1、枯草芽孢桿菌的發酵學院：化工學院專業：生物工程班級：生物10-2姓名：姜霞摘要枯草芽孢桿菌是我國農業部允許作為飼料添加劑的15種菌種之一 ,其已被越來越多地制成飼用微生態制劑。因其制劑是無毒、無殘留、無污染 的“綠色”添加劑，故具有廣闊的發展前景，并已在畜牧業、飼料業廣泛應用，顯示巨大的社會效益和生態效益。通過搖床培養篩選出較適宜于枯草芽孢桿菌發酵的培養基配方，發酵培養基配方確定后，在搖床條件下，通過對溫度、初始值、初始接種量、裝液量、搖床轉速等發酵條件的摸索，確定最佳發酵條件。在搖瓶條件下優化發酵培養基和發酵工藝后，采用發酵罐進行發酵培養，對枯草芽孢桿菌在液體發酵過程中的菌體數量、值、總糖含

2、量和總氮含量四個因素隨時間的變化進行了觀察。枯草芽孢桿菌，是芽孢桿菌屬的一種。單個細胞 0.70.8×23微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.60.9×1.01.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色。枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質，這些物質對致病菌或內源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用。枯草芽孢桿菌迅速消耗環境中的游離氧，造成腸道低氧，促進有益厭氧菌生長，并產生乳酸等有機酸類，降低腸道pH值，間接抑制其它致病菌生長。枯草芽孢桿菌菌體自身

3、合成-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內的消化酶類一同發揮作用，能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動物體內干擾素和巨噬細胞的活性，在飼料中應用廣泛。它還可以用來改善水質，應用在污水處理和環境保護中。和其它微生物混合使用，還可以用于生物肥料和土地改良等 關鍵詞：枯草芽孢桿菌 生長 發酵 活菌數第一章 材料與方法1.1材料菌種枯草芽孢桿菌培養基（1）LB培養基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，pH為7，（可溶性淀粉20g）瓊脂20g。（2）篩選用培養基：含有2%可溶性淀粉的LB培養基。（3）種子培養基：豆餅粉4%，玉米粉

4、3%，NaHPO0.8%，(NH)SO0.4%，NHCl0.15%，HO。（4）發酵培養基：豆餅粉5.6%，玉米粉7.2%，NaHPO0.8%，(NH)SO0.4%，NHCl0.13%，CaCl0.13%，淀粉酶50g。主要試劑蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麥芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化銨、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、氯化鈉和氯化鈣。儀器設備控溫搖床、高壓蒸氣滅菌鍋、電子天平、pH測定儀、無菌操作臺和紫外分光光度計。1.2方法1.2.1 培養基的制備(1)稱量按培養基配比依次準確地稱取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入燒杯中，并在燒杯中加入少量蒸餾水。注：酵母

5、膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，酵母膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。(2)溶化可溶性淀粉溶液的配制方法：將所需克數的可溶性淀粉放入一個小燒杯中，加入少量蒸餾水，攪拌成糊狀，然后將糊狀溶液均勻倒入少于培養基總體積的沸水中，一邊攪拌一邊加熱，待其溶化成透明狀后繼續在電爐上加熱5分即制成可溶性淀粉溶液。如果配制固體培養基時，將已準備好的可溶性淀粉溶液倒入燒杯中，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，補水到所需的總體積。在制備用三角瓶盛固體培養基時，一般也可先將一定量的液體培養基分裝于三角瓶中，然后按2%的

6、量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中，不必加熱溶化，而是滅菌和加熱溶化同步進行，節省時間。在瓊脂溶化過程中，應控制火力，以免培養基因沸騰而溢出容器。同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。配制培養基時，不能用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進入培養基中，影響細菌生長。(3)調pH培養基配好以后，先用精密pH試紙測量培養基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養基中逐滴加1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH，直到pH達7為止；反之，用1mol/LHCl進行調節。對于有些要求pH較精細的微生物，其pH的調節可用酸度計進行。注意：pH不要調過頭，以避免回調而影響培養基內各離子的濃度，配制pH低的瓊脂

7、培養基時，若預先調好pH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固，因此應將培養基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調整pH。(4)分裝按照實驗要求，可將配置的培養基分裝入試管內或三角瓶中。液體分裝：分裝的高度以試管高度的1/4左右為宜；分裝三角瓶的量則根據需要而定，一般以不超過三角瓶的一半為宜。固體分裝：分裝于試管中的應不超過試管的1/5，滅菌后制成斜面；分裝三角瓶的量以不超過一半為宜。(5)加塞培養基分裝完畢后，在試管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能。(6)包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時

8、冷凝水潤濕棉塞，外邊再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養基名稱，組別，配制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結扎好，使用時容易解開，同樣注明。(7)滅菌將配置好且包扎完畢的固體、液體培養基及本實驗涉及的試管、三角瓶等及400ml純水于高壓滅菌器中以0.14Mpa，121條件下高壓蒸汽滅菌20分鐘。(8)斜面擱置將培養基冷卻至50左右時放置斜面，斜面在試管的1/2處為宜，待斜面凝固后，放置于冰箱中待用。菌種的篩選與保藏(1)倒平板將實驗配制好的培養基加熱溶化，待冷卻至5560時，倒平板9皿。(2)稀釋用接種環取菌種，放入盛90ml無菌水的三角瓶中，振搖。用一支1ml無菌吸管吸取1ml菌液加

9、入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10、10、10、10、10、10不同稀釋度的菌液。(3)劃線將平板底面分別用記號筆寫上10、10、10三種稀釋度（共三組）然后用接種環分別沾取濃度為10、10、10稀釋液并對號在相應平板上劃線，室溫下靜止510min，使菌液吸附進培養基。(4)培養將培養基平板倒置于37的培養箱中，培養23天，觀察淀粉圈。對有淀粉圈的菌落，測量淀粉圈的直徑D，菌落直徑，計算的比值，可進行拍照，選擇淀粉圈較大的菌落作為后續實驗的菌種。(5)接種接種到斜面培養基中，標注上日期等信息。放入

10、恒溫培養箱中培養作為一級種子。(6)保藏斜面置于37的培養箱中，培養23天，觀察菌種長勢好壞，若菌種長勢好則將其放入冰箱中保藏，若長勢不好則需多次斜面轉接。枯草芽孢桿菌生長曲線測定(1)取 12支無菌大試管，用記號筆分別標明培養時間即12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22和23h。(2)接種用1ml無菌吸管吸取2ml枯草芽孢桿菌培養液（培養1012h）轉入盛有100mlLB液的三角瓶內，混合均勻。(3)培養將已接種的三角瓶放置37振蕩培養（振蕩頻率為100r/min）分別在培養12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22和23h時，用無菌吸管吸取1

11、ml菌液放入標有相應時間的無菌試管中，立即放入冰箱中儲存，最后一同比濁測定光密度值。(4)比濁測定用無菌水作空白對照，選用660nm波長進行光電比濁測定，從早取出的培養液開始依次測定，對細胞密度大的培養液用無菌水適當稀釋后，使其光密度值在0.10.65之內的生長情況。菌體進入對數生長期即可作為二級種子液用于分批培養發酵實驗。（測定PH值前，將待測定的培養液震蕩，使細胞均勻分布）。PH值測定結果培養時間（h）12345678PH值6.56.76.97.17.37.06.86.4菌種搖瓶培養（1）稱量 根據需要量計算并依此稱取豆餅粉、玉米粉、NaHPO、(NH)SO、NHCl放入三角瓶中，配成20

12、0ml溶液。（2）加塞包裝。（3）滅菌 0.14Mpa，121,20min。（4）接種 接種前一級種子需先放在恒溫培養箱活化（37、12h），冷卻后接種。（5）培養 放入氣浴恒溫振蕩器中37,100r/min培養13h后，鏡檢，觀察菌的生長情況。菌體進入對數生長期即可作為二級種子液用于分批培養發酵實驗。產淀粉酶枯草芽孢桿菌分批培養發酵（1）稱量 根據需要量計算并依次稱量豆餅粉、玉米粉、NaHPO、(NH)SO、NHCl、CaCl、淀粉酶，放入發酵罐中加入蒸餾水配制2.5L發酵液。（2）滅菌 0.14Mpa，121,20min。（3）接種（4）啟動發酵罐，調節發酵系數，開始發酵。發酵參數：溫度

13、37轉速 200r/min通氣量 1.33VVm（012h）2.67VVm（12h發酵結束）pH值 6.5（5）測PH值，繪制生長曲線，并進行鏡檢，觀察菌體生長狀況。（6）發酵結束，放罐。第二章 結果與分析2.1菌種篩選及保藏由于實驗要篩選的菌種已經很純了，所以此次實驗所提到的“篩選”，是要篩選出有活力的、生長狀態良好的純種枯草芽孢桿菌。通過加入少量的可溶性淀粉酶，可以使菌種進行選擇性培養，這樣篩選出來的菌株可以更好地產淀粉酶。篩選出來的菌種要進行保藏，此實驗的保藏方法是放在冰箱中保藏。2.2擴大培養此次實驗采用一次擴大培養，方法是搖瓶培養。擴大培養用的培養基與發酵培養基相似。在氣浴恒溫振蕩器

14、中，發現搖瓶中變渾濁，而且表面有很多氣泡，這說明菌體開始生長了。培養特定時間后，生長出來的菌種就可以用于發酵了。2.3發酵發酵采用的方式是分批培養發酵，在一切做好準備后，進行無菌操作，把菌體放入發酵罐中進行發酵。整個過程都是需要時刻進行調節的，主要的調節項目為溫度、pH值，因為菌體在生長的各個階段，溫度和pH都有所變化，而想要生產出產品，就要控制好這兩個參數。溫度控制主要通過加冷卻水來進行，但要注意適量，不能太過。pH值的控制主要通過加氨水來調節，因為隨著菌體生長和產物產生，環境pH值會不斷下降呈酸性，所以要不斷加氨水來控制。第三章 結論枯草芽孢桿菌在培養過程中，由于培養條件掌握不好，常出現活

15、菌數量低，芽孢形成率低等問題。本研究通過一系列單因素實驗,確定了枯草芽孢桿菌的最佳發酵條件。通過對枯草芽孢桿菌進行篩選、擴大培養和發酵的控制，很好的了解了生物產品生產的中游部分的各個步驟，初步學習了這幾部分的主要注意事項，尤其對發酵有了一個初步的認識，學會了控制發酵的相關參數。通過測量PH值，也了解了菌體的生長趨勢。培養基優化方法多是在單因素水平試驗的基礎上進行正交實驗設計或是在正交試驗基礎上應用均勻設計理論，或者采用通用旋轉組合設計，均能對培養基優化取得較好的效果。在工業化生產中，還需要對接種量、pH、溫度、轉速、通風比、溶氧、以及消泡劑用量等一系列因素進行嚴格控制，才能保證枯草芽孢桿菌發酵活菌數達到最高、發酵效果最好、在動物飼料里的添加效果最理想。第四章 參考文獻1 吳玲, 何穎. 瑞士乳桿菌增菌培養基的篩選J. 常州工程職業技術學院學報, Vol. 4 2007 December No.54.2 西北農林科技大學學報（自然科學版）, Vol.38 No.7 Ju.1.2010.3 馮宇，高年發，張穎. 短乳桿菌生產-氨基丁酸培養基的優化J. 現代