1、生物化學實驗指導書適用專業(yè): 制藥工程生物與食品工程學院生物科學系生物化學實驗細則為了保證生物化學實驗的順利進行，培養(yǎng)同學們掌握良好、規(guī)范的生物化學基本實驗技能，特制定以下實驗細則，請同學們嚴格遵守。1. 實驗前應提前預習實驗指導書并復習相關知識。2. 嚴格按照生物化學實驗分組，分批進入實驗室，不得遲到。非本實驗組的同學不準進入實驗室。3. 進入實驗室必須穿實驗服。各位同學進入各自實驗小組實驗臺后，保持安靜，不得大聲喧嘩和嬉戲，不得無故離開本實驗臺隨便走動。絕對禁止用實驗儀器或藥物開玩笑。4. 實驗中應保持實驗臺的整潔，廢液倒入廢液桶中，用過的濾紙放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或隨地亂丟。5

2、. 實驗中要注意節(jié)約藥品與試劑，愛護儀器，使用前應了解使用方法，使用時要嚴格遵守操作規(guī)程，不得擅自移動實驗儀器。否則，因非實驗性損壞，由損壞者賠還。6. 使用水、火、電時，要做到人在使用，人走關水、斷電、熄火。7. 做完實驗要清洗儀器、器皿，并放回原位，擦凈桌面。8. 實驗后，要及時完成實驗報告。實驗一蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應（4學時）目的要求1. 加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認識。2. 了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實用意義。3. 了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關系。原 理在水溶液中，蛋白質(zhì)分子表面形成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的膠體顆粒，所以蛋白質(zhì)溶液和其他親水膠體溶液相類似。但是，蛋白質(zhì)膠體顆粒的穩(wěn)

3、定性是有條件的，相對的。在一定的物理化學因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，則以固態(tài)形式從溶液中析出，這個過程稱為蛋白質(zhì)的沉淀反應。這種反應可分為以下兩種類型：1可逆沉淀反應在發(fā)生沉淀反應時，蛋白質(zhì)雖已沉淀析出，但它的分子內(nèi)部、空間結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質(zhì)，沉淀因素除去后，能再溶于原來的溶劑中。這種作用稱為可逆沉淀反應。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質(zhì)以及利用等電點的沉淀，提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反應。2不可逆沉淀反應在發(fā)生沉淀反應時，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象遭到破壞，失去原來的天然性質(zhì)，這時蛋白質(zhì)已發(fā)生變性。這種變性蛋白質(zhì)

4、的沉淀不能再溶解于原來溶劑中的作用稱為不可逆沉淀反應。重金屬鹽、生物堿試劑，強酸、強堿、加熱、震蕩、超聲波、有機溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀反應。蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷）并不析出，因此，變性蛋白質(zhì)不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。試劑和器材一、試劑1. 蛋白質(zhì)溶液：10ml/組 取5ml雞或鴨蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌均勻后用48層紗布過濾，新鮮配置。2.蛋白質(zhì)氯化鈉溶液：3ml/組取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml，充分攪勻后，以紗布濾去不溶物（加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白）。3.其余試劑：硫酸銨粉末（

5、10克/組），飽和硫酸銨溶液(150ml)，3%硝酸銀（280ml），0.5%乙酸鉛（200ml），濃硫酸（5ml/組），5%磺基水楊酸（100ml），0.1%硫酸銅（100ml），飽和硫酸銅溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），飽和氯化鈉溶液（25ml），10%氫氧化鈉溶液（500ml）。二、器材試管（15支/組），過濾漏斗（1個），試管架1個/組，玻璃棒1支/組，沸水浴4臺，量筒（總需要20ml×1,200ml×1），燒杯（總需要100ml×2，400×2），試劑瓶（12個/組，附膠頭滴管10支/組），移液管（5m

6、l×6/組，1ml×3/組），濾紙1盒，洗瓶1個/組，廢液缸1個/組，藥匙1個/組，移液管架1個/組操作方法一、蛋白質(zhì)的可逆沉淀反應蛋白質(zhì)的鹽析作用(分級鹽析)二、蛋白質(zhì)的不可逆沉淀反應1.重金屬沉淀蛋白質(zhì)2.酸沉淀蛋白質(zhì)1）2）3.加熱沉淀蛋白質(zhì)取5支試管，編號，按下表加入有關試劑（單位/滴）。試劑管號蛋白質(zhì)溶液0.1%乙酸10%乙酸飽和氯化鈉10%氫氧化鈉蒸餾水123451010101010555227225將各管混勻，觀察記錄各管現(xiàn)象后，放入沸水浴中加熱10min，比較各管的沉淀情況。思 考 題1. 名詞解釋：水化層；雙電層；蛋白質(zhì)變性；鹽溶與鹽析；蛋白質(zhì)等電點沉淀。

7、2. 將實驗結(jié)果寫在實驗報告中操作方法的對應位置上并就實驗現(xiàn)象作簡要解釋。3. 根據(jù)實驗現(xiàn)象，討論下列問題：1） 蛋白質(zhì)可逆沉淀與不可逆沉淀的本質(zhì)區(qū)別是什么？2） 簡述蛋白質(zhì)的沉淀反應、變性作用和凝固作用的相互關系。4. 作為殺菌劑，氯化汞是怎樣起作用的？實驗二 DNA的瓊脂糖凝膠電泳（4學時）目的要求1. 掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法。2. 學習利用瓊脂糖電泳方法測定DNA片段大小。3. 學習有關建立DNA限制性內(nèi)切酶圖譜的基本技術。原 理DNA分子在堿性環(huán)境中（pH8.3緩沖液）帶負電荷，外加電場作用下，向正極泳動。不同的DNA片段由于其電荷、分子量大小及構(gòu)型的不同，在電泳時的

8、泳動速率就不同，從而可以區(qū)分出不同的區(qū)帶，電泳后經(jīng)溴乙錠染色，在波長254nm紫外光照射下，DNA顯橙紅色熒光。瓊脂糖凝膠電泳對DNA的分離作用主要依據(jù)DNA的分子量及分子構(gòu)型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。一定大小的DNA 片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，電泳遷移率不相同。不同濃度的瓊脂糖凝膠適宜分離DNA片段大小范圍見表1。因而要有效分離大小不同的DNA片段，主要是選用適當?shù)沫傊悄z濃度。不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。在分子量相當?shù)那闆r下，不同構(gòu)型的DNA移動速度次序如下：共價閉環(huán)DNA直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。在同一濃度的凝膠中，分子量較小的DNA片段比較大的片

9、段快。DNA片段的遷移距離（遷移率）與它的大小（分子量）的對數(shù)成反比。將未知DNA的遷移距離與已知分子大小的DNA標準物的電泳遷移距離進行比較，即可計算出未知DNA片段的大小。瓊脂糖凝膠濃度/%可分辨的線性DNA大小范圍/kb0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1表2-1 DNA大小范圍與瓊脂糖凝膠濃度的關系本實驗采用限制性內(nèi)切酶Hind或EcoR酶解DNA的片段為標準物，建立其酶切圖譜，同時以酶解各片段的分子量為縱坐標，以它們對應的遷移率為橫坐標，在半對數(shù)坐標紙上，連接各點繪制出測定DNA分子量的標準曲線。共價閉環(huán)質(zhì)粒pBR322DN

10、A只有一個EcoR酶切位點，酶解后成為一條線狀DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳，測量酶解后線型DNA的遷移距離，可以直接在分子量標準曲線上得出其分子大小。試劑和器材一、試劑1. 限制性內(nèi)切酶Hind、EcoR試劑盒 2. 標準DNA：按使用說明配制3. 標準pBR322：按使用說明配制4. 酶反應終止液（10×0.1mol/L EDTA，20%Ficoll，0.25%溴酚藍）：10L/組稱取3.72克EDTA·Na2·2H2O，20克Ficoll，0.25克溴酚藍，溶解后定容至100ml。5. 電極緩沖液（5×TBE）：用前稀釋10倍稱取10.88克Tris，

11、5.52克硼酸，0.74克EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸餾水定容至200ml。使用前用蒸餾水稀釋10倍，稱為TBE稀釋緩沖液（0.5×TBE）。6. 溴乙錠（EB）染色貯存液（1mg/ml）：1滴/組將100mg溴乙錠溶于蒸餾水或電極緩沖液100ml，棕色瓶內(nèi)封好，避光保存。EB是誘變劑，配制和使用時應戴乳膠手套，并且不要將該溶液灑在地面或桌面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必須經(jīng)專門處理后，才能進行清洗或棄去。7. 1%瓊脂糖二、器材Eppendorf離心管（1.5ml，預先高溫高壓滅毒，3個/組）及其離心管架，電泳槽（1個/組），電泳儀（1個/2組），

12、凝膠塑料托盤（1個/組），錐形瓶（100ml×1，烘干），小燒杯（50，100，250ml），微量注射器（2L×3，15L或20L×1），一次性塑料手套(64只)，膠頭滴管（×3），紫外反射投射儀，防護眼鏡，洗瓶2個（分別盛重蒸水和蒸餾水），大燒杯1個，膠頭滴管2支，量筒（50ml×1），卡尺（學生自備）操作方法一、DNA的酶解取2只清潔、干燥、無菌的Eppendorf管，編號，按照限制性內(nèi)切酶Hind、EcoR試劑盒說明書用量，用微量注射器加入各種試劑質(zhì)粒DNA和pBR322，最后用雙蒸水補足至20L，小心混勻。37水浴保溫12h，然后各小管

13、內(nèi)加入2L的酶反應終止液，混勻，終止酶促反應，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩２僮髑案髟噭┯昧恳磸秃藢ΓＷC準確無誤，所加試劑用量很少，必須認真操作。二、1.0%瓊脂糖凝膠板的制備1. 用配套擋板將凝膠塑料托盤短邊缺口封住，置水平玻板或水平工作臺面上，將樣品槽模板（梳子）插進托盤長邊上的凹槽內(nèi)（距一端約1.5cm），梳齒底邊與托盤表面保持0.51mm的間隙，安置好后保持靜置狀態(tài)。圖2-1 凝膠托盤的組裝1. 托盤 2. 擋板 3. 梳子2. 稱取0.3克瓊脂糖置于小錐形瓶中，加入30mlTBE稀釋緩沖液，在電爐上（或微波爐中）加熱融化，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生泡沫。3. 待瓊脂糖冷卻至放在手背不覺太燙手（約60）

14、后，滴一滴EB，然后將瓊脂糖溶液在靠近擋板一側(cè)連續(xù)地倒入托盤內(nèi)（注意中間不要間斷），使凝膠緩慢而連續(xù)地展開直至在托盤表面形成一層約3mm厚均勻膠層（7.1×9.0cm）。膠內(nèi)不要存有氣泡，室溫下靜置約20分鐘。4. 待凝固完全后，用小滴管在梳齒附近加入少量TBE稀釋液潤濕凝膠，雙手均勻用力輕輕拔出樣品槽模板（注意勿使樣品槽破裂），則在膠板上形成相互隔開的樣品槽。5. 取下封邊的擋板，將凝膠連同托盤放入電泳槽平臺上，倒入大量TBE稀釋緩沖液直至浸沒過凝膠面23mm，要防止樣品槽內(nèi)窩存氣泡，可以用微量注射器挑除。 三、加樣用微量注射器或移液槍將經(jīng)酶切的樣品液和未經(jīng)酶切的樣品液（要加2L的

15、酶反應終止液）分別加入到膠板的不同加樣槽內(nèi)，每個槽（5×2×2.5mm）容積約為25L，因此加樣量不要超過20L，避免因樣品過多而溢出，污染鄰近樣品。加樣時，注射器針頭穿過緩沖液小心靠近加樣槽底部，但不要損壞凝膠槽，然后緩慢地將樣品推進槽內(nèi)，讓其集中沉于槽底部。加完一個樣品后的微量注射器應反復洗凈后才能用以加下一個樣品。四、電泳加樣完畢，將靠近樣品槽一端連接負極，另一端連接正極（千萬不要搞錯），接通電源，開始電泳。在樣品進膠前可用略高電壓，防止樣品擴散，樣品進膠后，應控制電壓降不高于5V/cm。當染料帶移動到距離凝膠前沿約1cm時，停止電泳。五、觀察小心地取出凝膠置托盤上，

16、將膠板推至預先浸濕并鋪在紫外燈觀察臺上的玻璃紙內(nèi)，在波長245nm紫外燈下進行觀察。DNA存在的位置呈現(xiàn)橘紅色熒光，可觀察到清晰的條帶。觀察時應帶上防護眼鏡，避免紫外燈對眼睛的傷害。DNAHind酶解各片段大小見表2-2。片段堿基對數(shù)目（kb）道爾頓（×106）1234567823.1309.4196.5574.3712.3222.0280.5640.12515.06.124.262.841.511.320.370.08表2-2 DNAHind酶解片段注 意 事 項1. 溴乙錠（EB）是誘變劑，配制和使用時應帶乳膠手套，并且不要將該溶液灑在桌面或地面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必

17、須經(jīng)過專門處理后，才能進行清洗或棄去。2. DNA酶解過程中，使用的器具都應干凈，并經(jīng)消毒。配制時急需用滅菌的雙蒸水，還要防止限制性內(nèi)切酶被污染。3. 加樣量的多少取決于加樣槽最大容積。可以采用大小不同的樣品槽模板以形成容積不同的加樣槽，加入樣品的體積應略小于加樣槽容積，為此，對于較稀的樣品液應設法調(diào)整其濃度或加以濃縮。4. DNAHind酶解后應有8條帶，但實際上只能看見6條，分子量小的2條帶由于其熒光弱，往往看不見。思考題1. 名詞解釋：DNA；限制性內(nèi)切酶；Marker2. 根據(jù)實驗結(jié)果，解釋瓊脂糖凝膠電泳測定DNA片段大小的根據(jù)，聚丙烯酰胺凝膠電泳能否測定DNA分子的大小，它們的區(qū)別是

18、什么？3. 說明DNA限制性內(nèi)切酶圖譜的構(gòu)建在核酸研究和遺傳工程等方面的應用價值。實驗三植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨基作用(4學時)目的要求1. 掌握轉(zhuǎn)氨基作用的特點，了解轉(zhuǎn)氨酶的作用；2. 學習紙層析基本技術。原 理植物體內(nèi)通過轉(zhuǎn)氨酶的作用，-氨基酸上氨基可轉(zhuǎn)移到-酮酸原來酮基的位置上，結(jié)果形成一種新的-酮酸和一種新的-氨基酸，所生成的氨基酸可用紙上層析法檢出。試劑和器材一、試劑綠豆芽子葉及胚軸，0.1mol/L丙氨酸溶液，0.1mol/L-酮戊二酸溶液（用NaOH中和至pH7），含有0.4mol/L蔗糖的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH8.0），磷酸緩沖液（pH7.5），正丁醇，甲酸，0.1mol/L谷

19、氨酸溶液，0.1%0.25%茚三酮丙酮溶液。二、器材研缽，10ml量筒，離心機，試管，移液管，恒溫箱，漏斗，層析缸，層析紙，毛細管，吹風機。操作方法一、酶液的提取取發(fā)芽23天的綠豆芽5g，放入研缽中，加2ml磷酸緩沖液（pH8.0）研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管。研缽再用該1ml緩沖溶液沖洗，并入離心管中，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液備用。二、酶促反應取3支試管編號，按下表分別加入試劑和酶液（單位ml）管號0.1mol/L-酮戊二酸溶液0.1mol/L丙氨酸溶液酶液磷酸緩沖液（pH7.5）10.50.50.51.520.50.52.030.50.52.0將試管搖勻后置于37恒溫箱

20、中保溫30min。取出后各加3滴30%三氯乙酸溶液終止酶反應，于沸水浴中加熱10min，使蛋白質(zhì)完全沉淀，冷卻后離心或過濾，取上清液或濾液備用。三、層析取層析紙一張，在距底線2cm處用鉛筆劃一水平線，在線上等距離確定5個點，作為點樣位置，相鄰各點間距2.5cm。取上述上清液或濾液及谷氨酸、丙氨酸標準液分別點樣，反應液點56滴，標準液點2滴。每點一次用吹風機吹干后再點下一次。最后沿垂直于基線的方向?qū)V紙卷成圓筒，以線縫合，注意紙邊不能疊在一起或接觸。在層析缸中放入正丁醇、甲酸、水推動劑的混合試劑（15:3:2）。待缸內(nèi)蒸氣飽和后，將濾紙筒垂直放入，展層，待溶劑前沿上升至距濾紙前沿約2cm取出，用

21、鉛筆標出前沿位置。吹干，剪斷縫線，以0.1%0.25%茚三酮丙酮溶液噴霧，置烘箱（60）內(nèi)或用吹風機烘干后顯色。思 考 題1. 名詞解釋：聯(lián)合脫氨基作用；轉(zhuǎn)氨基作用；氧化脫氨基作用2. 圖示或張貼層析圖，鑒定丙氨酸和-酮戊二酸是否進行了轉(zhuǎn)氨基作用，并寫出相關的反應式。3. 實驗操作過程中，為何不能用手接觸濾紙？實驗四唾液淀粉酶的性質(zhì)（4學時）目的要求1. 了解酶的專一性，掌握檢查酶的專一性的原理及方法。2. 了解激活劑和抑制劑對酶促反應速度的影響，學習檢查激活劑和抑制劑影響酶促反應速度的方法。3. 了解pH對酶活性的影響以及最適pH的含義，學習測定酶最適pH的方法。4. 了解溫度對酶活性的影響

22、以及最適溫度的含義，學習測定酶最適溫度的方法。原 理一、酶的底物專一性酶的專一性是指一種酶只能對一種底物或一類底物起催化作用，對其他底物無催化反應。如淀粉酶只能催化淀粉水解，蔗糖酶只催化蔗糖的水解。淀粉與蔗糖均無還原性，與Benedict試劑無呈色反應。但淀粉的水解產(chǎn)物為葡萄糖，蔗糖水解產(chǎn)物為果糖及葡萄糖，二者均由還原性，能與Benedict試劑反應，生成磚紅色沉淀。本實驗以此顏色反應觀察唾液淀粉酶（內(nèi)含淀粉酶和少量麥芽糖酶）和蔗糖酶分別對淀粉及蔗糖的催化作用，觀察酶的專一性。二、激活劑和抑制劑對酶促反應速度的影響在酶促反應中，酶的激活劑或抑制劑可分別加速或抑制酶的活性，如氯化鈉在低濃度時為唾

23、液淀粉酶的激活劑，而硫酸銅則是它的抑制劑。本實驗利用水解不同階段淀粉與KII2有不同的顏色反應，定性觀察唾液淀粉酶在酶促反應中激活或抑制現(xiàn)象。淀粉經(jīng)酶促水解為葡萄糖的不同階段與碘作用的顏色反應如下：三、pH對酶活性的影響酶的催化活性與環(huán)境pH有密切關系，通常各種酶只在一定pH范圍內(nèi)才具有活性，酶活性最高時的pH，稱為酶的最適pH。高于或低于此pH時酶的活性逐漸降低。不同的酶最適pH不同，對于同一個酶，其最適pH因緩沖液和底物的性質(zhì)不同而有差異。如唾液淀粉酶在磷酸緩沖液中最適pH為6.46.6，而在乙酸緩沖液中則為5.6。四、溫度對酶活性的影響酶促反應開始時，反應速度隨溫度升高而增快。達到最大反

24、應速度時的溫度稱為酶的最適溫度。由于絕大多數(shù)酶是有活性的蛋白質(zhì)，當達到最適溫度后繼續(xù)升高溫度，引起蛋白質(zhì)變性，酶促反應速度反而下降。本實驗利用唾液淀粉酶在不同溫度下催化淀粉水解，水解產(chǎn)物與KII2顯色的深淺，可判別水解程度。試劑和器材一、試劑1. 新鮮唾液稀釋液：每組同學進實驗室后自己制備。唾液1ml（不包括泡沫），用蒸餾水稀釋至100ml，棉花過濾備用。唾液稀釋倍數(shù)因人而異，可稀釋100400倍。2. 蔗糖酶溶液：4ml/組（新鮮配制）稱取干酵母100g，置乳缽中，并加少許蒸餾水及石英砂，用力研磨，提取1h，加蒸餾水使總?cè)莘e為500ml。3. 碘化鉀碘液： 5ml/組 共100ml取碘化鉀2

25、0g和碘10g溶于100ml蒸餾水中，使用前稀釋10倍。4. 緩沖溶液：各種緩沖液共配制200ml用0.2mol/L磷酸氫二納溶液和0.1mol/L檸檬酸溶液配制pH5.0，5.4，6.0，6.4，6.8，7.4，8.0的緩沖溶液。稱取Na2HPO4·2H2O35.61克，用蒸餾水定容至1000ml；另稱取C6H8O7·H2O21.01克，用蒸餾水定容至1000ml。根據(jù)下表配制緩沖液：（單位/ml）pH0.2mol/L Na2HPO4溶液0.2mol/L C6H8O7溶液5.0103.097.05.4111.588.56.0126.373.76.4138.561.56.8

26、154.545.57.4181.718.38.0194.55.55. Benedict試劑：10ml/組溶解85克Na3C6H3O7·11H2O及50克無水碳酸鈉于400ml水中；另溶8.5克硫酸銅于50ml熱水中。將硫酸銅溶液緩緩傾入檸檬酸鈉碳酸鈉溶液中，邊加邊攪拌。6.其余試劑0.1%淀粉溶液500ml，1%氯化鈉溶液200ml，0.1%硫酸銅溶液200ml，0.3%氯化鈉的0.5%淀粉溶液1500ml，2%蔗糖250ml 二、器材試管（22支/組），試管架1個/組，玻璃棒1支/組，水浴（37水浴，60水浴），酒精燈（及火柴）1個/組，量筒（100ml×1個，10ml×1個），燒杯（100ml×3個/組），膠頭滴管（1支/組），試管夾1個/組，點滴板1個/組，移液管（1ml×5/組，2ml×3/組，5ml×10/組），試劑瓶（14個/組，附膠