1、蛋白質(zhì)組學(xué)簡(jiǎn)介舌質(zhì)組學(xué)的基本概念與原理 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法（雙向電泳.蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì) 譜方法等）翠需霸囂龍蠶囂聶鶴鶏蠢基什么是蛋白質(zhì)（protein）它是一類(lèi)重要的生物高分子，參與了生物體內(nèi)幾乎所有的生理功能和代謝過(guò)程。Protein蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特征0II -NC HC0HHRnR2白質(zhì)是由20種氨基酸通過(guò)肽鍵（酰胺鍵）連接 形成的長(zhǎng)鏈分子（肽鏈），在此基礎(chǔ)上，肽鏈進(jìn) 一步形成二級(jí).三級(jí)的空間結(jié)構(gòu)。有的蛋白質(zhì)還 包含輔基成分，如金屬鐵、猛等。0 0II H IIH ；NC HCNC HC酰牘鍍圖：肽鏈的基本結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)形成空間結(jié)構(gòu)PrimarySecondarystructureMruct

2、urvTeruarj'就 ruewreQuaternarystructurea HelixPolypeptide chuinAssembled wibwuts駐鑼麟豔的咖蠶。Ammo xid residues蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組學(xué)它是指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì) 組的一門(mén)學(xué)科。即研究細(xì)胞在不同生理 或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，并對(duì) 相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)和鑒定。目標(biāo)：研究蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究的歷史背景和意義2001年，人類(lèi)基因組序列圖譜初稿的公布，但是,30000-40000 genesHUMAN BODY 14130000 genes80% homologous同生物基因組比校AR

3、M大小(x 101) 0Q做JLBWZK.(/bp152,0001/1,5005t/< 30余什林母136, 0001/2, 1671996 尢蟲(chóng)9719, 0001/6. 105199812013. 6001/8. 8242000 允ML2. -100 (9»)31. 000 (99%)人2. 900 (14«)31.000- 40. 0001/86. 000“失之差之千里PHYLOGEMYOMTOGEKV生物間蛋白質(zhì)數(shù)的差別竺基因數(shù)差別X 1() «蛋白質(zhì)組可能是生物復(fù)雜性進(jìn)化的基礎(chǔ)£為什么進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究7 mRNA表達(dá)工蛋白表達(dá)（mRN和

4、蛋白水平的相關(guān)性一般低于50%） 基因順序無(wú)法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾一個(gè)生物系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)狀態(tài)通過(guò)蛋白質(zhì)組的 變化能更好的反映基因組基因組比較，蛋白質(zhì)組有如下特點(diǎn)蛋白組多樣性同一性同一個(gè)體的基因組不 論是在不同的發(fā)育階 段或不同種類(lèi)的細(xì)胞 里都是一樣的；對(duì)于不同類(lèi)型的細(xì)胞或 同一個(gè)細(xì)胞在不同的生 理狀態(tài)下，蛋白質(zhì)組的 構(gòu)成是不同的；基因組蛋白組有限性無(wú)限性基因組無(wú)論大小，其 核昔酸的數(shù)量和序列 是一定的，例如人類(lèi) 基因組長(zhǎng)度為32億個(gè) 堿基對(duì)；由于細(xì)胞內(nèi)大部分蛋白 質(zhì)存在翻譯后修飾，包 括磷酸化、糖基化、酰 基化等，很難確定蛋白 質(zhì)組的蛋白質(zhì)數(shù)量；對(duì)基因組序列的測(cè)定 是一種“有限”的工 作。對(duì)蛋

5、白質(zhì)組的蛋白質(zhì)種 類(lèi)的確定是一種“無(wú)限” 的工作。基因組靜態(tài)一個(gè)個(gè)體的基因組 自個(gè)體誕生到死亡, 始終保持不變；蛋白組動(dòng)態(tài)個(gè)體的蛋白質(zhì)組，作 為新陳代謝的主要執(zhí) 行者，在個(gè)體的生命 活動(dòng)中卻總是變動(dòng)的;蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一 個(gè)重要任務(wù)是找出蛋 白質(zhì)組里發(fā)生變化的 蛋白質(zhì)。基因組周期性基因組通常位于細(xì)胞核 內(nèi)，比較穩(wěn)定，序列和 功能一般不受空間的影 響，但是在發(fā)育的不同 階段和不同的細(xì)胞周期, mRNA的表達(dá)是不一樣 的；蛋白組空間性不同的蛋白質(zhì)分布在細(xì)胞的 不同部位，它們的功能與其 空間定位密切相關(guān)；許多蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)不是靜 止的，他們常常在不同的亞 細(xì)胞環(huán)境里運(yùn)動(dòng)而發(fā)揮作用；細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)

6、錄調(diào)控 也常常依賴(lài)于蛋白質(zhì)的變化 和運(yùn)動(dòng)。L基因組孤立行為 基因組表達(dá)的各種 mRNA是彼此孤立的,蛋白組卻是彼此間有著廣泛的相 互作用；互不干擾;蛋白質(zhì)互作的研究有兩類(lèi): 第一類(lèi)是研究蛋白質(zhì)相互 作用的網(wǎng)絡(luò)，第二類(lèi)是研 究蛋白質(zhì)復(fù)合體組成。基因組單一手段 在基因組研究中， DNA測(cè)序技術(shù)是最基 本和最主要的工具， 因?yàn)榛蚪M的均一性 和簡(jiǎn)單性使得一種單一的技術(shù)就能勝任基 因組的研究任務(wù)。蛋白組多種技術(shù)在蛋白質(zhì)組研究中，需要 的研究技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止一種, 并且技術(shù)的難度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大 于基因組的研究技術(shù)；蛋白質(zhì)組研究技術(shù)可以簡(jiǎn) 單地分為兩大類(lèi)：蛋白質(zhì) 組分離技術(shù)，蛋白質(zhì)組的 鑒定技術(shù)，其核心是質(zhì)譜 技術(shù)

7、。蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)研究互補(bǔ)與互助在質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)的過(guò)程中，離不開(kāi)對(duì)已 知基因組的基因數(shù)據(jù)的比較蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)可以幫助大大提高基因注釋的正確率f組學(xué)”對(duì)代、基因組學(xué)(Genomics)轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptomics)蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)廠系統(tǒng)生物學(xué)代謝組學(xué)(Metaboliomics)脂類(lèi)組學(xué)(Lipidomics) 丿蛋白質(zhì)組學(xué)分類(lèi)：細(xì)胞蛋白組學(xué)(Cell Proteomics) 結(jié)構(gòu)蛋 口組學(xué)(Structural Proteomics) 功能蛋 白組學(xué)(Functional Proteomics) 磷酸化蛋 A 組學(xué)(Phosphoproteomics) 臨床蛋

8、白組學(xué)(Clinical Proteomics) 毒理蛋白組學(xué)(Toxicoproteomics)蛋白質(zhì)組學(xué)基本生物問(wèn)題翻譯后修飾蛋口質(zhì)蛋口質(zhì)相互作用基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)組臨床問(wèn)題疾病生物標(biāo)志物-診斷疾病的機(jī)理藥物口標(biāo)-治療蛋白質(zhì)組學(xué)確定蛋白質(zhì)組鑒定定量定位修飾相互作用功能為什么蛋白質(zhì)組學(xué)研究能夠得 到開(kāi)展？新的數(shù)據(jù)分析技術(shù)使蛋白質(zhì)組學(xué)研究切 實(shí)可行占三個(gè)關(guān)鍵技術(shù)分離技術(shù)（2維凝膠電泳技術(shù)和2維葉向色譜分 離技術(shù)）生物質(zhì)譜鑒定技術(shù)（基質(zhì)輔助激光解析電離技 術(shù)和電噴霧電離技術(shù)）蛋白質(zhì)組研究細(xì)胞蛋白質(zhì)分離溶解鑒泄分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備丄.蛋白質(zhì)的寬的動(dòng)力學(xué)范圍(PI)2大量的蛋白質(zhì)

9、是翻譯后修飾形成3.蛋白質(zhì)的種類(lèi)非常巨大4.蛋白質(zhì)的4維行為(3D空間位置，時(shí)間)蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)提取蛋白11ICAT-tag2DE, 2D-HPLC DIGE酶解iTRAQ-tag染色，圖像分析I生物樣品(組織、押胞或體液)(SILAC tag)|離子交換色譜丄 礙解尺寸排阻色譜7多肽反相液相色譜1結(jié)構(gòu)研究 藥物設(shè)計(jì) 疾病診斷MALDI-TOFMALDI-TOF/TOFQ-TOF/ Q-TRAP蛋白質(zhì)功能研究t|蛋白質(zhì)鑒定|數(shù)據(jù)庫(kù)捜索信息氨基酸腋序，蛋白質(zhì)分子量，修飾鑒定Sample preparation Extraction of protein from tissues and ce

10、lls is perhaps the most critical step in any proteomics stratage. because this step in flue nss protein yield, biological activity, and the structural integrity of the specific target protein.LexA Analog (dra0074) Is a Regulatory Protein That Is Irrelevant to recA Induction,Btochem. 2004f 136, 787-7

11、93I Proteomics AnalysisiSample preparationProtein separationIProcessing & Image AnalysisProtein IdentificationPTM IdentificationProtein quantification本節(jié)王要內(nèi)容（main topics）（一）樣品的制備原則（二）細(xì)胞和組織的破碎和蛋白提取方法（三）雙向電泳常規(guī)樣品制備及其改進(jìn)（四）亞細(xì)胞水平（細(xì)胞膜）蛋白組的樣品制備（一）樣品制備的原則（principles）蛋白質(zhì)樣品制備是蛋白質(zhì)組研究的笫一步，無(wú)論后續(xù)釆 用怎樣的分離或鑒定手段，樣品

12、制備都是關(guān)鍵步驟。什么是樣品的全息制備？就是要求樣品制備盡可能獲得所有的蛋白質(zhì)，但由于蛋 白質(zhì)種類(lèi)多、豐度不一和物理化學(xué)特性不同等，要達(dá)到 真正的全息制備是有難度的； The pincipal aim must to be 佗producibly achieve the highest degree of cell breakage using minimal disruptive forces while maintaining protein integrity基本原則:(1 ) 全息，性(keep all of protein information);(2) 樣品制備的方法還必須與后續(xù)

13、的分離或鑒定方法相匹配,如采用雙向電泳，需要謹(jǐn)慎使用SDS抽提蛋白質(zhì)；如 果用液相色譜分離，不應(yīng)該用太多的去污劑和兩性電解 質(zhì)(considering fol lowing protocols/kits )；(3) 由于樣品來(lái)源千差萬(wàn)別，針對(duì)不同來(lái)源的樣品(如細(xì) 胞樣品.動(dòng)物組織樣品、植物樣品、體液等)，需要采 取不同的蛋白質(zhì)抽提方法(Different samples, different extraction)士 樣品制備的影響因素鬻隸有：PH.溫度、機(jī)械剪切力、壓力和蛋hn翳鶴黠蠶籀蠶翱隸但是會(huì)鶴翳因素導(dǎo)致的結(jié)果就是對(duì)目標(biāo)蛋白的研究沒(méi)果導(dǎo)致在生物學(xué)研究的解釋上不統(tǒng)一甚至完全相（二）細(xì)胞和

14、組織的破碎和蛋白提取方法cell disruption and protein isolation細(xì)胞（微生物細(xì)胞）Cells 動(dòng)物組織 Animal tissues 植物組織 Plant tissues體液 Body fluid親水性蛋白；疏水性蛋白； 胞質(zhì)蛋白Cytoplast protein;膜蛋白Membrane protein;核蛋白 Nucleus protein; 低豐度蛋白Low abundance protein;目標(biāo)蛋白Target proteinSolvable sample （可溶性樣品）蛋口濃度較高的樣品，如血漿，血清，可用適量的（ 樣品緩沖液稀釋后直接I:樣:（Bl

15、ood, blood- serum, cerebrospinal fluid, urine, saliva, tear,< bile）、蛋門(mén)質(zhì)濃度較低的或含較A鹽濃度的樣品，如分 泌蛋口，在分離前用硫酸錢(qián)沉淀、透析或?qū)游龇?脫鹽，再川凍干、對(duì)聚乙二醇的透析或丿IJTCA（三 氯醋酸）/丙刖沉淀的方法進(jìn)行濃縮。分泌蛋白質(zhì)（細(xì)菌）的樣品制備：A.細(xì)菌培養(yǎng)到一定密度后，4。匚下2O,OOOg離心15min;B取上清，0.45Pm濾膜過(guò)濾，去除殘余的細(xì)菌；C. 濾液中加入預(yù)冷的25%TCA沉淀蛋白質(zhì)，冰浴15min;D. 4°C 離心lOminE. lOmLW酮重懸沉淀，清洗2次;F.

16、凍干沉淀分泌蛋白質(zhì)制備應(yīng)注意:蛋白質(zhì)的濃縮和除鹽避免培養(yǎng)基中成分對(duì)分泌蛋白質(zhì)的覆蓋;確保獲得足夠?qū)嶒?yàn)需要的蛋白量;如研林和勻叫Moderately harshVigorousSample from tissue （組織樣品）般的固體組織樣詁常在溶解緩沖液中破碎,最好的方法是在組織冷凍及液氮溫度的條件下破碎, 漿器處理：特殊的問(wèn)題：如何解決樣品的異質(zhì)性問(wèn)題？（一個(gè)組織的不同類(lèi)型細(xì)胞的收集問(wèn)題）1）基于免疫親和技術(shù)的選擇； 2）微量切割技術(shù)，如激光俘獲微切割技術(shù) （LCM）,選擇細(xì)胞;TissuesModerately harshDounce homogenizercells broken by

17、shear forces/Pottcr-EIvehjcm homogenizer/Waring Blendor Homogenizeranimal tissuesmost animal plant tissuesGrinding- Ultrasonication植物組織樣陽(yáng)的制備1） TCA/丙酮法-用TCA/lAj酮溶液沉淀蛋白質(zhì)，然后用裂解 液溶解沉淀.優(yōu)點(diǎn)：提高了蛋白提取量；去除次級(jí)代謝 產(chǎn)物的干擾;使體內(nèi)蛋白嗨失活，避免蛋白 降解；缺點(diǎn)：由于不充分的沉淀和溶解而選擇性 地丟失某些蛋白質(zhì).以擬南芥幼葉為例，具體步驟 A稱(chēng)取新鮮的嫩葉200mgr洗凈； B.液氮速凍，研磨，加含0.07%疏

18、基乙醇，10%TCA的丙酮溶液，低溫研磨45min; C.離心15minz用007%疏基乙醇，ImM PMSF和2mM EDTA清洗沉淀，凍干； D.每10mg凍干粉中加入250pL品裂解液（9M尿 素'2%兩性電解質(zhì)，60mM DTT, 0.5% Triton X 丄00和0.003%漠酚蘭） E攪拌,37。£溫浴30min; F離心取上淸2）植物組織分級(jí)捉取法第一級(jí)組分：疏水性蛋白質(zhì)；第二級(jí)組分:疏水性蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合蛋A;第三級(jí)組分：與核酸結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)；. Sample from Cell （細(xì)胞）Jb廠 體外懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞或周期性細(xì)胞樣品I （如紅細(xì)胞）：離心

19、收集一PBS清洗一，溶解刮擦方法獲得細(xì) 胞，裂解細(xì)胞固體基質(zhì)中培養(yǎng)的細(xì)胞：去除培養(yǎng)基質(zhì)一PBS清洗細(xì)胞層樣品分級(jí)rti J貞核組織蛋白質(zhì)表達(dá)的高動(dòng)態(tài)范1韋1和多樣件,時(shí)必須刈蛋門(mén)質(zhì)進(jìn)行分級(jí)處理，降低樣品的復(fù)朵性并富集 低拷貝蛋口質(zhì).方法:1）亞細(xì)胞分級(jí)2）液相電泳3）吸附色譜4）選擇性沉淀5）根據(jù)在溶解能力逐漸增強(qiáng)的緩沖液中溶解性不同, 對(duì)蛋白質(zhì)的分級(jí)提取右細(xì)胞破碎方法1）溫和裂解方法（細(xì)胞，血細(xì)胞，細(xì)菌） 滲透裂解（Osmotic lysis） 凍融裂解(Freeze-thaw or osmotic lysis) 去污劑裂解(Detergent lysis, SDS)酶裂解（Enzymati

20、c lysis,溶菌酶，纖維素酶/果膠酶溶細(xì)胞嗨）細(xì)胞破碎方法2)劇烈裂解方法(固體組織，酵母菌)超聲裂解法(Sonication)弗氏壓碎器(French press pressure cell) 研磨法(Grinding, mortar and pestle)機(jī)械勻漿法(Mechanical homogenization)玻璃珠勻漿法超聲波細(xì)胞破碎儀可以用丁動(dòng)植物組織和細(xì) 胞、細(xì)菌、病毒等超聲波細(xì)胞粉碎儀是- 種實(shí)驗(yàn)室較常見(jiàn)的儀器, 它利用強(qiáng)超聲在液體中 產(chǎn)生空化效應(yīng)，對(duì)物質(zhì) 進(jìn)行超聲處理的多功能、 多用途的儀器，同時(shí)可 用來(lái)乳化、分離、勻化、 提取、消泡、清洗及加 速化學(xué)反應(yīng)等等.French實(shí)驗(yàn)室壓榕機(jī)川于破碎葉綠索，血細(xì)胞， 單細(xì)胞，同類(lèi)動(dòng)物組織和其 它生物顆粒。原理：它用馬達(dá)驅(qū)動(dòng)鋼體內(nèi)活塞 產(chǎn)生40000psi的壓力.加壓樣 品懸浮液體積高達(dá)35ml,以 lml/min的速率穿過(guò)針