1、.相對定量方法實際操作（常用方法 ）1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程 （RG6000 軟件設置 ）1). 先對樣品中的目的基因與看家基因分別做標準曲線，通過標準曲線確定兩個基因的擴增效率是否一致或接近；將擴增效率優化為一致 。2). 同一樣品分別進行看家基因和目的基因的擴增，分列在兩頁中P1P2相同的樣品在兩頁里命名成相同的名稱，并定義為 unknown分別分析 P1 和 P2 頁選 delta-delta Ct 選項依次填入，并定義對照樣品.專業學習資料.完成分析公式：F=2 待檢樣品目的基因平均Ct 值待檢樣品看對照組目的對照組看家家基因平均基因平均 C

2、t基因平均 CtCt 值值值Comparative Delta-delta Ct法的特點 、注意事項及實際應用1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一種相對定量方法，其最大特點是，當優化的體系已經建立后，在每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標準曲線 ，而只需對待測樣品分別進行PCR 擴增即可 。2). 其缺點是 ，每次實驗都默認目的基因和看家基因的擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映 ，這里勢必存在一定的誤差。3). Comparative Delta-delta Ct法展開定量實驗前 ，在預實驗中 ，必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。Rotor-

3、Gene的軟件會自動給出兩組標準曲線的 R 值、擴增效率等信息 ，如果兩組標準曲線的斜率，即 M 值的差小于 0.1，那么后續實驗中就可以用Comparative Delta-delta Ct法進行相對.專業學習資料.定量分析 。反之 ，如果 M 差值大于 0.1，就無法用該方法進行相對定量分析。此時的解決方法有兩種 ，一是優化實驗 ，使兩組標準曲線的斜率差值小于 0.1，二是換用其它的相對定量方法。應用實例 ：如上圖，將標準品進行梯度稀釋后，分別對目的基因 （ Gene of Interest ）和看家基因（ Housekeeper Gene ）做標準曲線 。軟件自動繪制標準曲線 ，并給出相

4、應的參數 。從上圖可知 ，兩組標準曲線的M 值分別為 -3.525 和 -3.467 ，兩者的差值 <0.1 ，因此，這組看家基因和目的基因可以用Comparative Delta-delta Ct法兩進行相對定量 。在完成上述預實驗之后 ，接下來就可以正式對待測樣品進行定量分析。在該實驗中 ，分別對待測樣品的看家基因和目的基因進行擴增，下圖即為一個標準的擴增分析結果 ：.專業學習資料.為進行 Comparative Delta-delta Ct分析，需要對樣品進行一些編輯。簡而言之，即將目的基因和看家基因分別編輯在兩頁中（page ），并將同一樣品命名成相同名稱 。在該實驗中 ，分別對

5、三個樣品A、B、C 進行了分析 ，其中 1-9 號管檢測了看家基因，10-18 號管檢測了目的基因 。可通過 NEW 新建一個 page ，并通過 Selected 選擇每頁中分析的對像 。 將兩組基因分別編輯在兩頁中 ，并將相同的樣品命名成同一名稱后，即為下圖所示 ：.專業學習資料.Page 2 ：目的基因，其中 10-18 號管通過 YESPage 1：看家基因，其中1-9 號管通過 YES選中，樣品分別命名為A 、B、 C，其它未選選中，樣品分別命名為A、B 、C，其它未選中的樣品可以不進行編輯。中的樣品可以不進行編輯。樣品編輯好后就可進行分析工作。通過進入 Analysis ，分別對

6、page1 和 page2進行分析 。注意 ：由于沒有標準品 ，軟件無法自動給出閾值 ，需用手動設定 ，軟件會提示需手動進行閾值設定，此時只要點中右側按扭 ，在熒光曲線圖中上下拖動光標即可 。.專業學習資料.完成兩頁分析之后 ，再進入 Delta Delta CT 分析界面 ，選擇 show ，此時，軟件的向導界面會提示使用者一步步完成設置：由上至下 ，依次完成各項設置 。第一項： Validation Run Performed，提示是否已驗證過兩個基因的擴增效率一致，可用該定量方法進行分析。選擇 Yes；第二項： Gene of Interest Quantitation，選中 Page

7、1 或 Page 2 中編輯了目的基因的那一頁 ；第三項： Normaliser Quantitation，選中 Page 1 或 Page 2 中編輯了看家基因的那一頁 ；第四項： Calibrator Defined，選中 A、B、C 三個樣品中用來作為對照組的一個。完成上述四項設置之后 ，在窗口右側就顯示相對定量結果，如圖所示 ：.專業學習資料.結果給出三個樣品目的基因和看家基因的平均CT 值，以及樣品 B、C 中目的基因的濃度相對于對照組A 的比值 。2. 雙標準曲線法定量流程 （RG6000 軟件設置 ）1). 用雙標準曲線法定量時 ，每次每個基因都需要做目的基因和看家基因的標準曲線

8、，必需有一組穩定的標準品。2). 同一樣品做標準曲線 ，分別對目的基因和看家基因做標準曲線，分列在兩頁上。P1P2穩定的梯度稀釋標準品：梯度稀釋的穩定的標準品：梯度稀釋的含看家基含目的基因的質粒或PCR 產物，并設因的質粒或PCR產物，并設類型為類型為 Standard ，給出濃度Standard ，給出濃度待檢測樣品：擴增目的基因unknown待檢測樣品：擴增看家基因unknown.專業學習資料.同一待測樣品命名同一名稱，并設類型為unknown.分別分析P1 和 P2 頁選 Two Standard Curve選項依次填入，并定義對照樣品完成分析公式：.專業學習資料.待測樣品目的基因濃度待

9、測樣品看家基因濃度F=對照組目的基因濃度對照組看家基因濃度（基因的濃度由軟件根據標準曲線直接給出）雙標準曲線法的特點 、注意事項及實際應用1. 雙標準曲線法做相對定量分析的最大特點是 ，應用簡便 ，無需像Delta-delta CT 法那樣對實驗進行嚴格的優化 。2. 其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。3. 并且，如果用于做標準曲線的標準品不同于樣品 ，比如標準品為質粒或純化的 PCR產物，而待測樣品為 cDNA ，那么標準曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況 ，因此以標準曲線來計算樣品的實際濃度就存在一定誤差。應用實例 ：在該實驗中 ，樣品管 1-6 為目

10、的基因的標準曲線 ，7-12 為看家基因的標準曲線，待測樣品 A、 B、 C，其中 15-17 擴增了樣品的看家基因 ，18-20 擴增了樣品的目的基因 。.專業學習資料.在用雙標準曲線法做相對定量之前，同樣需要對樣品進行一些編輯。方法與Delta-delta CT法類似，即將所有目的基因編輯在一個page 里，所有看家基因編輯在另一個 page 里，且相同的樣品以同樣名稱命名。編輯完成之后即得 ：.專業學習資料.樣品編輯好后就可進行分析工作。進入 Analysis ，分別對 page1 和 page2 進行分析。完成分析之后 ，從 Other 進入，選擇 2 Standard Curves

11、RelativeQuantitation 。根據提示向導依次完成設置。Page 1 ：看家基因，其中 7-12 號管為標準曲線，通過 YES 選中， 15-17 號管為待測樣品，分別命名為 A 、B、 C，其它未選中的樣品可不以不進行編輯。Page 2 ：目的基因，其中 1-6 號管為標準曲線， 通過 YES 選中， 18-20 號管為待測樣品，分別命名為 A 、B 、C，其它未選中的樣品可不以不進行編輯。依次選中目的基因的page 、看家基因的 page 以及對照組 （例，以 A 為對照組），如圖：.專業學習資料.結果包括計算所得的各標準品及待測樣品的濃度及CT 值，以及樣品 B、C 的目的

12、基因相對于對照組A 的濃度 。3. Comparative Quantitation法定量流程 （RG6000 軟件設置 ）1). 該方法并不常用 ，因為必需確定起始樣品的總核酸濃度一致。在芯片驗證時使用較多 ，但同樣也必需有起始濃度一致的核酸樣品。2). 作為常規的基因表達調控研究，建議研究者使用前兩種定量方法。3). 該方法通過拐點時的循環數來進行相對定量比較，重復性更好 。4). 該方法操作非常簡便 ，無需做標準曲線及設置內參。使用時，樣品均定義為 unknown ，分析時選用 Comparative Quantitation，確定對照組 ，完成分析 。應用實例 ：用 Comparative Quantitation 法進行定量分析時 ，在保證起始總核酸量一致的前提下，只要對目的基因進行擴增即可，例：待測樣品 A、B、C，擴增目的基因。.專業學習資料.進入 Analysis ，在 Other 中選擇 C