1、補(bǔ)課安排補(bǔ)課安排第第7周周周周7第第11節(jié)節(jié)N1-104第第8周周周周3第第7節(jié)節(jié)N1-121 第第 六六 章章 基因操作中大分子的分離和分析基因操作中大分子的分離和分析第一節(jié)第一節(jié) DNADNA的分離、檢測(cè)和純化的分離、檢測(cè)和純化第二節(jié)第二節(jié) RNARNA的分離、檢測(cè)和純化的分離、檢測(cè)和純化第三節(jié)第三節(jié) 分子雜交分子雜交第四節(jié)第四節(jié) RNARNA作圖和端點(diǎn)分析作圖和端點(diǎn)分析第五節(jié)第五節(jié) 重組重組DNADNA分子導(dǎo)入大腸桿菌分子導(dǎo)入大腸桿菌第一節(jié)第一節(jié) DNA的分離、檢測(cè)和純化的分離、檢測(cè)和純化一、大腸桿菌質(zhì)粒一、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離和純化的分離和純化二、二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖

2、凝膠電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳四、脈沖場(chǎng)凝膠電泳四、脈沖場(chǎng)凝膠電泳五、五、DNA片段的純化片段的純化一、大腸桿菌質(zhì)粒一、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離和純化的分離和純化依據(jù)是利用分子依據(jù)是利用分子大小大小不同和質(zhì)粒不同和質(zhì)粒DNA的的超螺旋超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行分離。的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行分離。目前最常用的是目前最常用的是堿裂解法堿裂解法。1 堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA原理原理 堿裂解法堿裂解法是基于染色體是基于染色體DNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)變性與復(fù)性的差異性的差異而達(dá)到分離目的。而達(dá)到分離目的。在在pH高達(dá)高達(dá)12.5的堿

3、性條件下，染色體的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的大部的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈鏈不會(huì)完全分離不會(huì)完全分離。當(dāng)以當(dāng)以pH4.6的的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至至中性中性時(shí)，時(shí)，變性的質(zhì)粒變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液溶液中中，而染色體，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。構(gòu)。通過(guò)離心，染色體通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)

4、-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。堿抽提法所用試劑的生化作用堿抽提法所用試劑的生化作用 提取過(guò)程提取過(guò)程中所用的材料有中所用的材料有LBLB培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基、葡萄糖/Tris/EDTA/Tris/EDTA溶液溶液(5Ommol/L(5Ommol/L葡萄糖；葡萄糖；25mmol/L 25mmol/L TrisHClTrisHCl；pH8.0pH8.0，lOmmol/L EDTA)lOmmol/L EDTA)、TETE緩沖緩沖液、液、3mol/L3mol/L乙酸鉀溶液、乙酸鉀溶液、NaOH-SDSNaOH-SDS溶液、溶溶液、溶菌酶液、異丙醇、菌酶液、異丙醇、

5、100%100%乙醇和乙醇和70%70%乙醇等。乙醇等。 溶菌酶溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。糖苷鍵，因而具有溶菌作用。 葡萄糖葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透維持滲透壓壓，防止，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。受機(jī)械剪切力作用而降解。 EDTA:EDTA螯合螯合Mg2+和和Ca2+等金屬離子，等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用的降解作用,同時(shí)有利于溶菌酶的作用。同時(shí)有利于溶菌酶的作用。 NaOH-SDSNa

6、OH-SDS液液: :NaOHNaOH濃度為濃度為0.2 mol/L0.2 mol/L，加，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pHpH就高達(dá)就高達(dá)12.612.6，因，因而促使染色體而促使染色體DNADNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNADNA的變性。的變性。SDSSDS是是離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而破破壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-S0R-O-S03 3- -RR+ +- -蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的復(fù)合物的復(fù)合物, ,使蛋白質(zhì)變性沉淀

7、下來(lái)。使蛋白質(zhì)變性沉淀下來(lái)。KAc:KAc: pH4.8pH4.8的的KAcKAc溶液是為了把溶液是為了把pHl2.6pHl2.6的的抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒DNADNA能能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。高鹽高鹽3mol/L KAc3mol/L KAc有利于變性的大分子染色有利于變性的大分子染色體體DNADNA、RNARNA以及以及SDS-SDS-蛋白復(fù)合物的凝聚蛋白復(fù)合物的凝聚而沉淀。染色體而沉淀。染色體DNADNA因?yàn)橹泻土撕怂嵘系囊驗(yàn)橹泻土撕怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與電荷，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNARNA、SDS-S

8、DS-蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。形式復(fù)合物，使沉淀更完全。 無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇: :沉淀沉淀DNADNA，它的優(yōu)點(diǎn)是可以任，它的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會(huì)意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNADNA很安全。很安全。DNADNA溶溶液是液是DNADNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNADNA周圍的水分子，使周圍的水分子，使DNADNA失水而易于聚合。失水而易于聚合。 酚酚- -氯仿氯仿: :酚與氯仿是非極性分子，水是酚與氯仿是非極

9、性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的水相下面，從而與溶解在水相中的DNADNA分分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。留在最下層。異戊醇異戊醇: :異戊醇能異戊醇能降低分子表面張力降低分子表面張力，能，能減少抽

10、提過(guò)程中泡沫的產(chǎn)生。同時(shí)異戊減少抽提過(guò)程中泡沫的產(chǎn)生。同時(shí)異戊醇醇有助于分相有助于分相，使離心后的上層水相、，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。持穩(wěn)定。 152 通過(guò)試劑盒分離純化大腸桿菌質(zhì)粒DNA 二、二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳1、凝膠電泳的基本原理、凝膠電泳的基本原理一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說(shuō)，子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說(shuō)，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳

11、分子所攜帶的凈電荷數(shù)電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳遷移率。遷移率。2、影響電泳遷移速率的因素：、影響電泳遷移速率的因素：1 ） 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)DNA分子在高于等電點(diǎn)的分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度

12、向正極方向移動(dòng)。在一定的因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。分子本身的大小和構(gòu)型。 2）相對(duì)分子質(zhì)量）相對(duì)分子質(zhì)量具有具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量不同的相對(duì)分子質(zhì)量的的DNA片段泳動(dòng)速度不一片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。比關(guān)系。當(dāng)提取到的質(zhì)粒當(dāng)提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體樣品中還有染色體DNA或或RNA時(shí)，在凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由時(shí)，

13、在凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可分析樣品的純度。此可分析樣品的純度。 3）構(gòu)型）構(gòu)型質(zhì)粒質(zhì)粒DNA超螺旋超螺旋(SC)、開環(huán)狀、開環(huán)狀(OC)、線狀、線狀(L) 3種構(gòu)型種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開環(huán)狀分子。環(huán)狀分子。3、DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳1）DNA的顯示原理：的顯示原理： 制備瓊脂糖凝膠時(shí)加入制備瓊脂糖凝膠時(shí)加入溴化乙錠溴化乙錠指示劑，溴化乙指示劑，溴化乙錠錠(EB)在紫外光照射下能發(fā)射在紫外光照射下能發(fā)射桔

14、紅色的熒光桔紅色的熒光。熒光的強(qiáng)度熒光的強(qiáng)度正比于正比于DNA的含量。若用的含量。若用薄層分析掃描儀薄層分析掃描儀檢測(cè)，只需要檢測(cè)，只需要5lO ng DNA，就可以從照片上比較，就可以從照片上比較鑒別。如用鑒別。如用肉眼肉眼觀察，可檢測(cè)到觀察，可檢測(cè)到0.010.1g的的DNA。EB染色原理染色原理當(dāng)當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的的EB就插入就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍。射的熒光增強(qiáng)幾十倍。分離不同大小分離不同大小DNADNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度片段的合適瓊脂糖凝膠濃度2）

15、瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程）瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程A、緩沖液制備緩沖液制備B、EB母液配制：母液配制：10mg/ml，在，在4下保存下保存C、將點(diǎn)樣梳洗凈干燥放入膠板中將點(diǎn)樣梳洗凈干燥放入膠板中D、瓊脂糖膠板的制備：瓊脂糖膠板的制備： 稱量加入三角瓶一定的瓊脂糖粉末，按所需凝稱量加入三角瓶一定的瓊脂糖粉末，按所需凝膠濃度加入適量體積的緩沖液，將三角瓶塞口，微膠濃度加入適量體積的緩沖液，將三角瓶塞口，微波爐中波爐中融化融化。 融化好后冷卻到融化好后冷卻到60左右，加入左右，加入EB溶液，至最溶液，至最終濃度為終濃度為0.5ug/ml。搖勻倒入放置好點(diǎn)樣梳的膠板。搖勻倒入放置好點(diǎn)樣梳的膠板中，排走

16、氣泡。室溫放置中，排走氣泡。室溫放置30-45min。2）瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程）瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程E、加樣和電泳：加樣和電泳： 將膠板放入電泳槽，注入緩沖液，使液面高于將膠板放入電泳槽，注入緩沖液，使液面高于膠面膠面1-2mm，排出加樣孔內(nèi)的氣泡，用微量移液槍，排出加樣孔內(nèi)的氣泡，用微量移液槍加入加入DNA樣品。接通電源，調(diào)好電壓和電泳時(shí)間。樣品。接通電源，調(diào)好電壓和電泳時(shí)間?？筛鶕?jù)可根據(jù)溴酚蘭的位置溴酚蘭的位置結(jié)束電泳，關(guān)閉電源。結(jié)束電泳，關(guān)閉電源。F、取出凝膠，置于紫外投射儀上，調(diào)好相機(jī)焦距拍取出凝膠，置于紫外投射儀上，調(diào)好相機(jī)焦距拍照照2）瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程）瓊脂糖凝膠電

17、泳的操作過(guò)程2）瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程）瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程常用的常用的Marker三、聚丙烯酰胺凝膠電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)：特點(diǎn)：分辨率高分辨率高適于寡聚核苷酸及適于寡聚核苷酸及DNA序列分析，序列分析，DNA500bp載樣量大載樣量大回收回收DNA純度高純度高PAGE裝置電 泳PAGE應(yīng)用范圍分離、純化和鑒定分離、純化和鑒定RNA和小分子和小分子DNA DNA序列分析序列分析 PCR產(chǎn)物鑒定產(chǎn)物鑒定 蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分析蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分析 四 、四 、 脈 沖 場(chǎng) 凝 膠 電 泳脈 沖 場(chǎng) 凝 膠 電 泳 ( p u l s e d - f i e l d g e l elec

18、trophoresis PFGE)采用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交變電源采用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交變電源，每次電流方向改，每次電流方向改變后持續(xù)變后持續(xù)1秒到秒到5分鐘左右，然后再改變電流方向，分鐘左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場(chǎng)。反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場(chǎng)。專門針對(duì)專門針對(duì)大片段大片段DNA的分析檢測(cè)方法。的分析檢測(cè)方法。+- - -2五、五、DNA片段的純化片段的純化DNA經(jīng)過(guò)酶切并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析在凝膠上會(huì)經(jīng)過(guò)酶切并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析在凝膠上會(huì)呈現(xiàn)呈現(xiàn)DNA條帶條帶，從中分離特定大小的，從中分離特定大小的DNA片段可用片段可用于進(jìn)一步深入的研究。于進(jìn)一

19、步深入的研究。常用的常用的DNA純化方法有：純化方法有：低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法、透析袋電洗脫法透析袋電洗脫法、氯化銫、氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心法、溴化乙錠連續(xù)梯度離心法、離子交換層析法、離子交換層析法、 “基因純基因純”試劑純化等。試劑純化等。低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法首先利用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳首先利用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳DNA片段，分離目的片段，分離目的條帶條帶DNA，然后，然后紫外光紫外光下切割含目的下切割含目的DNA條帶的膠條帶的膠塊，利用塊，利用膠回收試劑盒膠回收試劑盒回收純化回收純化DNA片段。片段。試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質(zhì)材料在一

20、定的高鹽緩試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質(zhì)材料在一定的高鹽緩沖系統(tǒng)下高效專一地吸附?jīng)_系統(tǒng)下高效專一地吸附DNA、RNA的原理，配備的原理，配備設(shè)計(jì)獨(dú)特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu)，使用常規(guī)臺(tái)式高速離設(shè)計(jì)獨(dú)特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu)，使用常規(guī)臺(tái)式高速離心機(jī)，在幾分鐘之內(nèi)即可以高效回收核酸片段。心機(jī)，在幾分鐘之內(nèi)即可以高效回收核酸片段。1）切膠，放入）切膠，放入1.5ml離心管中；離心管中；2） 加入溶膠液，置加入溶膠液，置55水浴水浴10分鐘，分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化；使瓊脂糖塊完全溶化；3）瓊脂糖液移入吸附柱，）瓊脂糖液移入吸附柱，12000 rpm 室溫離心室溫離心1分鐘，倒掉收集管中分鐘，倒掉收集管中的液體

21、；的液體；4）在吸附柱中加入漂洗液，室溫靜）在吸附柱中加入漂洗液，室溫靜置置1分鐘后，分鐘后， 12000rpm 室溫離心室溫離心30秒，倒掉收集管中的液體；秒，倒掉收集管中的液體；5）重復(fù)漂洗一次；）重復(fù)漂洗一次；6） 12000rpm 室溫空離心室溫空離心1分鐘；分鐘；7）將吸附柱放入一個(gè)）將吸附柱放入一個(gè)干凈的干凈的1.5ml的的離心管離心管中，在吸附膜中央加入中，在吸附膜中央加入30ul洗洗脫緩沖液，室溫靜置脫緩沖液，室溫靜置2分鐘后，分鐘后， 12000rpm 室溫離心室溫離心1分鐘；分鐘；8）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物；）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物；凝膠純化結(jié)果示意圖透析袋電洗脫法

22、透析袋電洗脫法 適用于適用于小劑量小劑量DNA純化和酶切純化和酶切DNA片段回收。片段回收。步驟：步驟：電泳分帶。電泳分帶。切膠，裝入透析袋，進(jìn)行電泳切膠，裝入透析袋，進(jìn)行電泳1-2h后，再反向電泳后，再反向電泳1-2min。洗脫液離心。洗脫液離心。轉(zhuǎn)移，加入轉(zhuǎn)移，加入2倍體積無(wú)水乙醇混勻，于倍體積無(wú)水乙醇混勻，于-20放置過(guò)夜放置過(guò)夜沉淀后，離心后去除上清液，最后把沉淀物溶于沉淀后，離心后去除上清液，最后把沉淀物溶于TE緩沖液中，緩沖液中，-20保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩?通過(guò)凝膠電泳回收的通過(guò)凝膠電泳回收的DNA樣品，因檢測(cè)需要樣品，因檢測(cè)需要而含有而含有溴化乙錠溴化乙錠(EB)，會(huì)，會(huì)影響限制

23、性核酸內(nèi)切影響限制性核酸內(nèi)切酶的切割酶的切割，因此有必要去掉插入到，因此有必要去掉插入到DNA中的中的EB，常采用的方法有：，常采用的方法有：正丁醇正丁醇(或異戊醇或異戊醇)抽提抽提或或Dowex(道埃克斯道埃克斯)樹脂層析法等。樹脂層析法等。DNA的濃縮的濃縮 當(dāng)提取的當(dāng)提取的DNA溶液的濃度達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，溶液的濃度達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，必須進(jìn)行必須進(jìn)行DNA溶液的濃縮。實(shí)驗(yàn)室常用的方法溶液的濃縮。實(shí)驗(yàn)室常用的方法有：有： 乙醇沉淀法、乙醇沉淀法、 正丁醇抽提法和聚乙二醇正丁醇抽提法和聚乙二醇濃縮法等。濃縮法等。 乙醇沉淀乙醇沉淀 DNA不溶于乙醇，因此可用乙醇來(lái)沉淀不溶于乙醇，因此可用乙醇

24、來(lái)沉淀DNA以達(dá)到純化以達(dá)到純化DNA的目的。乙醇沉淀是濃縮的目的。乙醇沉淀是濃縮DNA的的常用方法。常用方法。1、按、按DNA溶液量的溶液量的1/10體積加入體積加入3mmol/L NaAc。2、加、加2.5倍體積的預(yù)冷倍體積的預(yù)冷100%乙醇，蓋上蓋子混勻。乙醇，蓋上蓋子混勻。3、-70靜置靜置15min，或，或-20 靜置靜置1h以上。以上。4、4 、15000r/min，離心，離心15min，沉淀，沉淀DNA。5、棄上清。、棄上清。6、加、加70%乙醇適量，漂洗沉淀，再次離心。乙醇適量，漂洗沉淀，再次離心。7、干燥、干燥1030min。8、加、加TE溶解。溶解。鹽能中和核酸上的電荷，因

25、此鹽能中和核酸上的電荷，因此易使易使DNA沉淀，但加入過(guò)多易沉淀，但加入過(guò)多易產(chǎn)生鹽析。產(chǎn)生鹽析。（四）（四）DNA的定量和純度測(cè)定的定量和純度測(cè)定 DNA樣品的濃度的測(cè)定，一般采用樣品的濃度的測(cè)定，一般采用紫外光譜分析、紫外光譜分析、EB熒光分析熒光分析、水平式瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰、水平式瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法和脈沖電泳法等。胺凝膠電泳法和脈沖電泳法等。 紫外光譜分析法紫外光譜分析法 紫外光譜分析法的原理基于紫外光譜分析法的原理基于DNA(或或RNA)分子在分子在260nmm處有特異的紫外吸收峰且吸收強(qiáng)度與系處有特異的紫外吸收峰且吸收強(qiáng)度與系統(tǒng)中統(tǒng)中DNA或或RNA的濃

26、度成正比。的濃度成正比。分子形狀、雙分子形狀、雙鏈與單鏈鏈與單鏈之間的轉(zhuǎn)換也會(huì)導(dǎo)致吸收水平的改變，之間的轉(zhuǎn)換也會(huì)導(dǎo)致吸收水平的改變，但是這種偏差可以用特定的公式來(lái)校正。該法但是這種偏差可以用特定的公式來(lái)校正。該法的特點(diǎn)是的特點(diǎn)是準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，但所需儀器較昂貴。準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，但所需儀器較昂貴。衡量所提取衡量所提取DNA的純度可用的純度可用OD260與與OD280的比值表示，的比值表示，OD260/OD280對(duì)對(duì)DNA而言其值大約為而言其值大約為1.8。當(dāng)當(dāng)OD260/OD280大大于于1.8則可能有則可能有RNA污染污染。當(dāng)當(dāng)OD260/ OD280小于小于1.8時(shí)則有時(shí)則有蛋白質(zhì)污染蛋白質(zhì)污染。雙

27、鏈雙鏈DNA的的OD260為為 1時(shí)相當(dāng)于濃度為時(shí)相當(dāng)于濃度為50g/mL。單鏈單鏈DNA的的OD260為為 1時(shí)相當(dāng)于濃度為時(shí)相當(dāng)于濃度為40g/mL。寡核酸的寡核酸的OD260為為 1時(shí)相當(dāng)于濃度為時(shí)相當(dāng)于濃度為20-40g/mL。EB熒光分析法熒光分析法 由于結(jié)合于由于結(jié)合于DNA分子之上的分子之上的EB的量與的量與DNA分子分子長(zhǎng)長(zhǎng)度和數(shù)量度和數(shù)量成正比，則熒光強(qiáng)度可以表示成正比，則熒光強(qiáng)度可以表示DNA量量的多少。的多少。EB是嫌疑性的致突變物質(zhì)。是嫌疑性的致突變物質(zhì)。第二節(jié)第二節(jié) RNA的分離、檢測(cè)和純化的分離、檢測(cè)和純化細(xì)胞中的核酸：細(xì)胞中的核酸：DNA和和RNA。RNA：rRN

28、A、 tRNA、 mRNA 。 80%85% rRNA(28S、18S、5S rRNA)。 15%20%低分子量低分子量RNA(如如tRNA、核內(nèi)小、核內(nèi)小分子分子RNA等）。等）。 1%5% mRNA，一般按，一般按2%計(jì)算。計(jì)算。Trizol法提取細(xì)胞總法提取細(xì)胞總RNA RNA實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是RNA酶的污染酶的污染。由于由于RNA酶酶廣泛存在而穩(wěn)定廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，只要存在少量的滅活，如煮沸、高壓滅菌等，只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起酶就會(huì)引起RNA的降解，而所制備的的降解，而所制備的RNA的的純度

29、和純度和完整性完整性又可直接影響又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以建立一分析的結(jié)果，所以建立一個(gè)無(wú)個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境對(duì)于制備酶的環(huán)境對(duì)于制備RNA很重要。很重要。常用的常用的RNA酶抑制劑：酶抑制劑：焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC）：與）：與RNA酶的活性基團(tuán)組酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合，有高致癌性。（實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合，有高致癌性。（實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段使用）使用）異硫氰酸胍、氯仿：提取異硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同時(shí)也使同時(shí)也使RNA酶失活。酶失活。1. RNA酶的蛋白抑制劑（酶的蛋白抑制劑（RNasin）：酸性糖蛋白。）：酸性糖蛋白。（合成（合成cDNA階段使用）階段使用）

30、1.在實(shí)驗(yàn)室最好有專門的在實(shí)驗(yàn)室最好有專門的RNA操作區(qū)，離心機(jī)、操作區(qū)，離心機(jī)、移液器、試劑等專用。移液器、試劑等專用。RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔操作區(qū)應(yīng)保持清潔，并定期進(jìn)行除菌。，并定期進(jìn)行除菌。 2.相關(guān)耗材相關(guān)耗材(Ep管、管、Tip頭頭)應(yīng)先用應(yīng)先用0.1% DEPC水浸水浸泡過(guò)夜并高壓消毒。也可直接使用廠家供應(yīng)的泡過(guò)夜并高壓消毒。也可直接使用廠家供應(yīng)的無(wú)無(wú)RNase的的Ep管、管、Tip頭。頭。 3.金屬器械和玻璃器皿應(yīng)在使用前于金屬器械和玻璃器皿應(yīng)在使用前于180的高溫的高溫下干烤下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間?；蚋L(zhǎng)時(shí)間。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)4.塑料器皿可用塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡

31、或用氯仿沖洗水浸泡或用氯仿沖洗5.配制的溶液應(yīng)盡可能加入配制的溶液應(yīng)盡可能加入DEPC至終濃度至終濃度0.1%處處理理12hr以上，然后用高壓滅菌除去殘留的以上，然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。（不能用。（不能用DEPC或高壓滅菌的試劑，如或高壓滅菌的試劑，如Tris、DTT等，應(yīng)當(dāng)用等，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)，然后經(jīng)0.22m濾膜過(guò)濾除菌）濾膜過(guò)濾除菌）6.人的唾液和汗液含有人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中應(yīng)戴手酶，故在操作中應(yīng)戴手套，避免講話。套，避免講話。Trizol是一種是一種苯酚苯酚與與異硫氰酸胍異硫氰酸胍(GTC)的混合物的混合物

32、，異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使，異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離。與蛋白質(zhì)分離。酸性酸性苯酚苯酚促使促使RNA進(jìn)入水相，加入氯仿可抽提進(jìn)入水相，加入氯仿可抽提酸性的苯酚，離心后，酸性的苯酚，離心后，RNA保留在水相中，保留在水相中，DNA和和蛋白質(zhì)保留在有機(jī)相中。蛋白質(zhì)保留在有機(jī)相中。水相加入異丙醇沉淀水相加入異丙醇沉淀RNA，從而得到純化的總，從而得到純化的總RNA。nTrizol法提取原理法提取原理真核生物真核生物mRNA的純化的純化（1）寡聚）寡聚(dT)親和層析柱分離親和層析柱分離mRNA（2）磁性分離技術(shù)純化）磁性分離技術(shù)純化mRNA（1

33、）寡聚）寡聚(dT)親和層析柱分離親和層析柱分離mRNA利用利用mRNA 3末端含有末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)流經(jīng)寡聚（寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚（被洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚（dT）纖維柱后，即）纖維柱后，即可得到較高純度的可得到較高純度的mRNA磁性分離技術(shù)純化磁性分離技術(shù)純化mRNA先將連有生物素的先將連有生物素的oligo(dT)引物與引物

34、與mRNA3-端的端的polyA一起雜交；一起雜交；加入連有生物素結(jié)合蛋白的磁球，使雜交體與磁球加入連有生物素結(jié)合蛋白的磁球，使雜交體與磁球結(jié)合；結(jié)合；通過(guò)磁場(chǎng)作用，使連有雜交體的磁球與其他通過(guò)磁場(chǎng)作用，使連有雜交體的磁球與其他RNA分分離；離；通過(guò)洗脫將連在磁球上的通過(guò)洗脫將連在磁球上的mRNA洗脫下來(lái)而得到純洗脫下來(lái)而得到純化的化的mRNA。該方法簡(jiǎn)單、迅速、不易引起該方法簡(jiǎn)單、迅速、不易引起mRNA的降解。的降解。RNA的電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度可通過(guò)測(cè)的濃度和純度可通過(guò)測(cè)試其試其OD260來(lái)判斷，來(lái)判斷， OD260為為 1時(shí)相當(dāng)于濃度為時(shí)相當(dāng)于濃度為40g/mLg/mL。檢測(cè)：檢測(cè)

35、：瓊脂糖凝膠電泳法、聚瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法。丙烯酰胺凝膠電泳法。28S18S總RNA電泳條帶第三節(jié)第三節(jié) 分子雜交分子雜交 一一、SouthernSouthern雜交雜交二二、NorthernNorthern雜交雜交三三、菌落原位雜交菌落原位雜交四四、WesternWestern雜交雜交分子雜交分子雜交 (molecule hybridization)分子雜交分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用已知標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分析方法，用已知標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測(cè)混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測(cè)混合樣品中未知核酸分子或

36、蛋白質(zhì)分子，以及其相對(duì)分子量大小。質(zhì)分子，以及其相對(duì)分子量大小。根據(jù)其根據(jù)其檢測(cè)對(duì)象檢測(cè)對(duì)象的不同可分為的不同可分為 Southern 雜交、雜交、Northern 雜交和雜交和 Western 雜交雜交 ，及由此簡(jiǎn)及由此簡(jiǎn)化的化的斑點(diǎn)雜交、狹線雜交和菌落雜交。斑點(diǎn)雜交、狹線雜交和菌落雜交。 分子雜交可在分子雜交可在DNA與與DNA、RNA與與RNA或或RNA與與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行的二條單鏈之間進(jìn)行，也可能在蛋白質(zhì)，也可能在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行。與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行。 核酸分子雜交是指核酸分子核酸分子雜交是指核酸分子(DNA或或RNA)在在變變性性以后，在以后，在復(fù)性復(fù)性的過(guò)程中兩個(gè)的過(guò)程

37、中兩個(gè)不同來(lái)源的且同源的不同來(lái)源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過(guò)程。核酸分子形成雜合雙鏈的過(guò)程。通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的顯影后顯示出目的DNA或或RNA分子所處的位置。分子所處的位置。 一、一、SouthernSouthern雜交雜交 這種方法是這種方法是E.M.Southern1975E.M.Southern1975年建立年建立, ,是進(jìn)是進(jìn)行基因組行基因組DNADNA特定序列定位的通用方法。特定序列定位的通用方法。（一）（一）

38、SouthernSouthern雜交的操作步驟雜交的操作步驟1.1.預(yù)處理：預(yù)處理： （1 1）用限制性內(nèi)切酶將基因組）用限制性內(nèi)切酶將基因組DNADNA進(jìn)行進(jìn)行酶切酶切。 （2 2）將酶切后的）將酶切后的DNADNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳電泳。 （3 3）凝膠泡在）凝膠泡在強(qiáng)堿溶液強(qiáng)堿溶液中，雙鏈的中，雙鏈的DNADNA樣品樣品變性變性。 （4 4）用酸）用酸中和中和，使單鏈，使單鏈DNADNA維持其單鏈狀態(tài)維持其單鏈狀態(tài)2.2.原位轉(zhuǎn)移：原位轉(zhuǎn)移： 將凝膠上的將凝膠上的單鏈單鏈DNADNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。上。3.3.固定：固定： 在真空烤箱里，在真空烤箱里，8

39、080下烤下烤1-3h1-3h。將核酸樣品進(jìn)。將核酸樣品進(jìn)一步一步固定固定在濾膜上在濾膜上4.4.雜交：雜交：雜交之前須有一個(gè)雜交之前須有一個(gè)預(yù)雜交預(yù)雜交，封阻膜的背景，避免雜交，封阻膜的背景，避免雜交時(shí)背景吸附探針。時(shí)背景吸附探針。封閉試劑成分主要是大量的非同封閉試劑成分主要是大量的非同源性的核酸或蛋白質(zhì)等。源性的核酸或蛋白質(zhì)等。將濾膜移入含有放射性同位素標(biāo)記的將濾膜移入含有放射性同位素標(biāo)記的探針探針?lè)肿尤芤褐?，分子溶液中，濾膜上的單鏈濾膜上的單鏈DNADNA分子與探針?lè)肿油ㄟ^(guò)互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)分子與探針?lè)肿油ㄟ^(guò)互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行行雜交雜交，形成雜種分子。，形成雜種分子。 5.漂洗：漂洗： 將濾膜上沒(méi)有和

40、單鏈將濾膜上沒(méi)有和單鏈DNA樣品結(jié)合的游離的探針樣品結(jié)合的游離的探針?lè)肿悠聪聛?lái)。分子漂洗下來(lái)。6.放射自顯影：放射自顯影： 在在X光曝射下進(jìn)行放射自顯影形成自顯影圖片。光曝射下進(jìn)行放射自顯影形成自顯影圖片。7.比較鑒定：比較鑒定： 將放射自顯影圖片上的譜帶與凝膠上的譜帶進(jìn)行比將放射自顯影圖片上的譜帶與凝膠上的譜帶進(jìn)行比較。確定與探針?lè)肿咏Y(jié)合的較。確定與探針?lè)肿咏Y(jié)合的DNA分子是凝膠上分子是凝膠上DNA鏈的那個(gè)片段。鏈的那個(gè)片段。1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過(guò)毛細(xì)管滲析法轉(zhuǎn)移膠中的通過(guò)毛細(xì)管滲析法轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固定膠中的固定膠中的DNA4.預(yù)雜

41、交和雜交預(yù)雜交和雜交(放射性和熒光檢測(cè)放射性和熒光檢測(cè))5.結(jié)果檢測(cè)，比較鑒定。結(jié)果檢測(cè)，比較鑒定。（一）（一）SouthernSouthern雜交的操作步驟雜交的操作步驟 Southern Southern印跡雜交方法印跡雜交方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果十分靈敏。操作簡(jiǎn)單，結(jié)果十分靈敏。在理想的條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探在理想的條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即使每帶電泳條帶僅含有針和放射自顯影技術(shù)，即使每帶電泳條帶僅含有2ng2ng的的DNADNA也能被清晰地檢測(cè)出來(lái)。也能被清晰地檢測(cè)出來(lái)。 1.硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜 在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)

42、用最廣的一在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，但它存在一些不足之處種固相支持物，但它存在一些不足之處: （1）硝酸纖維素濾膜是依賴）硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用疏水性相互作用結(jié)合結(jié)合DNA的，這種結(jié)合并不十分牢固。的，這種結(jié)合并不十分牢固。（二）（二）Southern雜交的雜交濾膜雜交的雜交濾膜（2）硝酸纖維素濾膜）硝酸纖維素濾膜質(zhì)地較脆弱質(zhì)地較脆弱，容易碎裂。，容易碎裂。（3）硝酸纖維素濾膜與核酸的結(jié)合）硝酸纖維素濾膜與核酸的結(jié)合有賴于高鹽有賴于高鹽濃度濃度。（4）硝酸纖維素濾膜對(duì)于）硝酸纖維素濾膜對(duì)于小分子質(zhì)量小分子質(zhì)量的的DNA片片段段 (特別是小于特別是小

43、于200bp的的DNA片段片段)結(jié)合能力結(jié)合能力不不強(qiáng)強(qiáng)。2. 尼龍膜尼龍膜優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合結(jié)合DNA和和RNA的能力的能力強(qiáng)于強(qiáng)于硝酸纖維素濾膜，對(duì)小硝酸纖維素濾膜，對(duì)小分子質(zhì)量的核酸也能較好地結(jié)合。分子質(zhì)量的核酸也能較好地結(jié)合。尼龍膜韌性強(qiáng)，操作較方便，對(duì)離子濃度要求不高，尼龍膜韌性強(qiáng)，操作較方便，對(duì)離子濃度要求不高，可重復(fù)用于雜交?？芍貜?fù)用于雜交。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：雜交信號(hào)雜交信號(hào)本底本底較硝酸纖維素濾膜較硝酸纖維素濾膜高高。將將RNA分子分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。行核酸

44、雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。二、二、 Northern雜交雜交 Northern雜交的過(guò)程雜交的過(guò)程 提取總提取總RNA。 分離分離mRNA。利用親和層析的原理純化利用親和層析的原理純化mRNA。 制備制備RNA探針。探針。根據(jù)根據(jù)mRNA序列合成同源序列合成同源DNA探針，或以探針，或以cDNA為探針。為探針。 Northern雜交。雜交。Northern雜交的方法包括點(diǎn)雜雜交的方法包括點(diǎn)雜交和印跡雜交，兩者都能鑒定外源基因是否得到交和印跡雜交，兩者都能鑒定外源基因是否得到轉(zhuǎn)錄，但后者還能確定轉(zhuǎn)錄，但后者還能確定mRNA分子質(zhì)量大小及豐分子質(zhì)量大小及豐度。度。三三 菌落原位雜交菌落原位雜交 （col

45、ony in situ hybridization）直接把直接把菌落印跡菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，經(jīng)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，經(jīng)溶菌和變性溶菌和變性處理后使處理后使DNA暴露出來(lái)并與濾膜原位結(jié)暴露出來(lái)并與濾膜原位結(jié)合，再與特異性合，再與特異性DNA探針雜交，篩選出含有插入序探針雜交，篩選出含有插入序列的菌落。列的菌落。菌落原位雜交的操作步驟菌落原位雜交的操作步驟 四四 Western雜交雜交是將是將蛋白質(zhì)電泳、印跡和免疫測(cè)定蛋白質(zhì)電泳、印跡和免疫測(cè)定結(jié)合在一起的檢測(cè)結(jié)合在一起的檢測(cè)方法，具有很高的靈敏度（方法，具有很高的靈敏度（50 ng）。）。原理：原理：先從生物細(xì)胞中先從生物細(xì)胞中提取

46、提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有樣品溶解于含有去污劑和還原劑去污劑和還原劑的溶液中的溶液中經(jīng)經(jīng)SDS-PAGE電泳電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移原位轉(zhuǎn)移到固相膜（硝酸纖到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上維素膜或尼龍膜）上接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其封閉其非特異性位點(diǎn)非特異性位點(diǎn)然后加入特異抗性體（然后加入特異抗性體（一抗一抗），膜上的目的蛋白（抗原），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合）與一抗結(jié)合再加入能與一抗專一性結(jié)合

47、的帶標(biāo)記的再加入能與一抗專一性結(jié)合的帶標(biāo)記的二抗二抗（通常一抗（通常一抗用兔來(lái)源的抗體時(shí)，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體）用兔來(lái)源的抗體時(shí)，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體）最后通過(guò)二抗上帶標(biāo)記化合物（一般為辣根過(guò)氧化物酶最后通過(guò)二抗上帶標(biāo)記化合物（一般為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)或堿性磷酸酶）的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，從而可得知被檢生物（植物）細(xì)胞內(nèi)目根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，從而可得知被檢生物（植物）細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)與否、表達(dá)量及分子量等情況。的蛋白的表達(dá)與否、表達(dá)量及分子量等情況。 Step 1. Antibody Recognitionof target protein

48、/antigenStep 2. Secondary Antibodyrecognition of primary AbStep 3. Color DevelopmentWestern雜交的操作步驟雜交的操作步驟 總結(jié)總結(jié) Southern印跡法（印跡法（DNA印跡法印跡法,Southern blotting）：）：是一種把是一種把DNA電泳分離區(qū)帶轉(zhuǎn)移到支持膜上的技術(shù)。電泳分離區(qū)帶轉(zhuǎn)移到支持膜上的技術(shù)。 Northern印跡法（印跡法（RNA印跡法印跡法,Northern blotting）：）：Alwine等人將等人將Southern印跡法印跡法應(yīng)用于應(yīng)用于RNA，原理與，原理與Southe

49、rn印跡法相似。印跡法相似。 Western印跡法（蛋白質(zhì)印跡法，印跡法（蛋白質(zhì)印跡法，Western blotting）：）：是一種從混合蛋白質(zhì)中檢出微量特是一種從混合蛋白質(zhì)中檢出微量特定蛋白質(zhì)的方法。定蛋白質(zhì)的方法。 Eastern印跡法（印跡法（Eastern blotting）：）：也是一種也是一種蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法，與，與Western印跡法印跡法不同之處不同之處是：是：先用先用等電聚焦等電聚焦-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF-PAGE）分離蛋白質(zhì)，然后也是將蛋白質(zhì)的分離區(qū)帶、以分離蛋白質(zhì)，然后也是將蛋白質(zhì)的分離區(qū)帶、以電驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行了印跡。電驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行

50、了印跡。一、一、RNARNA的的S1S1核酸酶作圖：分析原核酸酶作圖：分析原mRNAmRNA加工剪加工剪接為成熟接為成熟mRNAmRNA中的剪切區(qū)段和邊界。中的剪切區(qū)段和邊界。二、二、S1S1核酸酶作圖分析核酸酶作圖分析mRNAmRNA端點(diǎn)：端點(diǎn)：5 5和和3 3端端均可分析。均可分析。三、引物延伸法分析三、引物延伸法分析mRNAmRNA的端點(diǎn)：只能用于的端點(diǎn)：只能用于5 5末端的作圖。末端的作圖。第四節(jié) RNARNA作圖和端點(diǎn)分析作圖和端點(diǎn)分析( (自學(xué)自學(xué)) )RNA的的S1核酸酶作圖核酸酶作圖分析分析mRNA端點(diǎn)端點(diǎn)引物延伸法分析引物延伸法分析mRNA的端點(diǎn)的端點(diǎn)第五節(jié)第五節(jié) 重組重組D

51、NA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞一一 選擇受體細(xì)胞的基本原則選擇受體細(xì)胞的基本原則二二 重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌基本概念基本概念 受體細(xì)胞受體細(xì)胞(receptor cell) 又稱為宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞又稱為宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞(host cell)等，能攝取外等，能攝取外源源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞。 感受態(tài)感受態(tài)(competence) 細(xì)胞處于能夠細(xì)胞處于能夠吸收吸收DNA的狀態(tài)，稱為感受態(tài)。的狀態(tài)，稱為感受態(tài)。 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞(competent cell) 處于能夠吸收處于能夠吸收DNA狀態(tài)的細(xì)胞。狀態(tài)的細(xì)胞。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化，細(xì)菌轉(zhuǎn)化，

52、是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程。的生命過(guò)程。 轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。的細(xì)胞。 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(transformation):指將指將質(zhì)粒質(zhì)粒DNA或以它為或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中的過(guò)程。載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中的過(guò)程。 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection):指指病毒病毒及其重組子導(dǎo)入受及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。體細(xì)胞的過(guò)程。 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指指噬菌體噬菌體及其重組子導(dǎo)入