1、分子標記輔助育種技術第一節分子標記的類型和作用原理遺傳標記是指可以明確反映遺傳多態性的生物特征。在經典遺傳學中，遺傳多態性是指等位基因的變異。在現代遺傳學中，遺傳多態性是指基因組中任何座位上的相對差異。在遺傳學研究中，遺傳標記主要應用于連鎖分析、基因定位、遺傳作圖及基因轉 移等。在作物育種中，通常將與育種目標性狀緊密連鎖的遺傳標記用來對目標性狀進行 追蹤選擇。在現代分子育種研究中，遺傳標記主要用來進行基因定位和輔助選擇。1、形態標記形態標記是指那些能夠明確顯示遺傳多態性的外觀性狀。如、株高、穗型、粒色 等的相對差異。形態標記數量少，可鑒別標記基因有限，難以建立飽和的遺傳圖譜。有些形態標記受環境

2、的影響，使之在育種的應用中受到限制。2、細胞學標記細胞學標記是指能夠明確顯示遺傳多態性的細胞學特征。如染色體的結構特 征和數量特征。核型：染色體的長度、著絲粒位置、隨體有無。 可以反映染色體的缺失、重復、倒位、易位。染色體結構特征帶型：染色體經特殊染色顯帶后，帶的顏色深淺、寬窄 和位置順序，可以反映染色體上常染色質和異染 色質的分布差異。染色體數量特征一是指細胞中染色體數目的多少。染色體數量上的遺傳多態性包括整倍體和非整倍體變異細胞學標記 優點：克服了形態標記易受環境影響的缺點。 缺點：（ 1）培養這種標記材料需花費大量的人力物力；（ 2）有些物種對對染色體結構和數目變異的耐受性差， 難以獲得

3、相應的標記材料； （3）這種標記常常伴有對生物有害的表型效應；（4）觀察鑒定比較困難。3、蛋白質標記用作遺傳標記的蛋白質分為酶蛋白質和非酶蛋白質兩種。非酶蛋白質：用種子儲藏蛋白質經一維或二維聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據顯示的蛋 白質譜帶或點，確定其分子結構和組成的差異。酶蛋白質：利用非變性淀粉凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳及特異性染色檢測，根據電 泳譜帶的不同來顯示酶蛋白在遺傳上的多態性。蛋白質標記的不足之處：（1）每一種同工酶標記都需特殊的顯色方法和技術；（2）某些酶的活性具有發育和組織特異性；（3）標記的數量有限。4 、 DNA 標記DNA分子標記是DNA水平上遺傳多態性的直接反映。DNA水平的遺傳

4、多態性表現為核苷酸系列的任何差異，包括單個核苷酸的變異、分子標記的類型及作用原理三大類：(1) 基于DNAr DNA雜交的DNA標記利用限制性內切酶酶解及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用經標記的特異DNA探針與之進行雜交，通過放射性自顯影或非同位素顯色技術來揭示DNA的多態性。(2) 基于PCM DNA標記根據所用引物的特點分為隨機引物 PCR標記和特異引物PCF標記。(3) 基于單核苷酸多態性的DNA標記何謂 PCR？聚合酶鏈反應 (Polymerase Chain Reaction) 簡稱 PCR 是一項在短時間內大量擴增特定的DNA片段的分子生物學技術。PCF原 理類似于DNA

5、勺體內復制。首先待擴增 DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應混合物 冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發生退火，再將溫度升高使退火 引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。？這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個 PCR 循環，PCF就是在合適條件下的這種循環的不斷重復。三個基本步驟 : 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94C下解鏈 ;(2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50C左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對；(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適 溫度下,以目的DNA為模板進行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環,理

6、論上每一輪循環將使目的 DNA擴增一倍,這些 經合成產生的DNA又可作為下一輪循環的模板,所以經25-35輪循環就可使DNAT增 達倍。PCR 反應中的主要成份1. 引物2. 4 種三磷酸脫氧核苷酸 (dNTP)3. Mg2+4. 模板 DNA5. Taq DNA 聚合酶6. 反應緩沖液 遺傳性疾病的基因診斷在臨床醫學上，PCR被用于鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒、病菌感染。 法醫學個人識別、親子鑒定1985 年，英國遺傳學家 Jeffreys 采用 DNA 指紋圖譜進行個人識別和親子鑒定。?有時犯罪物證量很少，不足以用來進行 DNA旨紋分析，PCRt效解決這些問 題。對于犯罪現場中遺留的少量生物

7、物證，如一根毛發、一滴血等都可用于分析， 在法醫學上認證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCF技術被普遍采用。植物遺傳育種構建遺傳圖譜、分離目的基因、基因定位 分子標記輔助育種了解不同品種間的親緣關系、系統進化畜牧 畜禽病診斷 : 豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性 腹瀉病毒、免疫缺陷病毒等檢測性別鑒定：牛、綿羊 Y染色體上特異DNA片段構建基因圖譜 檢測基因整合與表達：轉基因魚植物保護 病原微生物的基因型鑒定 植物病原微生物分類 形態學上相似性和潛在的血清學交互反應，用常規方法難以區分，采用反轉錄 PCF(RT-PCR可準確快速區分.理想的DNA標記的應具備以下特點

8、:(1) 表現穩定；2）數量多；3）多態性高；4）對目標性狀表達無不良影響；5）部分標記的遺傳方式為共顯性，可鑒別純合體和雜合體；6）信息量大，分析效率高；7）檢測手段簡單快捷，易于實現自動化；8）開發成本和使用成本低。引物長度為910個堿基。由于引物較短，在PCR中必須使用較低的退火溫度，以保證引物能與模板DNA吉合。RAPD標記的優點：對DNA需要量極少；對DNA的質量要求不高；操作簡單易行； 一套引物可用于不同生物的基因組分析。AFLP標記優點：可靠、高效?？稍谝粋€反應內檢測大量限制性片段。不足：需用同位素或非同位素標記引物，較費時耗材。三個步驟DNA?酶切及人工接頭連接，對提取 DNA

9、質量要求較高，需避免其它 DNA污染和 抑制物質的存在；（2）擴增反應；（3）通常在 4-6 的變性聚丙烯酰胺凝膠上分離(四)SSR標記( Simple sequence Repeat ) =(microsatellite)=(Short Tandem Repeat,STR) 簡單序列重復標記優點：多態性豐富；操作簡便，穩定可靠 缺點：依賴測序設計引物，開發成本高。第二節重要農藝性狀基因 連鎖標記的篩選技術分子標記為實現對基因型的直接選擇提供了可能，因為分子標記的基因型是可以 識別的。如果目標基因與某個分子標記緊密連鎖，那么通過分子標記基因型的檢測，就能 獲知目標基因的基因型。因此，可以借助分

10、子標記對目標性狀的基因型進行選擇，這稱為分子標記輔助選 擇（ MAS）。用于MAS育種的分子標記需具備的條件:1 分子標記與目標基因緊密連鎖;2 標記適用性強，重復性好；3 .不同遺傳背景選擇有效.一、遺傳圖譜的構建 主要環節:1、根據遺傳材料的多態性確定親本組合，建立作圖群體；2、群體中不同植株的標記基因型分析；3、用計算機程序構建連鎖群。暫時性分離群體: F2、F3、F4、三交群體等。BC兩類分離群體 永久性分離群體：RIL、DH群體等。二、近等基因系（NIL）的培育近等基因系：一組遺傳背景相同或相近，只是在個別染色體區段上存在差異的株 系。如果一對近等基因系在目標性狀上表現差異，那么，凡

11、是能在這對近等基因系間揭示多態性的分子標記，就可能位于目標基因的附近。近等基因系是一系列回交過程的產物三、利用群體分離法進行性狀標記利用 NIL 尋找質量性狀基因的分子標記的基本策略是比較輪回親本、 NIL 及供體 親本三者的標記基因型。當 NIL 與供體親本具有相同的標記基因型，但與輪回親本的標記基因型不同時， 則該標記基因就可能與目標基因連鎖。四、數量性狀的基因定位控制數量性狀的基因在基因組中的位置稱為數量性狀基因座（ QTL）利用分子標記進行連鎖遺傳分析，可以檢測出QTL即QTL定位（QTLmapping） 第三節作物MAS育種一、作物MAS育種需具備的條件1、分子標記與目標基因共分離或緊密連鎖；2、具有在大群體中利用分子標記進行篩選的有效手段（ PCR；3、重復性好、經濟、簡單、易操作；4、有相應的計算機數據處理軟件。二、MASt種方