1、實時熒光定量PCR檢測感病蝗蟲體內綠僵菌rDNA基因*中國生物工程雜志China Biotechnology, 2005, 25(11):7175張清平1,2彭國雄1,2,3王中康1,2,3殷幼平1,2,3夏玉先1,2,3*(1 重慶大學生物工程學院生物力學與組織工程教育部重點實驗室重慶400030)(2 重慶大學生物工程學院基因工程研究中心重慶400030)(3 重慶大學生物工程學院重慶市殺蟲真菌工程技術中心重慶400030)摘要根據綠僵菌23S rDNA的轉錄間隔區（ITS）和5.8S的基因序列，設計檢測感病蝗蟲體內綠僵菌菌體DNA分子的特異引物，通過優化感病蝗蟲菌體DNA快速制備方法，建

2、立了基于熒光定量PCR的定量檢測體系。該檢測方法專一、靈敏，檢測下限為10pg/l綠僵菌，并且能從剛侵染48h的東亞飛蝗血淋巴中，早期定量檢測到在蟲體血淋巴中增殖的綠僵菌的rDNA。 關鍵詞綠僵菌蝗蟲定量檢測實時熒光定量 PCR收稿日期：20050418修回日期：20050901*國家“863”計劃資助項目(2004AA246050)* 通訊作者，電子信箱：yuxianxia綠僵菌作為蝗蟲的重要病原真菌，已廣泛應用于蝗蟲防治。綠僵菌生物制劑已被世界糧農組織（FAO）推薦為環保產品，在非洲和澳洲以及中國大面積推廣應用于蝗蟲的生物防治1,2。類似于觸殺性殺蟲劑，附著在蟲體表面的綠僵菌孢子必須萌發、

3、形成芽管和附著胞，穿透寄主體壁侵入蝗蟲體內，以菌絲段或蟲菌體等形態存在于寄主的血淋巴中3。雖然昆蟲病原真菌的致病機制十分復雜，但是病原真菌菌體在寄主體內快速增殖是使寄主昆蟲罹病、死亡的前提，其增殖數量及速率直接影響病程及殺蟲效率。病原真菌在寄主體內的生長繁殖情況能夠直接反映致病進程，可成為殺蟲真菌菌株及其制劑毒力評價的重要指標。傳統的真菌檢測方法難以快速定量檢測昆蟲體內復雜環境中的真菌，不能滿足相關研究需要。實時定量PCR已成功地用于定量檢測人體病原真菌、環境真菌、植物病原真菌等。Gachon 等（2004）利用實時定量PCR監測植物病原真菌在寄主體內的生長情況，將病原真菌在寄主體內的早期生長

4、量作為評價植物病原真菌的致病性指標。建立實時熒光PCR定量檢測昆蟲體內綠僵菌的體系，可以早期定量檢測東亞飛蝗體內病原真菌的數量，確定病原真菌在東亞飛蝗體內的增殖速率和動態變化，對于昆蟲病原真菌的致病機理研究、真菌生防制劑配方優化都具有重要意義。1材料與方法1.1材料供試菌株：綠僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株CQMa102，為殺蝗專一菌株,分離自重慶縉云山自然感病的黃脊竹蝗（Ceracris kiangsu），保存于重慶大學基因工程研究中心。供試蝗蟲：東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis（Mey）新羽化雄成蟲，由重慶大學基因工程研究中心昆蟲

5、室提供。1.2試劑與儀器蝸牛酶、崩潰酶（北京鼎國生物技術發展中心），蛋白酶K（MERCK），十二烷基磺酸鈉 (SDS，BioRad)，iQTM SYBR Green supermix（BioRad），巰基乙醇、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉等其它化學試劑均為國產分析純。臺式離心機（TGL16G，上海安亭科學儀器廠），高速冷凍離心機（J20XP， BECKMAN），離心機（5417R，Eppendorf），水平電泳儀（BioRad），紫外分光光度計（Du640，BECKMAN），超聲波細胞粉碎儀（JY92，寧波新芝科器研究所），Icycler iQ 定量PCR儀（BioRad）。1.3方法綠

6、僵菌孢子培養及接種孢子懸浮液配制:將綠僵菌孢子從平板上刮下，無菌水洗滌后用棉子油混和，超聲波分散均勻，調節孢子濃度為108個/ml，供接種用。接種方法及接種后蝗蟲的飼養4: 在每只新羽化東亞飛蝗雄蟲前胸背板下接種5l濃度1×108綠僵菌孢子的懸浮液,在28、80RH的條件下飼養。 綠僵菌分生孢子DNA制備：將CQMa102孢子接種到1/4 SDA液體培養基中，28搖瓶培養48h，用紗布過濾收集菌體。采用氯化芐法提取基因組DNA5。2005, 25(11)張清平 等：實時熒光定量PCR檢測感病蝗蟲體內綠僵菌rDNA基因中國生物工程雜志 China Biotechnology Vol.2

7、5 No.11 2005圖1定量PCR引物對的特異性分析Fig. 1Specificity analysis of the primer pair(a): Melting curve profile; (b): Electrophoresis of PCR products 1: CQMa102; 2: L. migratoria manilensis; 3: Negative control; 4: DNA ladder健康東亞飛蝗成蟲DNA制備：參見文獻6。罹病東亞飛蝗體內DNA制備：取10l罹病東亞飛蝗血淋巴于1.5 ml離心管中，加入1l蛋白酶K（20g/l）和1l SDS（10），5

8、0 水浴30min，離心去上清；加入50l預處理液（0.1mol/L EDTA，0.4%巰基乙醇）30水浴30min，離心去上清；加入100l 洗滌液（0.2mol/L磷酸二氫鈉，0.1mol/L檸檬酸，pH6.0）離心去上清；加入真菌細胞壁裂解液：20 g/l 蝸牛酶、20g/l崩潰酶和0.1mol/L EDTA， 30水浴30min ；用市售微濾柱離心過濾，10l無菌水溶解DNA，存于-20備用。引物設計:根據綠僵菌CQMa102菌株23S rDNA的轉錄間隔區（ITS）和5.8S的基因序列7，用Primer Primers軟件設計綠僵菌特異引物對， CQMaPF1：5 tggcatctt

9、ctgagtggtg 3和CQMaPR1： 5cccgttgcgagtgagtta 3（上海博亞生物技術有限公司合成），預期擴增片斷長度329bp。引物特異性測定：分別以1g/l綠僵菌和東亞飛蝗基因組DNA 為模板，采用Icycler iQ定量PCR儀進行定量PCR擴增。反應體系25l/管：模板1l，綠僵菌引物對終濃度0.4mol/L，iQTM SYBR Green supermix sample 12.5l，加水至25l。FQPCR反應條件：94 3 min；94 10s，60 10s，72 10s，72實時采集熒光，共40個循環；72延伸5min。測定熔解曲線的反應條件：95，0s；55，

10、10s，95，10s，每隔10s升高0.5，實時收集熒光。標準曲線建立:測定綠僵菌CQMa102菌體模板DNA的OD值，計算模板DNA濃度，按10倍系列稀釋成1×101g/ml、1g/ml、1×10-1g/ml、1×10-2g/ml、1×10-3g/ml、1×10-4g/ml，以上述模板為標準品進行定量PCR擴增，以熒光信號的累計反映PCR進程。利用IcyclerTM IQ Opitical System Software Version 3.0a軟件（BioRad）自動進行數據分析并繪制標準曲線。常規鏡檢:接種綠僵菌孢子后，每天定時采集蝗蟲血

11、淋巴制片后，在數碼光學顯微鏡(400×)下觀察并采集圖像。2結果與分析2.1引物特異性從圖1可以看出：綠僵菌基因組DNA熔解曲線僅有一個明顯的單峰，而東亞飛蝗基因組DNA未出現高峰(a)。與此結果相一致，從綠僵菌DNA可擴增出靶帶，而東亞飛蝗基因組DNA中不能擴增出任何DNA譜帶（b）。這表明，設計的引物對特異性強，以該引物對進行PCR能夠區分CQMa102與東亞飛蝗的基因組DNA，適合于定量檢測東亞飛蝗體內的綠僵菌。2.2標準曲線建立及檢測靈敏度用2.1中得到的特異引物，以不同濃度綠僵菌菌體DNA為模板進行定量PCR擴增，制作標準曲線的動力曲線(圖2a)和標準曲線(圖2b)，由Ic

12、yclerTM IQ 自動擬合標準曲線，擬合方程為：Y=-3.645X+15.875 (Y軸為Ct值，X軸為模板DNA濃度的對數)，PCR擴增效率為88.1%，模板DNA的線性檢測范圍為10-410g/ml。圖2CQMa102的標準曲線 （a）: 動力曲線; （b）: 標準曲線Fig. 2Quantification of serial diluted DNA of CQMa102(a): Kinetics of fluorescence signal at different concentrations of DNA; （b）: Standard curve obtained by plo

13、tting the concentration ofDNA versus the cycle number2.3最適接種時期測試因新羽化的東亞飛蝗健康雄蟲的體重以0.70.8g居多，故選取該體重的健康雄蟲進行試驗。分別在東亞飛蝗羽化12h、24h和36h后進行接種試驗。每個羽化時間下設5個平行樣，接種試驗重復3次。接種后定期從罹病蝗蟲血淋巴中提取DNA進行定量PCR檢測，檢測結果Ct值通過標準曲線換算為DNA濃度（用10x表示），并用DPS數據處理系統進行統計分析。檢測結果：羽化的蝗蟲侵染60h后血液中綠僵菌DNA的濃度分別為：10-2.185±0.202、10-2.789±

14、;0.035和10-3.244±0.032g/ml，羽化12h和24h檢測結果差異顯著（P0.05），羽化12h和羽化36h檢測結果差異極顯著（P0.01）。這表明，東亞飛蝗羽化后隨著時間的推移，蟲體體壁加厚，外骨骼硬化，病原菌侵入機率減小。蝗蟲羽化初期因體壁柔軟，綠僵菌更易入侵，新羽化蝗蟲個體差異很大，導致真菌的侵染速率差異增大，不利于其體內真菌的定量檢測；羽化36h的東亞飛蝗個體差異較小，但綠僵菌入侵較難。綜合考慮綠僵菌的侵染速度與檢測穩定性因素，選擇羽化24h的東亞飛蝗進行試驗。2.4罹病東亞飛蝗血淋巴中綠僵菌菌體數量的動態變化用綠僵菌接種東亞飛蝗后，在不同時間從罹病蝗蟲血淋巴

15、中提取增殖綠僵菌菌體的DNA進行FQPCR測試，同時在數碼顯微鏡下觀察。將循環閾值Ct值通過標準曲線換算為DNA 濃度（用10x表示），并用DPS數據處理系統進行統計學分析。FQPCR測試結果（表1）：在接種60h之前，隨著時間的延長，東亞飛蝗體內綠僵菌DNA濃度逐漸增加；接種60h后，綠僵菌DNA濃度迅速上升,到72h時綠僵菌DNA濃度比60h時增加近1 000倍（3個數量級）。 表1蝗蟲血淋巴中綠僵菌DNA濃度變化Table 1Changes in DNA concentration ofM. anisopliae in the haemolymph of mycosedlocust at

16、 different time after inoculation侵染時間(h)DNA 濃度(10x g/ml)24-36-4.254±0.03248-3.683±0.03560-2.745±0.033721.732±0.034數碼顯微鏡下觀察結果(圖3), 接種后48h取蝗蟲血淋巴制樣檢查未能發現增殖的綠僵菌，接種60h后可以找到少許綠僵菌菌絲段，而在接種72h以后，才可以從蝗蟲血淋巴中觀察到大量的綠僵菌菌絲段。 圖3接種后綠僵菌菌體在罹病東亞飛蝗血淋巴內的形態Fig. 3The morphology of hypha, hyphabody and m

17、ycelia of M. anisopliae against Locusta migratoria manilensis male adult after inoculation with M. anisopliae oil miscible formula1: Haemocyte; 2: Metarhizium anisopliae var. acridum strain CQMa1023討論如何從東亞飛蝗體內穩定地獲得適合于PCR擴增的DNA模板，是建立昆蟲血淋巴中昆蟲病原真菌定量檢測體系的關鍵技術。真菌細胞壁主要由幾丁質和1，3葡聚糖等組成，經用蝸牛酶、崩潰酶等制備真菌原生質體的破壁酶

18、單一或混和處理有助于綠僵菌胞壁的消解，復合酶的破壁效果優于單一酶類8；而對大分子具有解聚作用的DTT、巰基乙醇等硫醇試劑，能夠使真菌細胞壁中的某些組分發生改變或破壞，有利于酶分子的進入，從而促進真菌細胞壁的降解。本文采用基于混和酶的胞壁裂解液，可使綠僵菌孢子在2h內完全崩解，并通過微濾柱去除血液中的PCR反應抑制物質，得到適用于PCR擴增的綠僵菌DNA模板。該方法無需酚氯仿抽提，簡便、快速、樣品穩定，也適合從微量樣品中制備其它真菌DNA模板。罹病昆蟲體內的增殖真菌菌體包括液生孢子、菌絲段或蟲菌體3，傳統上用顯微鏡法觀察計數，這種方法因真菌侵入昆蟲血腔后的菌體形態的多樣性，芽生孢子、菌絲段或蟲菌

19、體等3，不便區別，難以正確計數, 導致顯微鏡觀察計數的實驗誤差偏大。另外，顯微鏡觀察計數要求血球計數器的計數室每小格內有510個菌體以上，才有統計學意義9，即綠僵菌菌體濃度應在104個/l，而侵染初期蝗蟲血淋巴中含綠僵菌菌體數量(20l/只成蟲)遠低于此值，盡管在侵染后期罹病蟲體干縮變硬成為僵蟲時，體內菌體數量會大大增殖，但此時已不能從蟲體采血計數，所以常規的鏡檢計數方法不能滿足對昆蟲體內的真菌菌體早期檢測的需要。本文利用基于綠僵菌rDNA基因片段設計的PCR引物對、優化的DNA制備方法以及熒光定量PCR技術早期檢測昆蟲體內的病原真菌DNA，操作簡便、快速、靈敏、準確，綠僵菌CQMa102接種

20、后36h即可檢出，而顯微鏡觀察計數法要在接種72h才容易觀察。因此，熒光定量PCR方法不但縮短檢出時間，而且結果客觀、準確，可以早期檢測東亞飛蝗體內增殖綠僵菌的不同形態菌體的數量，以確定病原真菌在東亞飛蝗體內的增殖速率和動態變化。可以滿足綠僵菌毒力菌株選育、不同制劑配方、質量評價以及監控過程中對殺蟲毒力評價的需要，另外對昆蟲病原真菌入侵后的殺蟲機理、毒力因子鑒定等基礎研究都具有重要意義。參考文獻1 Hunter D M, Milner R J, Spurgin P A. Aerial treatment of the Australian plague locust Chortoicetes

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