1、BTLA 在T細胞上的表達和功能 作者：王月穎,王雪峰, 張學光, 顧宗江【摘要】 目的: 研究BTLA（B and T lymphocyte attenuator）在T細胞上的表達和功能。方法: 分離純化人外周血T細胞, 流式細胞術檢測BTLA在不同T細胞亞群上的表達。進一步用CD3抗體分別和游離、 包被以及抗Fc段二抗交聯的BTLA激發單克隆抗體（mAb）或HVEMFc融合蛋白共同刺激T細胞活化, MTT檢測細胞增殖。結果: BTLA組成性表達于CD3+、 CD4+和CD8+T細胞表面。游離的BTLA mAb和HVEMFc融合蛋白均不能抑制CD3刺激的T細胞增殖, 然而包被和交聯后的BTL

2、A mAb和HVEMFc融合蛋白則能夠明顯抑制T細胞增殖。結論: BTLA的活化能顯著抑制CD3抗體所活化的T細胞的增殖。 【關鍵詞】 BTLA; 共刺激分子; 抑制; T細胞T細胞的活化依賴于雙信號的共同刺激。T細胞受體（TCR）識別抗原提呈細胞（APC）上抗原肽MHC復合體, 啟動了T細胞活化的第一信號; APC上共刺激分子與T細胞膜上相應受體結合則提供了T細胞活化的第二信號。第二信號既包括增強T細胞反應的正性信號, 也包括抑制T細胞反應的負性信號。CD28是促進T細胞初始活化的重要共刺激分子, 能夠增進IL2的合成, 維持T細胞反應; 與之相反, CTLA4抑制T細胞活化, 然而, 它們

3、都與表達在APC表面的B71和B72結合1。CD28家族另外一個刺激分子ICOS與B7h結合, 增強效應T細胞的反應2。PD1是繼CTLA4之后發現的負性共刺激分子, 具有兩個配體PDL1和 PDL23。BTLA（B and Tlymphocyte attenuator）是CD28家族新近發現的負性共刺激分子4。BTLA-/- T細胞對CD3mAb刺激的增殖較野生型T細胞更敏感5。與其他家族成員不同, BTLA的配體不屬于B7家族成員, 而是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族的HVEM6。值得一提的是, HVEM與TNF家族配體LIGHT結合能增強T細胞活化7, 然而, HVEM與BTLA結合卻

4、產生抑制T細胞的作用8, 因此HVEMBTLA是一對比較特殊的信號分子。1 材料和方法1.1 材料淋巴細胞分離液Ficoll(上海生化試劑二廠); 96孔細胞培養板（Costar公司）; RPMI1640培養基（Gibco公司）; 胎牛血清FCS（杭州四季青公司）; 激發型CD28 mAb和BTLA mAb 8H9均為本室自行研制; CD3激發型抗體（Beckman Coulter）; 人HVEMFc融合蛋白（R&D公司）; PE標記鼠抗人BTLA抗體（eBioscience）; FITC標記鼠抗人CD4和CD8抗體（eBioscience）; 羊抗鼠Fc段抗體和羊抗人Fc段抗

5、體（crosslink 抗體, Bethyl公司）; 人T細胞陰性分選試劑盒（StemCell Technologies）。二氧化碳培養箱（Jouan公司）; 流式細胞儀（BeckmanCoulter公司）。1.2 方法1.2.1 外周血T細胞分離及純化采集健康志愿者外周全血, 經Ficoll密度梯度離心獲得外周血單個核細胞（PBMC）, 進一步按人T細胞陰性分選試劑盒說明書方法, 磁珠分離T細胞, 檢測 T細胞純度 96%。1.2.2 流式細胞檢測BTLA在T細胞的表達分離純化的T細胞用PBS洗滌后重懸于100L PBS中, 加入PE標記鼠抗人BTLA抗體、FITC標記鼠抗人CD4、CD8抗

6、體, 4作用30 min, 洗滌后上流式細胞儀檢測。1.2.3 T細胞的活化 用CD3抗體分別和不同濃度的8H9、人HVEMFc融合蛋白及對照IgG共同包被96孔板, 4過夜,用PBS洗滌; 或CD3抗體包被過夜后加入不同濃度的游離8H9、人HVEMFc融合蛋白及對照IgG。將分離純化的T細胞密度調整為1×109/L, 每孔加入100L。在抗體交聯實驗中, 96孔板CD3抗體包被過夜后, 加入不同濃度的游離8H9、人HVEMFc融合蛋白及對照IgG, 繼而加入T細胞, 置于37、50 mL/LCO2培養箱中孵育1 h, 然后加入抗Fc段抗體, 37、50 mL/L CO2培養箱中繼續

7、培養。1.2.4 T細胞增殖檢測刺激活化的T細胞培養3d, 于培養的最后4h加入20L MTT溶液（5g/L）繼續培養, 吸取上清, 加入100L酸化異丙醇徹底溶解結晶, 用酶標儀A570波長比色。1.2.5 統計學分析數據用平均值x±s表示。兩組樣本均數的比較采用t檢驗, 以P<0.05 為有統計學意義。2 結果2.1 BTLA在靜止T細胞上的表達流式細胞術檢測顯示, BTLA組成性表達于靜止T細胞上。大約84% CD3+T細胞上表達BTLA, CD4+T上的表達高于CD8+T, 表達量分別是87%和77%（圖1）。2.2 BTLA mAb 8H9對T細胞增殖的影響B

8、TLA的胞內區包含2個免疫受體酪氨酸抑制性基序(ITIM), 基序中的酪氨酸磷酸化后, 可以募集酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2, 發揮抑制作用4。我們用CD3抗體包板, 聯合BTLA mAb 8H9共同刺激純化T細胞。結果表明, 游離的8H9不能抑制T細胞的增殖。然而, 8H9與CD3抗體一起包板后, 和對照抗體相比, 明顯產生抑制T細胞增殖的作用（P<0.05）, 并且抑制效果具有濃度依賴性（圖2A）。以前的研究表明, mAb與微球相偶聯, 可以在液相中發揮作用9。本實驗在CD3和游離8H9刺激的T細胞中加入針對Fc的二抗, 對8H9 mAb進行交聯, 結果表明8H9經過交聯后

9、, 能明顯抑制T細胞的增殖（P<0.05）, 并且與包板的8H9相似, 隨著濃度的增加, 抑制作用更明顯（圖2B）。2.3 HVEMBTLA通路抑制T細胞增殖表達在T細胞上的HVEM與其配體LIGHT結合, 可以促進T細胞的活化, 而與BTLA結合, 則通過后者傳遞抑制信號。實驗中利用HVEMFc融合蛋白來研究HVEMBTLA這對信號分子對T細胞的影響。與8H9相同, 包被固定的HVEMFc可產生抑制作用, 而游離的HVEMFc不能抑制CD3活化的T細胞增殖（圖3A）。當用抗Fc抗體將HVEMFc融合蛋白交聯后, 亦能明顯抑制T細胞增殖（P<0.05, 圖3B）,

10、并且HVEMFc融合蛋白在CD3抗體小于0.5 mg/L時抑制效果最好（P<0.05, 圖3C）。3 討論 BTLA是CD28家族發現的第3個抑制性共刺激分子。與CTLA4和PD1相似, BTLA分子的酪氨酸經誘導磷酸化后, 可以招募SHP1和SHP2, 產生抑制信號, 阻礙T細胞的活化4。我們的研究表明, BTLA組成性高表達于初始T細胞表面。與此不同, CTLA4和PD1僅誘導表達于活化T細胞表面1, 由此推測這些分子可能在T細胞免疫應答的不同階段發揮作用。 共刺激分子在免疫應答的各個階段都起著非常重要的作用。以往利用共刺激分子配體的Fc融合蛋白進行研究時, 需將Fc融合蛋白

11、包被固定在培養板上, 才能發揮作用。當Fc融合蛋白未固定, 而在液體中處于游離狀態時, 就無法對共刺激分子發揮作用7。在利用針對共刺激分子的mAb進行研究時, 也會遇到相同的問題, 即大部分mAb需要包被固定在板上, 才起作用。如果mAb游離在液體中, 就起不到有效的作用。這為研究共刺激分子在免疫應答各個階段的不同時相的作用, 帶來許多困難和不便。還有研究發現將mAb與微球通過化學方法偶聯在一起, mAb就可以在液相中發揮作用9。但mAb與微球的偶聯則帶來了操作上的繁瑣與不便。在本實驗中, 我們針對在液相中處于游離狀態的mAb或Fc融合蛋白, 加入抗Fc段的抗體, 將mAb或Fc融合蛋白上的F

12、c段進行交聯（crosslinking）, 起到了加強mAb或Fc融合蛋白的作用, 使其在液相游離狀態下, 亦能起到有效的作用。此方法簡便易行, 容易控制。由于BTLA與其他兩個負性共刺激分子CTLA4和PD1的表達時相有所不同, 因此, 在采用上述交聯方法后, 我們對BTLA在免疫應答不同時相的作用, 分別進行了研究, 取得了有意義的結果, 將另文發表。【參考文獻】 1Coyle AJ, GutierrezRamos JC. The expanding B7 superfamily: increasing complexity in costimulatory signals regulat

13、ing T cell functionJ. Nat Immunol, 2001, 2(3): 203-209.2Tafuri A, Shahinian A, Bladt F, et al. ICOS is essential for effective Thelpercell responsesJ. Nature, 2001, 409(6816): 105-109.3Latchman Y, Wood CR,Chernova T, et al. PDL2 is a second ligand for PD1 and inhibits T cell activationJ. Nat Immunol

14、, 2001, 2(3): 261-268.4Watanabe N, Gavrieli M, Sedy JR, et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA4 and PD1J. Nat Immunol, 2003, 4(7): 670-679.5Krieg C, Boyman O, Fu YX, et al. B and T lymphocyte attenuator regulates CD8+ T cellintrinsic homeostasis and memory cell gen

15、erationJ. Nat Immunol, 2007, 8(2): 162-171.6Sedy JR, Gavrieli M, Potter KG, et al. B and T lymphocyte attenuator regulates T cell activation through interaction with herpesvirus entry mediatorJ. Nat Immunol, 2005, 6(1): 90-98.7Tamada K, Shimozaki K, Chapoval AI, et al. LIGHT, a TNFlike molecule, cos

16、timulates T cell proliferation and is required for dendritic cellmediated allogeneic T cell responseJ. J Immunol, 2000, 164(8): 4105-4110.8Tao R, Wang LQ, Murphy KM, et al. Regulatory T cell expression of herpesvirus entry mediator suppresses the function of B and T lymphocyte attenuatorpositive effect