化離心后，去掉上清液，快速加入凍存液，充分混勻后裝入凍存管。3、一般一瓶75cm2的瓶子可凍存3-4小管，標(biāo)號細胞名稱，凍存日期和細胞代數(shù)，用封口膜封口，放入程序性降溫盒置于-80冰箱過夜，第二天置于液氮中保存。4、放入液氮時，注意放入正確的位置，記錄好凍存細胞的位置，順序按時間先后排，時間前的放外面。6、 細胞復(fù)蘇1、復(fù)蘇前準(zhǔn)備：將所需物品放入超凈臺，打開紫外照射約半小時，75%酒精擦拭臺面。2、準(zhǔn)備15ml離心管，加入5ml培養(yǎng)基。3、提前打開37水浴鍋預(yù)熱，從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37溫水中，并不時搖動令其全部融化，更換新手套。4、用75%酒精噴灑凍存管后，擦拭臺面，打開

11、蓋子，1ml槍頭吸出細胞懸液，加到含培養(yǎng)基的離心管，充分混勻；5、離心，800r，3min；6、棄去上清液，重懸細胞，加入完全培養(yǎng)基到25cm2的小瓶子，在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，然后放入37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；7、注意觀察細胞狀態(tài)，及時換液。8、細胞復(fù)蘇后，根據(jù)細胞的特性，按適當(dāng)?shù)谋壤齻鞯?5cm2的大瓶子，每天換液，長滿后立即保種，并記錄細胞的代數(shù)，細胞狀態(tài)穩(wěn)定后方可開始實驗。8、復(fù)蘇后觀察細胞如果發(fā)現(xiàn)一小瓶有很多細胞，立即傳到大瓶子7、 細胞加藥1、 細胞加藥前需在鏡下觀察細胞形態(tài)和數(shù)量，根據(jù)具體實驗對細胞覆蓋率的要求不同。一般藥物作用24h是在細胞長到50%-60%時加藥。2、計算好所需配置

12、的量，準(zhǔn)備離心管，配藥可采用兩種方法：（1)配置最高濃度，再進行倍比稀釋配成所需各濃度。（2）分別配置所需的各種濃度。配完藥后注意要上下混勻！3、加藥時沿孔板壁加，避免產(chǎn)生氣泡，加完后注意檢查有無氣泡，小氣泡需用小槍頭捅破，以免影響藥物的均勻分布。4、加藥后，立即放入培養(yǎng)箱。例如：1、一塊96孔板加藥，復(fù)方熊膽粉(FF)儲存液濃度為500mg/ml（PBS配置），我們需要配置成0、1.25、2.5、5mg/ml的工作液各1ml，采用倍比稀釋法，準(zhǔn)備4個5ml的離心管，在0、1.25和2.5mg/ml的離心管中分別加入1mlDMEM完全培養(yǎng)基，然后將500mg/ml的工作液稀釋成最高濃度5mg/

13、ml，然后過濾，加入2ml到5mg/ml的離心管中。0mg/ml 1.25mg/ml 2.5mg/ml 5mg/ml混勻后加1ml混勻后加1ml2ml(5mg/ml)1mlDMEM1mlDMEM1mlDMEM8、 細胞污染處理 1. 我們實驗室一般較少細胞污染，細胞污染時多出現(xiàn)不明游動物體、底部有連片黃色斑點、出現(xiàn)絮狀或毛線狀的菌落等，常伴有明顯不適氣味。2、 一經(jīng)發(fā)現(xiàn)細胞污染，立刻上報不得隱瞞。馬上將被污染細胞移出培養(yǎng)箱（不要開蓋，防止細胞交叉污染），在細胞房外向瓶內(nèi)注入新潔爾滅，蓋緊瓶口，扔進醫(yī)療垃圾桶。3、 將培養(yǎng)箱中的細胞，逐一在鏡下觀察是否已交叉污染，如發(fā)現(xiàn)已交叉污染做污染細胞處理，

14、排除隱患后，將正常細胞移到另一培養(yǎng)箱中。4、 關(guān)閉污染培養(yǎng)箱的電源開關(guān)，將隔板取出，用新潔爾滅(1:1000-1:2000)擦拭，確保每個角落都擦到，后進行紫外照射2小時。箱內(nèi)除用潔爾滅擦拭外，還需用75%酒精擦拭，確保每個角落都不能遺漏。5、 將水槽清洗干凈后用75%酒精擦拭，用新高壓的超純水換掉原先的水。6、 細胞移回的一周內(nèi)，要細心觀察是否污染的現(xiàn)象再次出現(xiàn)，一般污染為偶然事件，如再次出現(xiàn)就不是培養(yǎng)箱的問題，而是培養(yǎng)箱外部的問題如培養(yǎng)基、操作、外部帶環(huán)境等。十、常用試劑的配制及保存1、完全培養(yǎng)基的配置：空白培養(yǎng)基+1%雙抗（Hyclone)+10%胎牛血清（目前使用的是Gibco滅菌過濾過的，配置時無需過濾）例如：500ml的DMEM空白培養(yǎng)基+55mlFBS+5.5ml雙抗空白培養(yǎng)基：4保存。雙抗：-20保存，100ml/瓶，1