1、SPE HPLC 法測定馬破傷風免疫球蛋白 F( ab) 2 中TritonX 100 殘 留 量白文莉1 ，高家敏2 ，余振喜2 *( 1. 昆明市食品藥品檢驗所，昆明 650032; 2. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)摘要 目的: 建立固相萃取高效液相色譜( SPE HPLC) 法測定馬破傷風免疫球蛋白 F( ab) 2 中滅活劑 Triton X 100 的殘留量。方法: 采用 Oasis 固相萃取小柱對樣品進行預處理，以 水 和 5% 甲 醇 為 淋 洗 劑，以甲醇為洗脫劑，收集甲醇洗脫物用于 1HPLC 分析。采用 ZOBAX Extend C18 色譜柱( 4. 6

2、 mm 150 mm，5 m) ，流動相為甲醇 水( 80 20) ，流速 1. 0 mLmin，檢測波長 230 nm，柱溫 30 ，進樣量 10 L。結果: Triton X 100 濃度在 0. 56 55. 34 gmL 1 范圍內，與峰面積線性關系良好( r = 0. 9998) ; 檢測限( S / N = 3) 為 2. 03 ng，定量限( S / N = 10) 為 4. 06 ng; 提取回收率為 91. 8% 。結論: 本方法操作簡便、準確、重復性好，可用于 Triton X 100 的殘留量測定。關鍵詞: 馬破傷風免疫球蛋白 F( ab) 2 ; Triton X 10

3、0; 滅活劑; 裂解劑; 辛基苯氧基聚 2 乙氧基乙醇; 雜質殘留檢測; 固相萃取; 高效液相色譜法中圖分類號: 917文獻標識碼: A文章編號: 0254 1793( 2014) 07 1251 05Determination of Triton X 100 residues in the equine antitetanusimmunoglobulin F( ab) 2 by SPE HPLCBAI Wen li1 ，GAO Jia min2 ，YU Zhen xi2*( 1 Kunming Institute for Food and Drug Control，Kunming 65003

4、2，China;2 National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China)AbstractObjective: To establish a SPE HPLC method for the determination of Triton X 100 residues in e-quine antitetanus immunoglobulin F( ab) 2 Methods: Samples were pre treated on Oasis HLB SPE column，thencleaned up by wat

5、er and 5% methanol，and finally extracted by methanol The analysis of extracts was performedon a ZOBAX Extend C18 column( 4. 6 mm 150 mm，5 m) with a mobile phase consisting of methanol water( 80 20，v / v) at a flow rate of 1. 0 mLmin 1 The column temperature was set at 30 and the injection volumewas

6、10 L Triton X 100 was detected at the wavelength of 230 nm with a DAD detection esults:The estab-lished HPLC method resulted in sharp and symmetric peaks of Triton X 100，whereas the calibration curve ofTriton X 100 displayed a good linearity within the concentration of 0. 56 55. 34 gmL 1 ( r = 0. 99

7、98 ) TheLOD and LOQ were 2. 03 ng and 4. 06 ng，respectively Specificity，precision，accuracy，stability and robustness wereacceptable The extraction recovery was 91. 8% Conclusion: The results indicate that the established method isconvenient，accurate and reproducible，which can be used in the analysis

8、of Triton X 100 residues in equine ant-itetanus immunoglobulin F( ab) 2 Key words: equine antitetanus immunoglobulin F( ab) 2 ; Triton X 100; inactivator ; split agent; octylphenoxypoly-ethoxyethanol; impurity residue detection; SPE; HPLCTriton X 100 是一種非離子型表面活性劑，其化學名稱為辛基苯氧基聚 2 乙氧基乙醇( octylphe-noxyp

9、olyethoxyethanol) 。Triton X 100 在 生 物 制 品中常作為滅活劑和裂解劑使用，本身具有一定的毒*通訊作者 Tel: E mail: yuzhx nicpbp org cn第一作者 Tel: E mail: baiwenli77 sina com藥物分析雜志 Chin J Pharm Anal 2014，34( 7) 1252 性1 3，必須在后續工藝中除去，并在最終產品中對其殘留量進行檢測。中國藥典 2010 年版 三 部 對 一 些產品中 Triton X 100 的殘留量作了明確規定4， 規定裂解劑殘 留

10、量 應 小 于 15. 0 g mL 1 ，但 尚 未 收載統一的方法對其進行測 定。 當 前 用 于 測 定 Triton X 100 含量的方法很多，如紫外分光光度 法5、熒光分 光 光 度 法6、化 學 發 光 法7 和 高 效 液 相色譜法8 11等。其中紫外、熒光和化學發光法的 選擇性低，因為其他共存的表面活性劑會對紫外、熒 光法的測定產生干擾，金屬離子的存在會對化學發 光法的測定產生干擾。液相色譜法有很好的分離能 力和較 高 的 選 擇 性，可 滿 足 不 同 樣 品 中 Triton X 100 含量的測定要求。但要測定馬破傷風免疫球蛋 白 F( ab) 2 中 Triton X

11、 100 的殘留量，在進行液相色譜分析前，必須采取合適的前處理方法純化樣品。本文先 采 用 固 相 萃 取 ( Solid Phase Extraction，簡 稱 SPE) 技術12 13純化樣品，再利用 HPLC 法對 Triton X 100 的殘留量進行測定，并進行了系統的方法學 考察，評價了 SPE 技術用于馬破傷風免疫球蛋白 F( ab) 2 樣品預處理的實用性。50 mg，精密稱定，置 50 mL 量瓶中，加甲醇 5 mL 振搖使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。2. 2. 2對照品溶 液 1分別精密量取對照品儲備 液適量，加甲醇稀釋制成 0. 5、2. 5、5. 0、10. 0

12、、25. 0、50. 0 gmL 1 的對照品溶液，即得。2. 2. 3對照品溶 液 2分別精密量取對照品儲備 液適量，加陰 性 樣 品 溶 液 ( 即 未 添 加 Triton X 100的馬破傷風免疫球蛋白 F ( ab) ) 稀 釋 制 成 1. 0、25. 0、10. 0、20. 0、50. 0、100. 0 g mL 1 的 對 照 品 溶液，即得。2. 2. 4供試品溶液 1精密量取未去除滅活劑的馬破傷風免疫球蛋白 F( ab) 2 1. 0 mL，置 100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻; 精密量取 10. 0 mL，置 100 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即

13、得。2. 2. 5供試品溶 液 2直接取去除滅活劑的馬破 傷風免疫球蛋白 F( ab) 2 。2. 3樣品預處理將 Oasis HLB 小柱依次用甲醇 1 mL 與水 1 mL沖洗進行活化平衡，備用。分別精密量取供試品溶液 1 和 2 以及對照品溶液 2 各 0. 5 mL，分置已活化 平衡的 Oasis HLB 小柱上，依次用水 1 mL 和 5% 甲 醇 1 mL 沖 洗 小 柱，待 溶 劑 滴 盡 后，精 密 量 取 甲 醇1. 0 mL 洗脫小柱，收集洗脫液，備用。1儀器與材料Aglient 1200 高 效 液 相 色 譜 儀，配 有 在 線 脫 氣機、四 元 泵、DAD 檢 測 器

14、、自 動 進 樣 器、柱 溫 箱 和Chemstations 工作站; Mettler AE 240 電 子 天 平; Wa-ters Oasis HLB SPE 小柱( N 乙烯基吡咯烷酮 二乙烯苯共聚物填料，1cc 30 mg) 。Triton X 100 對照品 ( 購 自 Sigma 公 司，批 號:118K0095) ; 未去除滅活劑的馬破傷風免疫球蛋白 F( ab) 2 、去除滅活劑的馬破傷風免疫球蛋白 F( ab) 2和未添加 Triton X 100 的馬破傷風免疫球 蛋 白 F( ab) 2 ( 均由玉溪九洲生物技術有限責任公司提供，蛋白濃度均 小 于 50 g L 1 )

15、; 甲 醇 為 色 譜 純，水 為超純水。2方法33. 1結果方法專屬性分別取甲醇和對照品溶液 1 中 5. 0 g mL 1的溶 液，照上述色譜條件，注 入 色 譜 儀，得 色 譜 圖1 A、C。分別 取 陰 性 樣 品 溶 液、對 照 品 溶 液 2 中 110. 0 gmL 的溶液和供試品溶液 1，按“2. 3 ”項下方法操作后，照上述色譜條件，注入色譜儀，得色譜圖 1 B、D、E。由 圖 1 可 知，Triton X 100 的 保 留時間約為 7. 1 min，甲醇溶劑和陰性樣品溶液在 Triton X 100 相應位置無色譜峰出現，對主峰無干 擾。供試品溶液 1 在 Triton

16、X 100 對 照 品 相 應 位 置有色譜峰出現，Triton X 100 峰與相鄰峰的分離 度大于 1. 5。對照品溶液 1 直接進樣測定與對照品 溶液 2 按“2. 3”項下方法操作后，進樣測定，色譜圖 無明顯差異。1. 1色譜條件色譜柱: ZOBAX Extend C18 柱( 4. 6 mm 150mm，5 m) ; 流 動 相: 甲 醇 水 ( 80 20 ) ; 流 速: 1. 0mLmin 1 ; 檢測波長: 230 nm; 柱溫: 30 ; 進樣量:10L。在 上述色譜條件 下，理 論 塔 板 數 按 TritonX 100 峰計 算 應 不 低 于 2500，Triton

17、X 100 峰 與相鄰峰之間的分離度應大于 1. 5。線性關系考察標準曲線 13. 23. 2. 1取 對 照 品 溶 液 1 中 的 各 濃 度溶液，照上述色譜條件，注入色譜儀，以進樣時濃度( 即對照品溶液的濃度) 為橫坐標 ( X) ，平均峰面積 為縱坐標( Y) 作回歸分析，得回歸方程為:1. 22. 2. 1溶液的制備對照品儲備液 取 Triton X 100 對照品約藥物分析雜志 Chin J Pharm Anal 2014，34( 7) 1253 Y = 6. 610X 0. 5519 r = 0. 9999( n = 6)結果表明，Triton X 100 進 樣 濃 度 在 0

18、. 51 55. 06gmL 1 范圍內，與峰面積線性關系良好。3. 2. 2標準曲線 2取 對 照 品 溶 液 2 中 的 各 濃 度溶液，按“2. 3”項 下 方 法 操 作，照上述色譜條件，注入色譜儀，以進樣時濃度( 即 SPE 處理后濃度) 為橫坐標( X) ，平均峰面積為縱坐標( Y) 作回歸分析，得回歸方程為:Y = 6. 218X 0. 8390 r = 0. 9998( n = 6)結 果 表 明， TritonX 100進 樣 濃 度 在0. 56 55. 34 gmL 1 范圍內，與峰面積線性關 系良好。3. 3檢測限與定量限取對照品溶液 1 中濃度約為 2. 5 g mL

19、 1 的 溶液，適當稀釋并進樣測定，當 信 噪 比 ( S / N ) 為 3 時，測得 檢 測 限 為 2. 03 ng; 當 信 噪 比 ( S / N ) 為 10 時，測得定量限為 4. 06 ng。3. 4準確度按“2. 2. 2”項下方法，配制濃度為 5、10、20 gmL 1 的對照品 溶 液。分別精密量取各濃度的對照 品溶液 5. 0 mL( n = 3) ，分置于錐形瓶中，揮干，精密加入陰性樣品溶液 5. 0mL，混合搖勻，按“2. 3”項下方法操作，進樣測定峰面積 A。3. 4. 1提取回收率 將上述測得的各峰面積 A，代入不經 SPE 處理所得的標準 曲 線 ( 即“3.

20、 2. 1 ”項 下的標準 曲 線 1 ) ，得 測 得 濃 度 1，計算得到提取回收 率，結果見表 1。表 1 提取回收率測定結果( n = )Tab 1 esults of extraction recovery平均回收率( average recovery)/ %添加濃度( added)/ gmL 1測得濃度 1( measured 2)/ gmL 1回收率( recovery)/ %SD/ %92. 30. 95. 4845. 09192. 85. 4845. 01191. 45. 4845. 08792. 810. 97910. 07391. 892. 81. 610. 97910.

21、 12492. 210. 97910. 36794. 4圖 1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogramsA. 甲醇溶劑( methanol solvent)B. 陰 性 樣 品 溶 液 ( negative samplesolution)C. 對照品溶液 1( reference solution 1 )D. 對照品溶液 2( reference solution 2) E. 供試品溶液 1( sample solution 1)21. 27719. 07689. 790. 22. 721. 27718. 74188. 121. 27719. 75192. 8藥物分析雜志

22、 Chin J Pharm Anal 2014，34( 7) 1254 3. 4. 2方法回收率 將上述測得的各峰面積 A，代3. 7. 2洗脫體積精密度測定 取對照品溶液 2 中濃度約為 10 gmL 1 的對照品溶液，按“2. 3”項下方法操作，取洗脫液精密稱定 ( n = 6 ) ，計 算 體 積 回收率為 101. 5% ，SD 為 0. 3% 。表明溶液過柱后的體積變化很小，直接進樣測定，可以滿足準確定量的要求。入經 SPE 處理所得的標準曲 線 ( 即“3. 2. 2 ”項 下 的標準曲線 2) ，得測得濃度 2，計算得到方法回收率，結果見表 2。表 2 方法回收率測定結果( n

23、= )Tab 2 esults of method recovery不同上樣量線性考察 取對照品溶液 2 中3. 7. 3添加濃度( added)/ gmL 1測得濃度 2( measured 2)/ gmL 1回收率( recovery)/ %平均回收率( average recovery)/ %SD/ % 1濃度約為 10 gmL的對照品溶液，分別向 OasisHLB 小柱進樣 0. 2、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0 mL，其他操作同“2. 3”項 下，進 樣 測 定。以不同的進樣體積為橫 坐標( X) ，峰面積為縱坐標( Y) 作回歸分析，得回歸方程為:Y = 63. 3054

24、X + 1. 4740 r = 0. 9996( n = 5)5. 4845. 504100. 499. 81. 15. 4845. 408398. 65. 4845. 498100. 3 1結果表 明，濃 度 約 為 10 g mL 樣 品 溶 液，使 用Oasis HLB 1cc 固相提取小柱時可以在 0. 2 2. 0 mL之間上樣。10. 97910. 79298. 499. 51. 610. 97910. 85598. 910. 97911. 113101. 23. 8樣品測定結果取對照品溶液 2 中濃度約為 10 gmL 1 的對21. 27720. 37195. 796. 32.

25、 7照品溶液、3 批供試品溶液 1 和 3 批供試品溶液 2，按“2. 3”項下方法操作，取洗脫液進樣測定，按外標法以峰面積計算。結果 3 批供試品溶液 1 中 TritonX 100 的殘留分別為 3. 64、3. 60、3. 53 mgmL 1 ，3 批供試品溶液 2 均未檢出 Triton X 100。21. 27720. 01194. 0 21. 277 21. 088 99. 1 3. 5精密度3. 5. 1儀器重復性 取對照品溶液 2 中濃度約為10 gmL 1 的對照品溶液，按“2. 3”項下方法操作后，連續進樣 5 次，峰面積的 SD( n = 5) 為 0. 61% ，表明儀

26、器精密度良好。44. 1討論色譜條件的選擇Triton X 100 的最大吸收波長為 225 nm，兼顧方法重復性 按“2. 2. 3 ”項下方法操作，平3. 5. 2考慮減少雜質和溶劑末端吸收的影響，選定 230 nm為檢測 波 長。比 較 甲 醇 水 ( 80 20 ) 和 乙 腈 水行配制 6 份濃度 約 為 10 g mL 1 的 對 照 品 溶 液，按“2. 3”項下方法操作，進樣測定，平均濃度( n = 6)為 9. 93 gmL 1 ，SD 為 1. 2% ，表明方法精密度良好。3. 6穩定性取對照品溶液 2 中濃度約為 10 gmL 1 的對 照品溶液，按“2. 3”項下方法操

27、作后，分別于 0、4、9、流 動 相 系 統5 8，結 果 發 現 甲 醇 水( 70 30 )( 80 20) 系統較 好。隨著柱溫的升高，保 留 時 間 減小，峰形變得尖銳，但為兼顧樣品溶液中 Triton X 100 與雜質的分離，選擇柱溫為 30 。4. 2色譜條件耐用性的考察按照已確定的色譜條件，柱溫在 25 35 ，流 速在 0. 8 1. 5 mLmin 1 范圍改變，甲醇 水的比 例在 86 14 74 26 之間改變，Triton X 100 色譜峰 峰形均較理想并能與相鄰峰良好分離。h 進 樣 測 定，峰 面 積 的 SD ( n = 6 )14、30、40為1. 6% ，

28、表明溶液在室溫下 40 h 內穩定。3. 7SPE 提取考察3. 7. 1SPE 小 柱 的 選 擇Triton X 100 在 反 相4. 3洗脫溶劑的選擇Triton X 100 易 溶 于 甲 醇，加 之 流 動 相 為 甲色譜填料上有較強保留 ，能溶于有機溶劑 ，比 較適 合 用 反 相 固相提取小柱進行提取 。 Waters Oa- sis HLB 1 cc 固 相 提 取 小 柱 ，規格較小但又能 實 行 較大濃度的樣品 制 備 ，并可直接降低洗脫劑的體 積 ，實現用洗脫劑直接進樣 ，減少再次濃縮的工 作 量 。醇 水( 80 20) ，所以選擇甲醇為洗脫溶劑。用 同一樣品考察了不

29、同比例甲醇的洗脫能力，結果 0% 、5% 、10% 、50% 甲醇未洗脫出 Triton X 100，80% 甲醇能部分洗脫出 Triton X 100，100% 甲醇洗脫能力較 80% 甲醇強。藥物分析雜志 Chin J Pharm Anal 2014，34( 7) 1255 5CHEN Ping( 陳平) ，LUO Shan( 羅珊) ，ZHONG Jing( 鐘靜) ，etal Verification of turbidimetric method for detection of residualTriton X 100 in vaccines( 比 濁法檢測疫苗中 Triton X

30、 100殘留量的方法學驗 證) J Chin J Biol( 中 國 生 物 制 品 學 雜志) ，2012，25( 12) : 1702ZHU Chang qing，ZHENG Hong，LI Dong hui，et al Near infrared hydrophobic probes as molecular light switch for CMCdetermination of Triton X 100 solutionJ Chin J Chem，2004，22( 11) : 1319LIU Xiao yu，LI Ai fang，ZHOU Bao hui，et al Chemilum

31、i-nescence determination of surfactant Triton X 100 in environ-mental water with luminol hydrogen peroxide systemJ ChemCent J，2009，3( 7) : 1LIU Jia( 劉佳) ，ZHANG Qing lin( 張慶林) ，BI Jian jin( 畢建進) ，et al Quantitative analysis of Triton X 100 in plasmidpUDKH by high performance liquid chromatography( 高

32、效 液 相色譜法測定質 粒 pUDKH 中 曲 拉 通 X 100 的 含 量) JChin J Biochem Pharm ( 中 國 生 化 藥 物 雜 志 ) ，2004 ，25 ( 4 ) :210DONG Jie( 董潔) ，PAN uo wen( 潘 若 文 ) ，FAN You dang( 范有黨) ，et al HPLC determination of Triton X 100 in( split，inactivated) influenza vaccine( 高 效 液 相 色 譜 法 測 定 流 感 病 毒裂解疫苗中 Triton X 100 的 含 量) J Chin

33、J Pharm Anal( 藥物分析雜志) ，2011，31( 11) : 2174SHAO Qiu xia( 邵秋霞) ，WANG Mo zheng( 王模正) ，CHENXiang song( 陳祥松) ，et al HPLC determination of Triton X 100 in fibrnogen( 應用液相色 譜法測定纖維中 Triton X 100含量) J Chin J Biol( 中國生物制品學雜志) ，2002，15 ( 1 ) :49YANG Peng yun ( 楊 鵬 云 ) ，CHENG Ya qin ( 程 雅 琴 ) De- termination of

34、 Triton X 100 in methods is established in plasmaproducts( 血漿制品中 Triton X 100 殘留量測定方法的建立)J Chin J Biol( 中國生物制品學雜志) ，2003，16( 4) : 235YANG Tie jin( 楊 鐵 金) Analytical Samples Pretreatment andSeparation Technologies( 分析樣品預處理 及 分 離 技 術) MBeijing( 北京 ) : Chemical Industry Press ( 化學工業出版社 ) ，2007: 289DENG Bo( 鄧勃) ，WANG Geng chen( 王庚辰) ，WANG Zheng fan( 汪正范) Analytical Instruments and Instrumental Analysis Con-spectus( 分析儀器與儀器分析概論) M Beijing( 北