1、傳染性軟化病病毒（桐鄉株）的nested RT-PCR檢測及其RNA聚合酶的克隆和表達    英文題名 Detection of Infetious Flacherie Virus(Chinese Isolate) by Nested RT-PCR and Expression of the Viral RNA Polymerase  中文摘要 病毒性軟化病是一種嚴重影響蠶業生產的流行病,其病原為傳染性軟化病病毒(infectious flacherie virus, IFV)。雖然類似軟化病的情況在許多國家都有發生,但確切分離到IFV毒株的只

2、有日本。作為世界上最大養蠶國的中國,在分離鑒定IFV上存在著很長一段時間的空白。 本實驗室2002年在桐鄉蠶區分離到一株RNA病毒,在形態學觀察等基礎上,本研究用兩對嵌套引物對該病毒進行分子鑒定。Nested RT-PCR結果證明該病毒在兩輪反應中均能特異性擴增出與預期大小一致的片段?；厥漳康臈l帶進行測序后得到一段217bp的序列,通過BLAST搜索,發現該片段與IFV日本株相應區域匹配,核苷酸序列相似性達99.5%,氨基酸完全同義。由此可確定該病毒為IFV,這是我國首次分離到該病毒,暫命名為IFV Zhejiang01/2002/CHN。 以IFV Zhejiang01/2002/CHN基因

3、組RNA為模板,用RT-PCR擴增了其RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)編碼區全長序列。將片段連入pMD18-T載體進行克隆。測序顯示編碼RdR. 英文摘要 Flacherie disease of silkworm, Bombyx mori is a viral disease causing serious loss of sericulture. The causative agent of this disease  摘要 8-9 ABSTRACT 9-10 第1章 文獻綜述 11-39   &

4、#160; 1.1 小RNA病毒概況 11-21         1.1.1 小RNA病毒的分類學地位 11         1.1.2 小RNA病毒的結構特征和化學組成 11-13         1.1.3 小RNA病毒的復制 13-16         1.1.4 小RNA病毒的翻譯 16-18  &#

5、160;      1.1.5 小RNA病毒的蛋白質加工 18-20         1.1.6 昆蟲小RNA樣病毒 20-21     1.2 傳染性軟化病病毒(IFV)研究進展 21-30         1.2.1 軟化病及其病原的研究歷史 21-22         1.2.2 IFV粒子的形態結構和

6、理化特性 22-23         1.2.3 IFV的基因組 23-24         1.2.4 IFV的蛋白組 24-27         1.2.5 IFV的病理學 27-28         1.2.6 IFV的分類學地位 28-29       

7、;  1.2.7 IFV的檢測手段 29-30     1.3 RNA依賴性RNA聚合酶研究進展 30-39         1.3.1 RdRp的分類和功能 30-31         1.3.2 RdRp的整體結構 31-32         1.3.3 RdRp的結構域 32-34      

8、   1.3.4 RdRp的保守基序 34-35         1.3.5 RdRp的催化機制 35-37         1.3.6 RdRp在抗病毒治療中的應用 37-39 第2章 IFV(桐鄉株)的nested RT-PCR檢測 39-47     2.1 材料 40         2.1.1 生物材料 40  

9、60;      2.1.2 酶和試劑 40         2.1.3 引物 40         2.1.4 溶液 40     2.2 方法 40-44         2.2.1 病毒的增殖 40-41         2.2.2

10、病毒的純化 41-42         2.2.3 RNA模板的制備 42-43         2.2.4 RT-PCR 43-44         2.2.5 PCR產物測序及BLAST搜索 44     2.3 結果 44-45         2.3.1 Nested RT-PCR

11、結果 44-45         2.3.2 BLAST搜索和序列分析 45     2.4 討論 45-47 第3章 IFV(桐鄉株)RNA聚合酶的克隆及序列分析 47-60     3.1 材料 48-49         3.1.1 病毒 48         3.1.2 載體和菌株 48   

12、0;     3.1.3 引物 48         3.1.4 酶和其他試劑 48-49         3.1.5 溶液和培養基 49     3.2 方法 49-54         3.2.1 病毒RNA的抽提 49         3.2.

13、2 反轉錄 49         3.2.3 PCR擴增RdRp 49-50         3.2.4 擴增片段的回收 50         3.2.5 連接 50-51         3.2.6 感受態細胞的制備 51-52         3

14、.2.7 轉化 52         3.2.8 抽提質粒DNA 52-53         3.2.9 重組質粒的鑒定 53         3.2.10 質粒的序列測定 53         3.2.11 序列分析和進化樹的構建 53-54     3.3 結果 54-58  

15、;       3.3.1 RdRp的RT-PCR擴增 54-55         3.3.2 重組質粒的PCR和酶切鑒定 55         3.3.3 RdRp序列的測定和分析 55-56         3.3.4 RdRp多重序列對比 56-57       

16、  3.3.5 系統發育樹的構建 57-58     3.4 討論 58-60 第4章 IFV RdRp在桿狀病毒表達系統中的表達 60-72     4.1 材料 61-62         4.1.1 質粒、菌種和細胞 61         4.1.2 引物 61         4.1.3 酶和其他試劑 61-6

17、2         4.1.4 溶液和培養基 62     4.2 方法 62-68         4.2.1 RdRp片段的擴增和回收 62         4.2.2 供體質粒的構建 62-64         4.2.3 重組供體質粒的鑒定和測序 64   &#

18、160;     4.2.4 轉座 64-65         4.2.5 重組Bacmid的分離 65-66         4.2.6 重組Bacmid的鑒定 66         4.2.7 重組Bacmid轉染BmN細胞 66         4.2.8 重組桿狀病毒的收

19、集和增殖 66-67         4.2.9 蛋白表達和蛋白樣品的制備 67         4.2.10 蛋白樣品的SDS-PAGE 67-68     4.3 結果 68-70         4.3.1 RdRp片段的擴增 68         4.3.2 重組供體質粒的鑒定 6

20、8         4.3.3 重組質粒部分序列的測定 68-69         4.3.4 重組Bacmid的鑒定 69-70         4.3.5 蛋白樣品的SDS-PAGE 70     4.4 討論 70-72 結論和展望 72-73 參考文獻 73-84 附錄A 常用緩沖液和培養基 84-90 附錄B 縮略詞 90-91 附錄C Bac-t

21、o-Bac系統工作原理 91-92 Writings&Sequences 92-93         4.2.10 蛋白樣品的SDS-PAGE 67-68     4.3 結果 68-70         4.3.1 RdRp片段的擴增 68         4.3.2 重組供體質粒的鑒定 68     

22、60;   4.3.3 重組質粒部分序列的測定 68-69         4.3.4 重組Bacmid的鑒定 69-70         4.3.5 蛋白樣品的SDS-PAGE 70     4.4 討論 70-72 結論和展望 72-73 參考文獻 73-84 附錄A 常用緩沖液和培養基 84-90 附錄B 縮略詞 90-91 附錄C Bac-to-Bac系統工作原理 91-92 Writings&am

23、p;Sequences 92-93         4.2.10 蛋白樣品的SDS-PAGE 67-68     4.3 結果 68-70         4.3.1 RdRp片段的擴增 68         4.3.2 重組供體質粒的鑒定 68         4.3.3 重組質粒部分序

24、列的測定 68-69         4.3.4 重組Bacmid的鑒定 69-70         4.3.5 蛋白樣品的SDS-PAGE 70     4.4 討論 70-72 結論和展望 72-73 參考文獻 73-84 附錄A 常用緩沖液和培養基 84-90 附錄B 縮略詞 90-91 附錄C Bac-to-Bac系統工作原理 91-92 Writings&Sequences 92-93         4.2.10 蛋白樣品的SDS-PAGE 67-68     4.3 結果 68-70         4.3.1 RdRp片段的擴增 68         4.3.2 重組供體質粒的鑒定 68         4.3.3 重組質粒部分序列的測定 68-69