1、    低頻重復經顱磁刺激對帕金森病大鼠行為學的影響作者：孫秀巧 王彥永 王銘維 孫海民 郭記宏 時軍 王培芝    作者單位：050031 石家莊,河北醫科大學第一醫院神經內科/河北省腦老化與認知神經科學重點實驗室【摘要】  目的 探討0.5 Hz重復經顱磁刺激(rTMS)對帕金森病大鼠行為學的影響。方法 取健康SD大鼠45只，用6OHDA毀損右側黑質致密部(SNc)與中腦腹側背蓋(VTA)制備偏側帕金森病模型。用阿撲嗎啡(APO)腹腔注射篩選，將成功的20只帕金森病鼠隨機分為治療組和對照組，每組10只。治療組給

2、予rTMS治療，頻率為0.5 Hz，刺激強度為閾上30%，連續20個刺激，每天1次，連續刺激2周。對照組予以假刺激。在治療前、治療結束后第1天、14天、28天分別測定APO誘導的大鼠旋轉圈數、啟動潛伏期的變化。結果 (1)大鼠旋轉圈數(r/min)：治療組與對照組在治療結束后第14天為(9.7±3.0 vs 14.6±2.6)、28天為(9.2±2.7 vs 14.2± 2.6)，治療組旋轉圈數減少，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；治療組在治療結束后第14天、28天與治療前比較差異有統計學意義(P<0.05)；對照組各時間點比較

3、差異無統計學意義(P0.05)。(2)啟動潛伏期(s):治療組與對照組rTMS治療結束后第1天(25±9 vs 39±16)、第14天(18±7 vs 42±16)、第28天(17±7 vs 42±16)比較，治療組啟動潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05);治療組各時間點與治療前比較差異有統計學意義(P<0.05)；對照組各時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論 0.5 Hz、閾上30%刺激強度的rTMS可改善PD大鼠的行為學異常。【關鍵詞】  帕金森病 磁療法 行為學 大鼠磁刺激(m

4、agnetic stimulation，MS)是一種無痛、無創、快捷的神經電生理技術，可以影響中樞及外周神經的功能活動，并且可以通過調節頻率、強度、刺激間歇及持續時間來影響神經系統的興奮性，因而對中樞及外周神經系統疾病具有潛在治療作用。重復經顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)對帕金森病(Parkinsons disease,PD)的療效目前尚無一致結論。為此，本實驗利用健康SD大鼠建立6羥基多巴胺(6OHDA)偏側PD模型。應用rTMS技術對模型大鼠進行干預，觀察rTMS對PD的治療作用。  

5、60; 1  材料與方法    1.1  材料    1.1.1  實驗動物： 健康SpragueDawley(SD)雄性大鼠45只，體質量270300 g，鼠齡34個月。由河北醫科大學實驗動物中心提供。    1.1.2  主要試劑與儀器： SR6N腦立體定向儀(日本)、肌電/誘發電位儀、Magstim220型磁刺激儀和S90型圓形線圈(英國牛津公司)、5 l無存液微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠)；6羥基多巴胺(6OHDA)、阿樸嗎啡(Sigma公司)。

6、0;   1.2  檢測方法    1.2.1  模型的制備及篩選: 將45只雄性SD大鼠按改良的Thomas1方法制作PD大鼠模型，10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉。參照文獻2確定右側黑質致密部(SNc)、中腦腹側被蓋部(VTA)坐標位置。用5 l微量注射器抽取4 g/l的6OHDA(溶于0.2%維生素C的生理鹽水中)，每個點注射2 l。于術后1周、2周進行行為檢測，應用阿樸嗎啡(apomorphine,APO)腹腔注射(0.5 mg/kg)，觀察大鼠旋轉行為變化，觀測時間為1 h/次。規定大鼠恒定轉向左

7、側,身體環曲，首尾相接，360度為一轉(r)，且旋轉圈數>210 r/30 min,為成功PD大鼠模型,否則予以淘汰。將造模成功的PD大鼠20只隨機分為對照組、治療組各10只。    1.2.2  干預方法： 治療組給予rTMS治療，對照組予以假刺激。首先檢測靜息皮質閾值(relaxed threshold,RT)：用水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉深度掌握在輕刺激尾部鼠有輕微活動。使用Magstim 220型磁刺激儀和S90型圓形線圈，最大輸出磁場強度2.0 Tesla。線圈放在大腦半球，用同心圓針電極在下肢腓腸肌肌腹記錄對

8、側頭部刺激的誘發電位，單極針電極置于鼠尾作為接地電極。首先給予閾上強度刺激,記錄到波形、潛伏期基本恒定的運動誘發電位(MEP)后逐漸降低刺激強度,連續5次刺激至少引出3個峰峰波幅0.2 mV的最小刺激強度定為安靜狀態時的后肢RT3。將清醒的PD大鼠置于一長圓形器具中,頭部暴露，刺激部位為引出RT的位置。將線圈緊貼大鼠的前腦部皮膚進行閾上30%刺激(實際刺激強度為最大輸出強度的40%60%)，刺激頻率為0.5 Hz，連續20個刺激，每天治療1次，連續刺激2周。    1.3  效果評價  在治療前、治療結束后第1天、14天、28天分別測定APO誘

9、導的旋轉圈數、啟動潛伏期的變化。    1.3.1  旋轉圈數檢測： 應用APO腹腔注射(0.5 mg/kg)，計數開始旋轉后0.5h內的旋轉圈數，以每分鐘的旋轉圈數進行統計學分析。    1.3.2  啟動潛伏期的檢測： 采用僵住實驗，測試裝置為一垂直的柵欄，高44 cm，寬55 cm，每兩個水平橫桿間距為1 cm。測試時將大鼠放于柵欄之上，使其四爪均抓住橫桿，當大鼠抓牢后開始計時，大鼠左前爪子開始移動時停止計時，此時的時間稱為啟動潛伏期，以秒(s)為計數單位，每只鼠均測試5次，每次間隔5 min，取平均值進行統

10、計學分析。    1.4  統計學處理  采用SPSS 11.5軟件進行統計分析。計數資料以±s表示，不同時間比較采用配對t檢驗，組間比較采用t檢驗；啟動潛伏期2組間同一時間點比較因不符合正態分布，經均衡檢驗后采用符號秩和檢驗(wilcoxon配對法),P<0.05為差異有統計學意義。    2  結  果    2.1  APO誘導的旋轉圈數的比較  2組治療前比較差異無統計學意義(P0.05)；治療組治療結束后第1天旋轉圈數有

11、所下降，但與治療前比較，差異無統計學意義(P>0.05)；治療結束后第14天、28天旋轉圈數減少，與治療前、對照組同一時間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組各時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。表1  2組同一時間點旋轉圈數的比較 注：與治療前比較，P<0.05;與對照組比較，P<0.05    2.2  啟動潛伏期  治療前2組比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療組rTMS治療結束后第1天、第14天、第28天啟動潛伏期明顯縮短(P0.05)，與對照組同一時間點比較

12、差異有統計學意義(P<0.05)。對照組各時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。表2  2組不同時間點啟動潛伏期的比較注：與治療前比較，P<0.05;與對照組比較，P<0.05    3  討  論    與單次、成對磁刺激比較,rTMS可以對皮質興奮性產生較為持久的影響,并隨頻率和強度的改變而起不同的作用。高頻率rTMS(>5 Hz,有文獻報道為>1 Hz)可以提高皮質的興奮性,而低頻rTMS則抑制皮質的興奮性。    經顱

13、磁刺激技術盡管已應用到PD患者的診斷和治療，但研究結果并不一致。多數研究認為有不同程度的效果4，5，但Okabo等6用0.2 Hz,1.1皮質活動閾值，每次100個刺激，每周1次，共8周，與假刺激組相比，沒有發現rTMS的優勢。這可能因為臨床PD患者混雜因素多，且受藥物情緒的影響較大，故很難達到條件一致性。而本研究采用PD大鼠模型，通過運動誘發電位(TMSMEP)檢測運動皮質靜息閾值，并給予rTMS治療，彌補了以上不足。6OHDA PD模型是國際公認的PD動物模型，其行為檢測明顯,神經化學改變更接近人類PD。APO誘導的PD大鼠的旋轉圈數與黑質DA能神經元受損的程度呈正相關，旋轉圈數可以作為反

14、映PD大鼠黑質DA能神經元受損程度的指標。運動遲緩、起步困難是PD的一個典型癥狀，僵住實驗為一種可行的檢查手段。因此，我們利用這2個指標來判斷rTMS對PD模型大鼠行為的影響。    多數研究認為PD患者的皮質閾值降低，興奮性較正常人高，而低頻rTMS可以抑制皮質的興奮性。故本試驗選用頻率0.5Hz、閾上30%強度，每天一個序列，連續刺激2周的方法。結果顯示APO誘導的旋轉圈數治療組隨時間延長逐漸下降，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；大鼠患肢的啟動潛伏期治療組較對照組明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。說明低頻rTMS可以改善PD

15、的行為學，并延緩病情進展。Mally等7也有同樣的報道，他比較了單純藥物組與藥物加磁刺激治療組在藥量、癥狀的惡化等方面的差異。接受磁刺激(頻率1 Hz)治療者每年至少2次，每次7 d，連續3年，結果發現磁刺激治療組盡管治療之初病情重、左旋多巴用量大，但3年之后無病情惡化，且未發現不良作用；而單純藥物組不但左旋多巴的用量明顯增加，且病情明顯惡化。    rTMS作用機制：(1)可能通過調節兒茶酚胺的代謝而發揮作用。Ohnishi等8研究發現rTMS可影響腦內兒茶酚胺的代謝，促進同側內源性多巴胺釋放，使同側尾狀核周圍多巴胺增多，并可以抑制大腦內神經系統多巴胺的分解，進

16、而調節患側紋狀體蒼白球直接環路和間接環路的興奮性，改善運動障礙等臨床癥狀。(2)可能與神經營養因子的分泌有關。經過長時間rTMS刺激后，腦源性生長因子mRNA的表達在海馬、頂葉和梨狀區皮質明顯增高。在低頻rTMS刺激后，在海馬可以見到苔狀纖維芽生9。林宏等10等觀察到rTMS 14 d后SD大鼠蒼白球外側部和腹側蒼白球HMW MAP2染色明顯增強，纖維明顯增粗，推測rTMS可能通過樹突重塑導致突觸傳遞的變化而發揮其臨床作用。(3)可能與調節皮質的興奮性有關。【參考文獻】1 Thomas J,Wang J,Takuba H,et al.A 6OHDA induced selective Park

17、insonian rat model:further biochemical and behavioural characterizationJ.Exp Neurol,1994,126(2):159161.2 包新民,舒斯云.大鼠腦立體定向圖譜M.北京：人民衛生出版社,1991:4854.3 嚴莉,豐宏林,崔麗英.經顱重頻磁刺激對大鼠腦缺血再灌注損傷后運動皮質興奮性和神經功能的影響J.中國臨床康復,2006,10(18):7981.4 Siebner HR,Rossmeier C,Mentschel C,et al.Shortterm motor improvement after subth

18、reshold 5Hz repetitive transcranial magnetic stimulation of the primary motor hand area in Parkinson's diseaseJ.J Neurol Sci,2000,178(2):9194.5 Fregni F,Sontos CM,Myczkowski ML,et al.Repititive transcranial magnetic stimulation in Parkinson's diseaseJ.Neurol Neurosueg Psychiatry,2004,75(8):1

19、 1711 174.6 Okabo S,Ugawa Y,Kanazawa I.0.2Hz repetitive transcranial magnetic stimulation has no addon effects as compared to a realistic sham stimulation in Parkinson's diseaseJ.Mov Disord,2003,18(4):382388.7 Mally J,Farkas R,Tothfalusi L,et al.Longterm followup study with repetitive transcranial