1、ATP檢測技術基礎理論及在檢測技術基礎理論及在醫院感染控制中的應用醫院感染控制中的應用中國疾病預防控制中心 邱 俠2011.12.22. 目錄目錄lATP檢測技術的理論基礎lATP檢測技術在醫療機構中的應用研究lATP檢測技術在醫院感染控制中的應用l如何進行儀器及試劑的選擇ATP檢測技術的理論基礎（檢測技術的理論基礎（1）ATP主要存在于細胞內lATP（三磷酸腺苷）存在于動物細胞、微生物細胞、植物細胞中，同類活細胞內的含量基本一致；l動物細胞中ATP含量：1.000-100.000 amol ATP l細菌細胞中ATP含量：0.5-2 amol ATP；l在自然界中，絕大部分細菌的ATP含量在

2、2amol ATP，大多數體細胞ATP含量大約為1000amol ATP，因此以上述含量值分別作為細菌和體細胞的代表值；l細胞在自然凋亡的情況下，ATP含量會有變化。ATP檢測技術的理論基礎（檢測技術的理論基礎（2）活細胞活細胞酶融后的細胞酶融后的細胞C. 細胞自然凋亡或受到其它介質影響細胞自然凋亡或受到其它介質影響后后ATP的情況的情況ATP（三磷酸腺苷）ADP（二磷酸腺苷） AMP（一磷酸腺苷）ATP, ADP and AMP 在活的和死亡細胞內的情況ATP檢測技術的理論基礎（檢測技術的理論基礎（3）技術原理l沾染在物體表面、醫療器械上的血液、組織液等體液中含有大量的體細胞和細菌等污染物，

3、這些生物污染可以通過ATP生物熒光法測出。l螢光素酶在Mg2、ATP、O2的參與下進行酶促反應放出光子l儀器定量測定發光值RLU或使用ATP標準品測得含量，從而獲知污染物污染水平，來判斷物表、器械的污染程度和清洗效果污染程度和清洗效果。l通過使用體細胞通過使用體細胞ATPATP消除技術，可對殘留細菌進行檢測消除技術，可對殘留細菌進行檢測。l現有技術可以檢測到1 amolATPATP的應用的應用l潔凈度檢測（ATP總量檢測） 細胞外ATP體細胞ATP 微生物細胞ATP 可用于衛生監測、微生物生長控制等l細菌細胞計數利用體細胞裂解劑ATP水解酶去除細胞外和體細胞ATP 可用于細菌總數檢測、藥敏試驗

4、、疾病診斷（如菌尿檢測）等l體細胞計數 ATP水解酶去除細胞外ATP 可用于體細胞計數、藥敏試驗等ATP檢測技術在醫療機構應用研究檢測技術在醫療機構應用研究研究背景 2005年衛生部消毒標準委員會、中國疾病預防控制中心消毒檢測中心聯合北京創新世紀生化科技發展有限公司、瑞典BioThema公司和美國Hygiena國際公司在國內率先開展了ATP檢測技術的基礎理論、醫療器械清洗效果、醫用清洗劑質量評價、臨床應用等方面的研究。 本研究成果在醫用清洗劑衛生標準、醫院消毒衛生標準國標制定中用于評價醫用清洗劑質量和醫療器械潔凈度篩查，并發表了多篇論文、論著。 國外技術支持國外技術支持lBioThema公司：

5、l其創始人Dr. Lundin從事ATP研究近40年，擔任生物發光和化學發光國際協會理事和生物發光和化學發光科學雜志的歐洲編委，并發表了60多篇ATP方面的各類論文及專著，在該領域享有極高的聲望；l其公司的ATP標準品通過了瑞典標準機構的認證作為標準物質；l目前正在協助中國CDC制定基于ATP含量檢測的國家標準；lHygiena公司：l是世界最大的ATP檢測專業公司之一；l公司通過美國FDA認證；l其英國分公司配合英國衛生部開展了大量醫療應用的研究。研究報告研究報告研究報告分為三部分：研究報告分為三部分：1 1）ATPATP生物熒光法評價醫療器械清洗效果的研究；生物熒光法評價醫療器械清洗效果的

6、研究；2 2）目測、放大鏡下觀察、潛血試驗和）目測、放大鏡下觀察、潛血試驗和ATPATP生物熒光法對清洗生物熒光法對清洗后的醫療器械清洗效果評價結果的比較；后的醫療器械清洗效果評價結果的比較；3 3）臨床研究及驗證）臨床研究及驗證第一部分第一部分ATPATP生物熒光法評價醫療器械清洗效果的研究生物熒光法評價醫療器械清洗效果的研究試驗一試驗一 ATP生物熒光法與細菌計數法的相關性研究生物熒光法與細菌計數法的相關性研究取37培養1824hATCC6538，以TSB洗菌，制成菌懸液，梯度稀釋圖1試驗一方法流程圖1. 金黃色葡萄球菌（ATCC6538）測定結果：菌落計數菌落計數相對光單位相對光單位CF

7、ULog (CFU)RLULog （RLU）2.791088.4545829016.662.781077.4423217006.372.761066.446999315.852.811055.45810964.912.751044.4481603.912.821033.459852.992.821022.451762.252.75101.441202.08圖2金黃色葡萄球菌菌落數對數值與RLU對數值的線性關系表中cfu和RLU值均為5次試驗結果平均值。大腸桿菌（大腸桿菌（8099） 2. 大腸桿菌（8099）測定結果：菌落計數菌落計數相對光單位相對光單位CFULog (CFU)RLULog （

8、RLU）7.021088.8546634856.676.991077.8421136426.336.871066.846663695.826.901055.841049565.027.011044.8594023.976.921033.8412423.096.891022.841382.146.99101.84291.46取37培養1824h8099，以TSB洗菌，制成菌懸液梯度稀釋圖3 試驗一方法流程圖圖4大腸桿菌菌落數對數值與RLU對數值的線性關系表中cfu和RLU值均為5次試驗結果平均值。試驗二 ATP生物熒光法測定血液殘留量1. 對不同稀釋度血液的RLU觀察：血液稀釋度血液稀釋度相對光

9、單位相對光單位稀釋度Log (倍數)RLULog （RLU）1.010-2- 252977566.721.010-3- 328780836.461.010-4- 46065645.781.010-5- 5738074.875.010-6- 5.3351734.552.510-6- 5.6194844.291.010-6- 682073.911.010-7- 711813.071.010-8- 82872.461.010-9- 91792.25圖6 血液稀釋倍數對數值與RLU對數值的線性關系圖5 試驗二方法流程圖試驗三試驗三 ATP生物熒光法測定超聲波清洗器清洗前后血液殘留量生物熒光法測定超聲波

10、清洗器清洗前后血液殘留量A. 清洗液清洗5min+水洗1minB. 水洗6minC. 清洗液清洗2min+水洗1minD. 水洗3min取50 L血液滴染于齒部 不同血液濃度、不同清洗條件，ATP生物熒光法測定結果：血液血液濃度濃度清洗液清洗清洗液清洗5min+水洗水洗1min水洗水洗6min清洗液清洗液清洗清洗2min+水水洗洗1min水洗水洗3min清洗前清洗前對照對照血液14385163201178731196234588464710-195687111956136528158968358974210-247164626686731095614284647910-313194424812

11、87417755598947910-4212724982700266214466010-510221339117113611185410-63844406307152287圖7 試驗三方法流程圖陰性對照為16、18、19和15。試驗四試驗四 細菌計數、細菌計數、ATP生物熒光法測定超聲波清洗生物熒光法測定超聲波清洗器清洗前后細菌殘留器清洗前后細菌殘留取10 L金葡菌液滴染齒部置5mLTPS管中A. 清洗液清洗2min+水洗1minB. 水洗3minC. 清洗液清洗5min+水洗1minD. 水洗6min 1. 在超聲波清洗器中，水洗與清洗液清洗后，細菌計數法和ATP生物熒光法測定結果：組別組別

12、ATPATP生物熒光生物熒光法（法（RLU）細菌計數法細菌計數法（CFU）清洗液清洗2min+水洗1min162207清洗液清洗5min+水洗1min131152水洗3min349325水洗6min136157陽性對照291091105圖8 試驗四方法流程圖陰性對照：細菌計數為0 cfu，ATP生物熒光法測定RLU為14。. 2. 根據金黃色葡萄球菌菌落數對數值與RLU對數值的線性關系y=1.3199x 0.8317，計算出不同清洗條件下殘留菌數的RLU理論值。理論值與實際值相比見下表：組別組別RLURLU理論值（理論值（Log10Log10）RLURLU實測值（實測值（LogLog）清洗液清

13、洗2min+水洗1min2.382.32清洗液清洗5min+水洗1min2.282.18水洗3min2.532.51水洗6min2.292.20陽性對照4.414.46第一部分第一部分 小小 結結l1.1.金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分屬革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分屬革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，在室溫下分別對兩種細菌不同稀釋度菌液的在室溫下分別對兩種細菌不同稀釋度菌液的RLURLU進行測定，結果顯進行測定，結果顯示，在示，在10102 210108 8cfucfu范圍內，菌落數對數值與范圍內，菌落數對數值與RLURLU對數值之間呈線對數值之間呈線性關系（性關系（R R2

14、20.990.99，P P0.010.01），說明兩種細菌均可以通過測定），說明兩種細菌均可以通過測定RLURLU確定細菌數量。確定細菌數量。l2.2.對室溫下不同稀釋度的血液進行了測定，分析結果顯示，血液對室溫下不同稀釋度的血液進行了測定，分析結果顯示，血液稀釋到稀釋到1010-2-21010-9-9時，隨著血液稀釋度的增加，時，隨著血液稀釋度的增加，RLURLU逐漸降低，對采逐漸降低，對采自同一個人的血液，血液稀釋倍數的對數值與自同一個人的血液，血液稀釋倍數的對數值與RLURLU對數值之間成線對數值之間成線性關系（性關系（R R2 2=0.9803=0.9803），說明測定），說明測定RL

15、URLU可以確定血液含量，最低可可以確定血液含量，最低可以測到稀釋以測到稀釋1010-9-9的血液。的血液。 l3. BT-112D3. BT-112D檢測系統，測定超聲波清洗器清洗前、后血液殘留：檢測系統，測定超聲波清洗器清洗前、后血液殘留：l3.1 3.1 相同濃度污染物污染醫療器械，相同清洗時間，清洗液清洗組相同濃度污染物污染醫療器械，相同清洗時間，清洗液清洗組RLURLU顯著低于水洗組顯著低于水洗組RLURLU，二者之間有顯著性差異（，二者之間有顯著性差異（P P0.050.05），），這與清洗液松解有機物，使其從器械表面脫落有關。這與清洗液松解有機物，使其從器械表面脫落有關。l3.2

16、 3.2 相同濃度污染物污染醫療器械，清洗時間越長，相同濃度污染物污染醫療器械，清洗時間越長，RLURLU之越低。之越低。l4. 4. 細菌計數、細菌計數、BT-112DBT-112D檢測系統，測定超聲波清洗器清洗前、后檢測系統，測定超聲波清洗器清洗前、后細菌殘留：細菌殘留：l4.1 4.1 通過細菌計數和通過細菌計數和ATPATP生物熒光測定結果可以發現，在超聲波清生物熒光測定結果可以發現，在超聲波清洗器中清洗液清洗洗器中清洗液清洗2min+2min+水洗水洗1min1min和單純水洗和單純水洗3min3min相比，清洗液相比，清洗液有利于去除細菌，清洗液清洗組和水洗組之間的細菌數和有利于去

17、除細菌，清洗液清洗組和水洗組之間的細菌數和RLURLU皆有皆有顯著性差異。顯著性差異。l4.2 4.2 通過超聲波清洗器清洗前后，細菌計數結果與標定菌量和通過超聲波清洗器清洗前后，細菌計數結果與標定菌量和RLURLU通過擬合公式計算的理論值及實測值相吻合。通過擬合公式計算的理論值及實測值相吻合。l第二部分 目測、放大鏡下觀察、潛血試驗、BT-112D檢測系統測定直接清洗液清洗與預洗后清洗液清洗血液殘留試驗一試驗一 潛血試驗和潛血試驗和ATP生物熒光的靈敏度比較生物熒光的靈敏度比較1、潛血試驗和ATP生物熒光法測定血液殘留結果：取50 L血液滴染于齒部圖9 試驗一方法流程圖分子代表陽性樣本數，分

18、母代表檢測樣本數；陰性對照不變色。ATP生物熒光法測定陰性對照RLU為16、18、17、19和15。.試驗二試驗二 放大鏡、潛血試驗和放大鏡、潛血試驗和ATP生物熒光的靈敏度比較生物熒光的靈敏度比較取50 L血液滴染于齒部A.清洗液浸泡5minB.清洗液浸泡2min流動水沖洗刷洗1.5min流動水預洗30s圖10試驗二方法流程圖試驗結果試驗結果樣本號樣本號放大鏡下觀察放大鏡下觀察潛血試驗結果潛血試驗結果樣本號樣本號 放大鏡下放大鏡下潛血結果潛血結果1112123134145156167178189191020樣本號樣本號放大鏡下放大鏡下潛血結果潛血結果樣本號樣本號 放大鏡下放大鏡下潛血結果潛血

19、結果 11121231341451561671781891910201. 預洗組1.1 預洗后清洗液浸泡2min組，潛血試驗檢測結果：1.2 預洗后清洗液浸泡5min組，潛血試驗檢測結果：代表陰性，代表陽性，潛血試驗陽性對照為藍色，陰性對照不變色2. 直接清洗液浸泡組2.2 清洗液浸泡2min組、5min組，潛血試驗檢測結果：組組 別別樣本數（件）樣本數（件）放大鏡下觀察陽性數（件）放大鏡下觀察陽性數（件）潛血試驗陽性數潛血試驗陽性數清洗液浸泡2min20820清洗液浸泡5min20720代表陰性，代表陽性，潛血試驗陽性對照為藍色，陰性對照不變色3. ATP生物熒光法測定結果3.1 預洗后清洗

20、液浸泡2min組，放大鏡下觀察與ATP生物熒光測定結果：樣本號樣本號 放大鏡下放大鏡下 RLU樣本號樣本號 放大鏡下放大鏡下 RLU1580111584621162412657839587131196841114214426051268115178886174401612901710941171087381451018131639910819104161075712015799陽性對照RLU為4846479、5426617、5329203、5115037、4838111；陰性對照RLU為15、16、18、19、18.3.2 預洗后清洗液浸泡5min組，放大鏡下觀察與ATP生物熒光測定結果：樣本

21、號樣本號放大鏡下放大鏡下 RLU樣本號樣本號放大鏡下放大鏡下 RLU11084111947242771217023186213249344596144329587715359364368161740741521742148328718487494851192609101743201741陽性對照RLU為4846479、5426617、5329203、5115037、4838111；陰性對照RLU為15、16、18、19、18.第二部分第二部分 小小 結結l1. 1. 污染有污染有1010-6-6血液稀釋液的醫療器械，潛血試驗結果皆為陰性，測血液稀釋液的醫療器械，潛血試驗結果皆為陰性，測不出血液

22、殘留，而不出血液殘留，而ATPATP生物熒光法仍可定量測出，說明生物熒光法仍可定量測出，說明BT-112DBT-112D檢檢測系統，檢測血液殘留時比潛血試驗更為靈敏。測系統，檢測血液殘留時比潛血試驗更為靈敏。l2. 2. 預洗后清洗液浸泡組、直接清洗液浸泡組，共清洗樣本預洗后清洗液浸泡組、直接清洗液浸泡組，共清洗樣本120120件。件。肉眼觀察全為陰性，但放大鏡下觀察，陽性數為肉眼觀察全為陰性，但放大鏡下觀察，陽性數為3535件，這可能因件，這可能因為止血鉗齒部凹凸不平，且難以觀察到粒徑為止血鉗齒部凹凸不平，且難以觀察到粒徑5050 mm污物有關。污物有關。l3. 3. 本試驗中，對肉眼觀察皆

23、為陰性的本試驗中，對肉眼觀察皆為陰性的8080件樣本進行潛血試驗，結件樣本進行潛血試驗，結果顯示，潛血試驗陽性的樣本為果顯示，潛血試驗陽性的樣本為6666件，陽性率為件，陽性率為82.5%82.5%。說明，。說明，檢測血液殘留時，潛血試驗優于目測法。檢測血液殘留時，潛血試驗優于目測法。l4. 在預洗后清洗液浸泡在預洗后清洗液浸泡5min組的組的40件樣本中，隨機抽取件樣本中，隨機抽取20件進行件進行潛血試驗，陰性樣本數為潛血試驗，陰性樣本數為14件；另外件；另外20件樣本進行件樣本進行BT-112D檢測檢測系統，測得系統，測得RLU值為值為8774874。說明，潛血試驗測定為陰性的樣。說明，潛

24、血試驗測定為陰性的樣本，本，ATP生物熒光法仍可能測出血液殘留。生物熒光法仍可能測出血液殘留。l5. 試驗中發現，放大鏡下觀察為陽性，其潛血試驗不一定為陽性試驗中發現，放大鏡下觀察為陽性，其潛血試驗不一定為陽性；某些放大鏡為陽性的樣本，其；某些放大鏡為陽性的樣本，其RLU值卻未必高。這可能因為清值卻未必高。這可能因為清洗后的器械，仍有非有機物殘留，如銹跡，因此在器械清洗后，洗后的器械，仍有非有機物殘留，如銹跡，因此在器械清洗后，除銹亦非常重要。除銹亦非常重要。l6. 綜上，測定血液殘留靈敏性排序為：綜上，測定血液殘留靈敏性排序為：ATP生物熒光法潛血試生物熒光法潛血試驗驗 放大鏡下觀察放大鏡下

25、觀察 目測。目測。RLU2000作為評價器械清洗效果參考值的依據作為評價器械清洗效果參考值的依據l研究表明清洗劑中含有的表面活性劑可破壞體細胞，使胞內ATP下降并釋放出來；l在ISO /TS15883 - 5的B.6.8 中提到，每個測試塊(片)上細菌數 1.0 107 cfu,要求清洗后細菌的最小減少系數(RF)為4。即醫療器械清洗后,其細菌殘留 1.0 103 cfu，此時通過擬合公式（y=1.3199x 0.8317）計算對應的RLU為800-1000，潔凈度檢測采集到的樣本為總ATP（胞外ATP和細胞內ATP）應考慮到細菌細胞外的ATP殘留；l結合國外相關研究及在國內的基礎研究、臨床驗

26、證，給出BT-112D熒光儀的清洗效果評價參考值：lRLU（相對發光值）2000為低風險（合格）l為了遵循ISO持續改進的原則引入風險控制理論：lRLU（相對發光值）20004000為中度風險（警告），4000為高度風險（不合格）第三部分臨床研究及驗證腔鏡器械清洗效果評價腔鏡器械清洗效果評價研究對象：腹腔鏡（目鏡、操作鉗、柄鉗管腔、穿刺器）取樣：隨機抽樣30套（拆卸成4個/套，共120個部件）腔鏡清洗方法：按衛生部內鏡清洗消毒技術操作規范（2004年版）要求采樣時間：清洗前、初洗后、酶浸泡刷洗后、超聲清洗后、風吹干或干燥箱后采樣方法：采樣面積按國標醫院消毒衛生標準GB 15982-1995要求

27、； 佩戴無粉、無菌手套及一次性口罩、帽子； 從Ultrasnap試管 中取出拭子，持器械手柄端，在器械表面往 返均勻涂擦各5次。評價方法：RLU（相對發光值）2000低風險，20004000中度風險，4000高度風險分析：1、 600例檢測中，通過初洗、酶洗、超聲洗、風吹干燥或干燥爐干燥后ATP含量100%呈下降趨勢；2、整體合格率74%；3、目鏡：由于不能超聲清洗，30例平均值5502；4、柄鉗管腔：超聲清洗后RLU值升高，經核實由超聲清洗機二次污染造成；5、通過環節控制可找到清洗中薄弱環節；6、通過環節控制可以提高清洗合格率，符合ISO持續改進的要求。柄鉗管腔1號2號10號11號12號清洗

28、前7223758792810426660213668184416176初洗后11264622474203052688931309酶擦沖水后20911693219713243390超聲沖水后435514202301718574446機械清洗器械效果評價機械清洗器械效果評價 我公司歷時2年在全國范圍內，對近150家醫院的消毒供應中心提供復用醫療器械潔凈度檢測服務，積累了近5000例檢測數據。采樣時間：清洗干燥后進行采樣；采樣方法：佩戴無粉、無菌手套及一次性口罩、帽子。非管腔類：從Ultrasanp試管中取出拭子，持器械手柄端，在器械表面橫豎往返均勻涂擦各5次，并隨之轉動拭子，器械齒部和關節部等難清

29、洗的部位可著重涂抹。手拿部位不涂抹，將采樣后的拭子放回試管；管腔類：在器械表面橫豎往返均勻涂擦各5次，并將拭子探入管腔內，往返旋轉涂抹5次，拭子從管腔兩端各探入9cm，管腔長度小于18cm的采集管腔全部，大于18cm的只采18cm。手拿部位不涂抹，將采樣后的拭子放回試管。（拭子無法探 入管腔類器械可檢測100l洗脫水并用100l沖洗用水作陰性對照）。檢測： 掰斷拭子上端的速流閥，擠下試劑并振蕩15次，放入儀器檢測。結果判定：RLU（相對發光值）2000合格，20004000中度風險，4000高度風險檢測中發現的問題檢測中發現的問題1、每次采樣以止血鉗、宮吸管、彎盤、骨穿針（針柄）、沖洗水 為主

30、，總體合格率為78 %；2、器械放入清洗機，碼放密度不同會影響清洗質量；3、器械放入清洗機，碼放方式不同會影響清洗質量；4、宮吸管等管腔器械預洗方式不同，會影響清洗質量；5、骨穿針（針柄）問題較多；6、RLU（相對發光值）2000合格，20004000中度風險，4000高度風險的控制指標的提出，使清洗質量有了量化標準和改進的目標，符合ISO持續改進的要求。國外研究及應用案例國外研究及應用案例采用采用ATP檢測技術院內感染控制流程檢測技術院內感染控制流程有效降低院內感染風險有效降低院內感染風險血液透析和相關治療用水復用醫療器械手衛生統計分析BT-112DPlusBT-112D物體表面內窺鏡和手術器械內窺鏡和手術器械l“我們得到結論ATP生物熒光法不會完全取代傳統生物培養法，但是可以成為復用內窺鏡清洗效果的另一新方法。ATP生物熒光法作為傳統生物培養法一種快