1、Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism微生物發酵產酶制作：鄭穗平酶的生產方法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學合成(chemicalsynthesis)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from Aspergil

2、lusPlant cell cultureAnimal cell cultureFew exampleContents of chapter 21、酶生物合成過程2、常見產酶微生物3、酶的發酵工藝條件及控制4、酶生產過程的動力學GoGoGoGo5、動植物細胞培養產酶，自學2.1 酶生物合成過程 The biosynthesis process of Enzyme1、中心法則- Central Dogma 2、RNA的生物合成- Transcription3、蛋白質的生物合成- Translation4、酶生物合成的調節- RegulationGoGoGoGo下一節下一節本章目錄Reverse

3、transcription1、中心法則-Central Dogma nReplication Replication 復制復制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。nTranscription Transcription 轉錄轉錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。nTranslation Translation 翻譯翻譯：亦叫轉譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質的AA順序的過程。nReverse translation Reverse translation 逆轉錄逆

4、轉錄：以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，生成DNA的過程。本節目錄2、RNA的生物合成(轉錄)- Transcription細胞內RNA的生物功能(1) 在某些RNA病毒中，其所含的雙鏈RNA作為遺傳信息的載體。 (2) 在蛋白質的生物合成過程中，各種RNA起著重要的作用。其中，tRNA作為氨基酸載體，并由其上的反密碼子識別mRNA分子上的密碼子；mRNA作為蛋白質合成的模板，由其分子上的三聯體密碼控制蛋白質分子中氨基酸的排列順序；rRNA與蛋白質一起組成核糖核蛋白體（核糖體），作為蛋白質生物合成的場所。(3) 某些RNA具有生物催化活性，屬于核酸類酶，在一定條件下，可以催化有關的生化反應。

5、(4) 各種小分子RNA在分子修飾和代謝調節等方面有重要作用。轉錄過程的特點1 1、轉錄的不對稱性轉錄的不對稱性：在：在RNARNA的合成中，的合成中，DNADNA的二條鏈中僅有的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉錄的模板，稱為轉錄的不對稱性。一條鏈可作為轉錄的模板，稱為轉錄的不對稱性。反義鏈反義鏈 antisenseantisense strand strand（無意義鏈，負鏈）：（無意義鏈，負鏈）：在在RNARNA的轉錄中，的轉錄中，用作模板的用作模板的DNADNA鏈稱為反義鏈。鏈稱為反義鏈。有義鏈有義鏈 coding strandcoding strand（編碼鏈，正鏈）：（編碼鏈，正鏈）：在在

6、RNARNA的轉錄中，不的轉錄中，不作為模板的作為模板的DNADNA鏈稱為有義鏈。鏈稱為有義鏈。2 2、轉錄所需酶：、轉錄所需酶：依賴依賴DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶又稱為轉錄酶，是以又稱為轉錄酶，是以DNADNA為模板的一類為模板的一類RNARNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，聚合酶。在原核生物和真核生物中，轉錄酶有所不同。原核生物的轉錄酶比較簡單，由轉錄酶有所不同。原核生物的轉錄酶比較簡單，由1 1種種RNARNA聚合酶催化所有聚合酶催化所有RNARNA的生物合成。而在真核生物中的生物合成。而在真核生物中RNARNA聚合酶有聚合酶有3 3種種，分別為，分別為RNARNA聚合酶

7、聚合酶、RNARNA聚合酶聚合酶和和RNARNA聚合酶聚合酶，它們都屬于寡聚酶，酶的亞基數目為，它們都屬于寡聚酶，酶的亞基數目為4 41010個，亞基種類有個，亞基種類有4 46 6種。種。 轉錄過程n起始位點的識別起始位點的識別 recognitionrecognitionn轉錄起始轉錄起始 initiationinitiationn鏈的延伸鏈的延伸 elongationelongationn轉錄終止轉錄終止 terminationterminationn轉錄后加工轉錄后加工 modificationmodificationThe E. coli RNA polymerase holoenz

8、yme consists ofsix subunits: Possible catalytic subunitsPromoterspecificity本節目錄3、蛋白質的合成(翻譯)-Translation翻譯翻譯: : 以以RNARNA中中mRNAmRNA為模板為模板, ,按照其按照其 核苷酸順序所組成的密碼指核苷酸順序所組成的密碼指 導蛋白質的合成的過程導蛋白質的合成的過程. .mRNAmRNA蛋白質蛋白質翻譯翻譯 各種信息各種信息 各種蛋白質各種蛋白質（核苷酸排列順序）（核苷酸排列順序） （氨基酸排列順序）（氨基酸排列順序）蛋白質合成的幾個要素-mRNA(模板，template)nmRN

9、AmRNA是帶有是帶有DNADNA遺傳信息指導蛋白質合成的直接模板。遺傳信息指導蛋白質合成的直接模板。n以以mRNAmRNA為模板為模板, ,合成一定結構的多肽鏈的過程合成一定結構的多肽鏈的過程( (翻譯翻譯) )，就，就是將是將mRNAmRNA分子中的核苷酸排列順序轉變成蛋白質分子中分子中的核苷酸排列順序轉變成蛋白質分子中的氨基酸排列順序。的氨基酸排列順序。蛋白質合成的幾個要素-遺傳密碼，nucleotide triplet codonnmRNAmRNA分子中分子中, ,每三個相鄰的核苷酸組成的三聯體代表某種每三個相鄰的核苷酸組成的三聯體代表某種氨基酸或其它信息，稱為氨基酸或其它信息，稱為密

10、碼子密碼子或或三聯密碼三聯密碼。n四種核苷酸編成三聯體可形成四種核苷酸編成三聯體可形成4 43 3個即個即6464個密碼子。其中：個密碼子。其中：n一個起始密碼一個起始密碼: : AUGAUGn三個終止密碼三個終止密碼: : UAA UGA UAGUAA UGA UAGn多數氨基酸擁有多數氨基酸擁有 2-42-4個密碼個密碼蛋白質合成的幾個要素- 轉運RNA (transporter)ntRNAtRNA是氨基酸的轉運工具，攜帶活化的氨基酸到核蛋白體。是氨基酸的轉運工具，攜帶活化的氨基酸到核蛋白體。ntRNAtRNA有特異性，至少有有特異性，至少有2020種以上。每種種以上。每種tRNAtRNA

11、的反密碼環頂端的反密碼環頂端均有由三個核苷酸組成的均有由三個核苷酸組成的反密碼反密碼，能與，能與mRNAmRNA上相應的密碼互上相應的密碼互補結合。補結合。酪酪555533AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪氨酰- tRNA反密碼反密碼mRNA密碼密碼(codon(codon) )與反密碼與反密碼(anticodon(anticodon) )的堿基配對的堿基配對蛋白質合成的幾個要素-核糖體，ribosomen核糖體（或稱核糖核蛋白體）由蛋白質和rRNA組成。是存在于細胞質內的微小顆粒。The ribosome composition of prokaryotic and eukaryotic

12、cell蛋白質合成的幾個要素-其他因子和酶n其他輔助因子其他輔助因子n工具酶工具酶蛋白質的合成過程n肽鏈合成的起始肽鏈合成的起始 initiationn肽鏈合成的延伸肽鏈合成的延伸 elongationn肽鏈合成的終止與釋放肽鏈合成的終止與釋放 termination and releasen合成多肽的輸送和加工合成多肽的輸送和加工 transport and modificationn蛋白質分子的折疊蛋白質分子的折疊 folding氨基酸活化生成氨酰-tRNA 原核生物肽鏈合成的起始階段是在GTP和起始因子（Initiation Factor）的參與下，核糖體30 S亞基，fMet- tRN

13、AF ，mRNA和50 S 亞基結合，組成起始復合物的過程。主要包括5個步驟：（1）30 S亞基與起始因子IF3 結合；（2）30 S亞基與mRNA結合，形成30 S-IF3-mRNA復合物；（3）fMet- tRNAF 與起始因子IF2以及GTP結合，生成fMet- tRNAF -IF2-GTP；（4）在起始因子IF1的參與下，fMet- tRNAF-IF2-GTP與30 S-IF3-mRNA結合生成30 S起始復合物。在此30 S起始復合物中，fMet- tRNAF上的反密碼子正好與mRNA上的起始密碼子AUG結合；（5）50 S亞基與上述30 S起始復合物結合，形成完整的70 S核糖體。

14、同時放出IF1，IF2，IF3 ，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70 S核糖體形成時，fMet- tRNAF 位于70 S核糖體的“P”位（肽酰基位），而它的“A”位（氨酰基位）是空位。 蛋白質合成起始進進位位轉轉位位成肽成肽合成終止高效率的蛋白質合成體系n蛋白質的空間結構如何形成？n功能與結構如何統一？n體外、體內的結構如何變化？n蛋白質分子設計及蛋白質工程的需要蛋白質分子設計及蛋白質工程的需要n越來越多的基因工程產物需要復性復活越來越多的基因工程產物需要復性復活, , 要求蛋白質折疊要求蛋白質折疊的理論及技術的指導的理論及技術的指導。基因工程重組蛋白類產物必須要形成正確的折疊才能表現

15、出功能和活性。蛋白質的折疊本節目錄4、酶生物合成的調節 (regulation)n基因水平的表達控制q酶含量的調節酶含量的調節n操縱子（操縱子（operonoperon）：是一組功能上相關，受同一調控區）：是一組功能上相關，受同一調控區控制的基因組成的一個遺傳單位。控制的基因組成的一個遺傳單位。A BEX底物水平底物水平的調節的調節酶水平酶水平的調節的調節 酶活性的調節酶活性的調節酶含量的調節酶含量的調節酶的定位調節酶的定位調節輔助因輔助因子調節子調節生長發育的不同時期生長發育的不同時期外界環境變化外界環境變化酶合成酶合成與分解速度的變化與分解速度的變化（基因表達調控）（基因表達調控）產物調節

16、產物調節細胞內酶的調控模式n酶在細胞內的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細胞酶在細胞內的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細胞根據自身活動需要，嚴格控制細胞內各種酶的合理含量，根據自身活動需要，嚴格控制細胞內各種酶的合理含量，從而對各種生物化學過程進行調控。從而對各種生物化學過程進行調控。n酶濃度調節的化學本質是基因表達的調節。在細胞內，所合成的酶的種類及數量是由特殊的基因信息決定的。DNA所攜帶的酶蛋白遺傳信息，需要通過轉錄和翻譯而合成酶蛋白。在細胞內進行的轉錄或翻譯過程都有特定的調節控制機制，其中轉錄的調控占主導地位。因此，基因表達的基因表達的調控主要在轉錄水平上進行。調控主要在轉錄水平

17、上進行。酶合成誘導的現象Jacob and Monod的工作： 已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶； -半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。實驗： 1.大腸桿菌生長在葡萄糖培養基上時，細胞內無上述三種酶合成； 2.大腸桿菌生長在唯一碳源乳糖培養基上時，細胞內有上述三種酶合成；當換成葡萄糖培養基時，三種酶基本消失； 3.表明菌體生物合成的經濟原則：需要時才合成。 本世紀三十年代，本世紀三十年代，H.KarstromH.Karstrom在對糖代謝過程中的某些酶在對糖代謝過程中的某些酶的合成進行研究時提出：的合成進行研究時提出：誘導酶與組成酶誘導酶與組成酶某些代謝物可以誘導某些酶的合成，是通過促

18、進為該酶編碼某些代謝物可以誘導某些酶的合成，是通過促進為該酶編碼的基因的表達而進行的，這種現象叫做的基因的表達而進行的，這種現象叫做酶合成的誘導酶合成的誘導。能誘。能誘導酶合成的物質叫導酶合成的物質叫誘導物誘導物。被誘導合成的酶叫。被誘導合成的酶叫誘導酶誘導酶。酶合成阻遏的現象Jacob and Monod的工作：實驗： 1.大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養基上時，檢測到細胞內有色氨酸合成酶的存在； 2.在上述培養基中加入色氨酸，檢測發現細胞內色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現了菌生長的經濟原則：不需要就不合成。某些代謝物可以阻止某些酶的合

19、成，是通過阻止為該酶編某些代謝物可以阻止某些酶的合成，是通過阻止為該酶編碼的基因的表達而進行的，這種現象叫做碼的基因的表達而進行的，這種現象叫做酶合成的阻遏酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物質叫能阻遏酶合成的物質叫輔阻遏物輔阻遏物。被輔阻遏物作用而停止。被輔阻遏物作用而停止合成的酶叫合成的酶叫阻遏酶阻遏酶。乳糖操縱子的結構乳糖操縱子的結構誘導機制誘導機制調節基因調節基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，阻遏蛋白不能與操縱基因結合，結構基因表達結構基因表達調節基因調節基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因輔阻遏物輔阻遏物trp代謝產物與阻遏蛋白結代

20、謝產物與阻遏蛋白結合，使之構象發生變化合，使之構象發生變化與操縱基因結合，結構與操縱基因結合，結構基因不能表達基因不能表達色氨酸操縱子（酶的阻遏）色氨酸操縱子（酶的阻遏） -阻遏物和操縱基因的調節阻遏物和操縱基因的調節細菌乳糖操縱子的作用機制細菌乳糖操縱子的作用機制( (降解物阻遏降解物阻遏) )調節基因調節基因啟動子啟動子操縱操縱基因基因lacZ lacYlacACAPcAMPCAP-cAMPCAP-cAMP復合物復合物mRNAmRNA當葡萄糖作唯一碳源時，葡萄糖的降解物對腺苷酸環化酶有抑制作用，當葡萄糖作唯一碳源時，葡萄糖的降解物對腺苷酸環化酶有抑制作用，則則cAMPcAMP的濃度降低，的

21、濃度降低， CAP-cAMPCAP-cAMP復合物減少，不能與啟動子結合，故復合物減少，不能與啟動子結合，故轉錄不得進行。轉錄不得進行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透過酶-半乳糖苷乙酰基轉移酶酶過去稱葡萄糖效應過去稱葡萄糖效應本節目錄2.2 常見產酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production基本要求：n不是致病菌n發酵周期短,產酶量高n不易變異退化n最好是產生胞外酶的菌種,利于分離。n對醫藥和食品用酶,還應考慮安全性：n凡從可食部分或食品加工中傳統使用的微生物生產的酶,安全!n由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性實驗。n非常見微生物制取的酶,需做廣泛

22、的毒性實驗,包括慢性中毒實驗。下一節下一節本章目錄n形態：短桿或長桿狀，0.51.01.03.0 um，革蘭氏陰性，運動(周毛)或不運動，無芽孢，一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴展，光滑，閃光。nEscherich屬菌株和大多數大腸桿菌是無害，但也有些大腸桿菌是致病的，會引起腹瀉和尿路感染。n大腸桿菌的名聲主要因它易于在實驗室操作、生長迅速，而且營養要求低。n應用：大腸桿菌能作為宿主供大量的細菌病毒生長繁殖大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌基因工程的宿主菌工業上生產谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和 制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等n菌體從橢圓至桿狀，單個、成對或成鏈，革蘭氏陰性，運動（周毛）或不運

23、動，不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養基上生長良好。n應用：有機酸(食醋等）葡萄糖異構酶(高果糖漿 )山梨糖 (維C中間體） n直狀、近直狀的桿菌，周生或側生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。n枯草芽孢桿菌是工業發酵的重要菌種之一。生產淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。n分類學上屬于藻狀菌綱，毛霉目，根霉屬。 n根霉因有假根（根霉因有假根（RhizoidRhizoid）而得名）而得名（假根的功能是在培養基上固著，（假根的功能是在培養基上固著，并吸收營養）。并吸收營養）。n分布于土壤、空氣中，常見于淀粉分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引

24、起霉腐變質和水果、食品上，可引起霉腐變質和水果、蔬菜的腐爛。蔬菜的腐爛。n代表種：代表種：米根霉（米根霉（R.oryzaeR.oryzae) )黑根黑根霉霉(R.nigrican(R.nigrican) )等。等。n應用：應用：根霉能產生一些酶類，如淀根霉能產生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產這些酶類的菌種。這些酶類的菌種。在釀酒工業上常在釀酒工業上常用做糖化菌。有些根霉還能產生乳用做糖化菌。有些根霉還能產生乳酸、延胡索酸等有機酸。酸、延胡索酸等有機酸。n分類：多數屬于子囊菌亞門，分類：多數屬于子囊菌亞門，少數屬于半知菌亞門。少數屬于半知菌亞門。n分布

25、：廣泛分布于土壤、空氣分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質，有的可產和果蔬的霉腐變質，有的可產生致癌性的黃曲霉毒素。生致癌性的黃曲霉毒素。n代表種：代表種：黑曲霉黑曲霉Asp. NigerAsp. Niger、黃曲霉黃曲霉Asp.flavusAsp.flavusn應用：應用：是制醬、釀酒、制醋的是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產酶制劑（蛋主要菌種。是生產酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產有機酸（如檸檬酸、種。生產有機酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農業上用作生葡萄糖酸等）。農業上用作生產糖化飼料的菌種。

26、產糖化飼料的菌種。回本節2.3 酶的發酵工藝條件與控制 The fermentation principles and its control of enzyme production1、培養基2、發酵條件及控制- Transcription3、提高產酶的措施- TranslationGoGoGo下一節下一節本章目錄1、培養基微生物微生物動物動物（異養）（異養）異養自養綠色植物綠色植物（自養）（自養）碳源碳源糖類、脂肪糖、醇、有機酸等二氧化碳、碳酸鹽等二氧化碳氮源氮源蛋白質及其降解物蛋白質及其降解物、有機氮化物、無機氮化物、氮無機氮化物、氮無機氮化物能源能源與碳源同與碳源同氧化無機物或利用日光

27、能利用日光能生長因子生長因子維生素有些需要維生素等生長因子不需要不需要無機元素無機元素無機鹽無機鹽無機鹽無機鹽水分水分水水水水各種生物對營養的需求各種生物對營養的需求n1、選擇適宜的營養物質n2、營養物的濃度及配比合適n3、物理、化學條件適宜n4、經濟節約n5、精心設計、試驗比較培養不同的微生物必須采用不同的培養條件；培養目的不同，原料的選擇和配比不同；不同階段，培養條件也有所差異。培養基的設計原則培養基的設計原則五大要素：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水五大要素：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水培養基幾乎是一切對微生物進行研究和利用工作的基礎培養基幾乎是一切對微生物進行研究和利用工作的基礎培

28、養基（培養基（mediummedium）是人工配制的，適合微生物生長繁殖）是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產生代謝產物的營養基質。或產生代謝產物的營養基質。構成細胞物質或代謝產物中碳架構成細胞物質或代謝產物中碳架 碳源可作能源，為生命活動提供能量碳源可作能源，為生命活動提供能量常用碳源：糖類、醇類、脂類、有機酸、烴類、蛋白常用碳源：糖類、醇類、脂類、有機酸、烴類、蛋白質及其降解物質及其降解物異養微生物：糖類是最好碳源（葡萄糖最為通用）異養微生物：糖類是最好碳源（葡萄糖最為通用） 水是微生物最基本的組成分（水是微生物最基本的組成分（）水是微生物體內和體外的溶劑（吸收營養成分和代謝廢物）水是微生

29、物體內和體外的溶劑（吸收營養成分和代謝廢物）水是細胞質組分，直接參與各種代謝活動水是細胞質組分，直接參與各種代謝活動調節細胞溫度和保持環境溫度的穩定（比熱高，傳熱快）調節細胞溫度和保持環境溫度的穩定（比熱高，傳熱快）水水碳源碳源選擇合適碳源，以適應目的酶的合成調節機制選擇合適碳源，以適應目的酶的合成調節機制構成細胞物質和代謝產物中氮素（不能用作能源構成細胞物質和代謝產物中氮素（不能用作能源 ）氮源有機氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏無機氮源銨鹽、硝酸鹽 參與酶的組成、構成酶活性基、激活酶活性參與酶的組成、構成酶活性基、激活酶活性維持細胞結構的穩定性維持細胞結構的穩定性調節細胞滲透壓調節細胞滲透壓控制

30、細胞的氧化還原電位控制細胞的氧化還原電位有時可作某些微生物生長的能源物質有時可作某些微生物生長的能源物質 常用：硫酸鹽、常用：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物磷酸鹽、氯化物以及含有鉀、鈉、以及含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元鈣、鎂、鐵等元素的化合物。素的化合物。 氮源氮源無機鹽無機鹽需要注意合適的碳氮比需要注意合適的碳氮比生長因子生長因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物質進生長因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物質進行合成，而必須另外加入少量的生長需求的有機物質。行合成，而必須另外加入少量的生長需求的有機物質。 分類：分類：化學結構分成維生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍化學結構分成維生素、氨基酸

31、、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和類脂成分生物和類脂成分 等四類等四類功能：以輔酶與輔基的形式參與代謝中的酶促反應功能：以輔酶與輔基的形式參與代謝中的酶促反應 實驗室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作為各種生長因實驗室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作為各種生長因子的的需要，麥芽汁、米曲汁等天然培養基中本身含有各子的的需要，麥芽汁、米曲汁等天然培養基中本身含有各種生長因子種生長因子 實驗室的常用培養基：實驗室的常用培養基：細菌：細菌： 牛肉膏蛋白胨培養基（或簡稱普通肉湯培養基）；牛肉膏蛋白胨培養基（或簡稱普通肉湯培養基）；放線菌：高氏放線菌：高氏1 1號合成培養基培養；號合成培養基培養；酵母菌：麥芽汁培

32、養基；酵母菌：麥芽汁培養基；霉菌：霉菌： 查氏合成培養基；查氏合成培養基；例如枯草芽孢桿菌：例如枯草芽孢桿菌：一般培養：肉湯培養基或一般培養：肉湯培養基或LBLB培養基；培養基；自然轉化：基礎培養基；自然轉化：基礎培養基；觀察芽孢：生孢子培養基；觀察芽孢：生孢子培養基；產蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產酶培養基；產蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產酶培養基；n枯草桿菌枯草桿菌BF7658-BF7658-淀粉酶發酵培養基淀粉酶發酵培養基：玉米粉8%，豆餅粉4%，磷酸氫二鈉 0.8%，硫酸銨0.4%，氯化鈣0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。n枯草桿菌枯草桿菌AS1.398AS1.398中性

33、蛋白酶發酵培養基中性蛋白酶發酵培養基：玉米粉4%，豆餅粉3%，麩皮3.2%, 糠1%, 磷酸氫二鈉0.4%, 磷酸二氫鉀0.03%（自然pH）。n黑曲霉糖化酶發酵培養基黑曲霉糖化酶發酵培養基：玉米粉10%，豆餅粉4%，麩皮1%（pH4.45.0）。n地衣芽孢桿菌地衣芽孢桿菌27092709堿性蛋白酶發酵培養基堿性蛋白酶發酵培養基：玉米粉5.5%, 豆餅4%, 磷酸氫二鈉0.4%, 磷酸二氫鉀0.03%(pH 8.5)。n黑曲霉黑曲霉AS 3.350AS 3.350酸性蛋白酶發酵培養基酸性蛋白酶發酵培養基: 玉米粉6%, 豆餅粉4%, 玉米漿0.6%, 氯化鈣0.5%, 氯化銨1%, 磷酸氫二鈉

34、0.2% (pH 5.5)。 n游動放線菌葡萄糖異構酶發酵培養基游動放線菌葡萄糖異構酶發酵培養基：糖蜜2%，豆餅粉2%，磷酸氫二鈉0。1%，硫酸鎂0。05% (pH 7.2)。n桔青霉磷酸二酯酶發酵培養基桔青霉磷酸二酯酶發酵培養基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸鎂0.05%, 氯化鈣0.04%, 磷酸氫二鈉0.05%, 磷酸二氫鉀0.05% (自然pH)。n黑曲霉黑曲霉AS3.396AS3.396果膠酶發酵培養基果膠酶發酵培養基: 麩皮5%, 果膠0.3%, 硫酸銨2%, 磷酸二氫鉀0.25%, 硫酸鎂0.05%, 硝酸鈉0.02%, 硫酸亞鐵0.001% (自然pH)。n枯草桿菌枯草

35、桿菌AS1.398AS1.398堿性磷酸酶發酵培養基堿性磷酸酶發酵培養基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸銨1%, 氯化鉀0.1%, 氯化鈣0.1mmol/L, 氯化鎂1.0mmol/L, 磷酸氫二鈉20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl緩沖液配制)回本節2 2、發酵條件及控制、發酵條件及控制培養基的pH必須控制在一定的范圍內，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產生代謝產物。為了維持培養基pH的相對恒定，通常在培養基中加入pH緩沖劑，或在進行工業發酵時補加酸、堿。通常培養條件：細菌與放線菌：pH77.5酵母菌和霉菌：pH4.56范圍內生長pHpH值的控制值的控制細胞發

36、酵產酶的最適細胞發酵產酶的最適pHpH值與生長最適值與生長最適pHpH值往往有所不同。細胞生產值往往有所不同。細胞生產某種酶的最適某種酶的最適pHpH值通常接近于該酶催化反應的最適值通常接近于該酶催化反應的最適pHpH值。值。 有些細胞可以同時產生若干種酶，在生產過程中，通過控制培養有些細胞可以同時產生若干種酶，在生產過程中，通過控制培養基的基的pHpH值，往往可以改變各種酶之間的產量比例。值，往往可以改變各種酶之間的產量比例。 通常在生物學范圍內每升高10，生長速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應，對于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶。溫度的控制溫度的控制有些細胞發酵產酶的最適溫度與

37、細胞生長最適溫度有所不同，而且往往低于生長最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對應的mRNA的穩定性，增加酶生物合成的延續時間，從而提高酶的產量。 枯草桿菌的最適生長溫度為3437黑曲霉的最適生長溫度為2832 溶解氧的控制溶解氧的控制在酶的發酵生產過程中， 處于不同生長階段的細胞，其細胞濃度和細胞呼吸強度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此必須根據耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。 培養液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養液的性質等有密切關系。一般說來，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時間越長、

38、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養液的性質，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對于溶氧速率有明顯影響。調節通氣量調節氧的分壓 調節氣液接觸時間 調節氣液接觸面積 改變培養液的性質 控制溶解氧方法回本節3、提高酶產量的措施提高酶產量的措施 添加誘導物添加誘導物對于誘導酶的發酵生產，在發酵過程中的某個適宜的時機，添加適宜的誘導物，可以顯著提高酶的產量。例如，乳糖誘導-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導蔗糖酶的生物合成等。 誘導物一般可以分為3類 酶的作用底物酶的作用底物 酶的催化反應產物酶的催化反應產物 作用底物的類似物作用底物的類似物控制阻遏物的濃度控制阻遏物的濃度阻遏作用根據

39、機理不同，可分為：產物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。1.1.產物阻遏作用是由酶催化作用的產物或者代謝途徑的末端產物引起產物阻遏作用是由酶催化作用的產物或者代謝途徑的末端產物引起的阻遏作用。的阻遏作用。2.2.分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質經過分解代謝而產生的物質）引起的阻遏作用碳源等物質經過分解代謝而產生的物質）引起的阻遏作用。控制阻遏物的濃度是解除阻遏、提高酶產量的有效措施。 為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應當控制培養基中葡萄糖等容易利控制培養基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度用的碳源的濃度。采用

40、其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補料、分次流加碳源添加一定量的環腺苷酸（cAMP）對于受代謝途徑末端產物阻遏的酶，可以通過控制末端產物的濃度的方法控制末端產物的濃度的方法使阻遏解除使阻遏解除。 添加表面活性劑添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產量。外酶的分泌，從而提高酶的產量。 將適量的非離子型表面活性劑非離子型表面活性劑，如吐溫（吐溫（TweenTween）、特里頓特里頓(Triton)(Triton)等添加到培養基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產量增加。 由于離子型表

41、面活性劑對細胞有毒害作用離子型表面活性劑對細胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如新潔而滅等）是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發酵生產中添加到培養基中。 添加產酶促進劑添加產酶促進劑 產酶促進劑是指可以促進產酶、但是作用機理未闡明清楚的物質可以促進產酶、但是作用機理未闡明清楚的物質。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產量提高120倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的產量。產酶促進劑對不同細胞、不同酶的作用效果各不相同，現在還沒有規律可循，要通過試驗確定所添加的產酶促要通過試驗確定所添加的產酶促進劑的種類和濃度進劑的種類和濃

42、度。 回本節2.4 2.4 酶生產過程的動力學酶生產過程的動力學1、酶生物合成的模式2、酶生產過程中細胞生長動力學3、酶生產過程中產酶動力學GoGoGo本章目錄1 1、酶生物合成的模式、酶生物合成的模式細胞在一定條件下培養生長，細胞在一定條件下培養生長， 其生長過程一般經歷調整期、生長期、其生長過程一般經歷調整期、生長期、平衡期和衰退期等平衡期和衰退期等4 4個階段個階段 通過分析比較細胞生長與酶產生的關系, 可以把酶生物合成的模式分為4種類型。即同步合成型同步合成型，延續合成型延續合成型，中期合成型中期合成型和滯后合成型。滯后合成型。 同步合成型同步合成型 酶的生物合成與細胞生長同步進行的一

43、種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細胞生長速度緊密聯系， 又稱為生長偶聯型生長偶聯型。 屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細胞的生長而開始；在細胞進入旺盛生長期時，酶大量生成；當細胞生長進入平衡期后，酶的合成隨著停止。 大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導酶也按照大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導酶也按照此種模式進行生物合成。此種模式進行生物合成。 例如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸的培養基中生長，在單寧或沒食子酸的誘導作用下，合成單寧酶（tanase EC3.1.1.20）。 細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細胞濃度 活細胞濃度胞外酶濃度 胞內酶濃度延續合成

44、型延續合成型 酶的生物合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶的生物合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續合成一段較長時間。酶還可以延續合成一段較長時間。 屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導酶。例如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養基中培養，可以誘導聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。 細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導物 以含有葡萄糖的果膠為誘導物 中期合成型中期合成型 該類型的酶在細胞生長一段時間以后才開始，而在細胞生長進入該類型的酶在細

45、胞生長一段時間以后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止。 例如，枯草桿菌堿性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)的生物合成模式屬于中期合成型。這是由于該酶的合成受到其反應產物無機磷酸的反饋阻遏，而磷又是細胞生長所必不可缺的營養物質，培養基中必須有磷的存在。這樣， 在細胞生長的開始階段, 培養基中的磷阻遏堿性磷酸酶的合成，只有當細胞生長一段時間， 培養基中的磷幾乎被細胞用完（低于0.01mmol/L）以后，該酶才開始大量生成。又由于堿性磷酸酶所對應的mRNA不穩定，其壽命只有30 min左右，所以當細胞進入

46、平衡期后， 酶的生物合成隨著停止。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml滯后合成型滯后合成型 此類型酶是在細胞生長一段時間或者進入平衡期以后才開始其生此類型酶是在細胞生長一段時間或者進入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯型非生長偶聯型。許多水解酶的生物合成都許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。屬于這一類型。 屬于滯后合成型的酶，之所以要在細胞生長一段時間甚至進入平衡期以后才開始合成，主要原因是由于受到培養基中存在的阻遏物的阻由于受到培養基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細胞的生長，阻遏物幾乎被細胞用完而使阻遏解除遏作用。只有隨著細胞的生長，阻遏物幾乎被細

47、胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。后，酶才開始大量合成。 若培養基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉為延續合成型。該類型酶所對應的mRNA穩定性很好，可以在細胞生長進入平衡期后的相當長的一段時間內，繼續進行酶的生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成 放線菌素D 對產酶的影響細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml3022不加加入不加加入理想的酶合成模式理想的酶合成模式n酶所對應的酶所對應的mRNAmRNA的穩定性以及培養基中阻遏物的存在是影響酶生物合成模式的主的穩定性以及培養基中阻遏物的存在是影響酶生物合成模式的主要因素。要因素。其中，mRNA穩定性好的，可以在細胞生長進入平衡期以后，繼續合成其所對應的酶；mRNA穩定性差的，就隨著細胞生長進入平衡期而停止酶的生物合成