1、定義微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查。 本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為 3035；霉菌、酵母菌培養溫度為 2328。 檢驗結果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。 檢查環境 微生物限度檢查環境在潔凈度C級下的局部潔凈度B級的單向流空氣區域內進行。微生物限度檢查室 要求 溫度：1826； 相對濕度：4565； 壓差：潔凈室與外界壓差30Pa 培養基 營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基 膽鹽乳糖培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基、 曙紅亞甲藍瓊脂培養基、營

2、養肉湯培養基、四硫磺酸鈉亮綠培養基、膽鹽硫乳瓊脂培養基 稀釋液和沖洗液 0.1%蛋白胨水溶液 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 0.9%氯化鈉溶液 供試品的保存 供試品在檢驗之前，應保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內污染菌因保存條件不妥引起致死或繁殖。 供試品在檢驗之前，應保持原包裝狀態，嚴禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品。實驗前的準備 以頭孢氨芐膠囊為例 1.在潔凈室使用記錄上登記好頭孢氨芐膠囊的規格、批號；準備一張微生物限度檢查空白記錄，填好除檢驗結果以及溫濕度外的其他必要信息。 2.準備好相應的檢查用品： 營養瓊脂培養基和玫瑰紅納瓊脂培養基各1瓶融化后，放入烤箱中待用 10

3、0mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 1瓶 9ml/管的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液4支 0.1%蛋白胨水溶液（500ml瓶） 濾杯 沉降菌平皿 空白平皿-吸管、鑷子、剪刀等放入不銹鋼盒中經干熱滅菌后待用 3.配置消毒液 0.1%潔爾滅溶液 75%乙醇傳遞窗物料微生物限度檢查室注注：進入無菌檢驗室的樣品若有兩層包裝的，需將外包裝在傳遞窗或緩沖間拆除后，經傳遞窗傳入實驗室。4.將待檢樣品以及的相關用品（包括培養基、緩沖液以及檢測用器皿等），經傳遞窗紫外消毒60分鐘后，再轉運至微生物限度檢查室。 5.按空調機組上的F2”鍵，開啟空調；通過物流通道處的按鈕，開啟凈化工作臺。 化驗人員按照進出微生物

4、檢測室更衣操作規程進行正確的更衣。 進入更鞋室更鞋脫去工作服及私人衣物（只剩貼身內衣、內褲）掛在衣鉤上并將所有頭發塞入發網中固定洗手用手肘開門進入一更。 然后取GEL溶液23ml，采用六步法對雙手和手腕進行消毒（在30秒內保持雙手完全被GEL覆蓋）用手肘開門進入C級二更（黃色地面）。 在二更更鞋，然后戴上綢帽，綢帽應包裹住全部頭發；再戴上口罩，口罩必須覆蓋嘴、鼻，在腦后勒緊；最后穿潔凈區連體工作服，依次將左腳、右腳、左手、右手穿入（過程中應避免碰觸潔凈衣外表面，同時潔凈衣也不得接觸地面或墻面）檢查自己的著裝用手肘開門進入C級緩沖間。 在C級緩沖間，用手肘開門分別進入C級微生物限度檢查室一和檢查

5、室二，帶上無菌手套，再在消毒液中浸泡約30秒。 化驗人員用浸泡了消毒液的無菌毛巾，擦拭凈化工作臺臺面。 打開傳遞窗，將相關的檢查用品依次擺放在不銹鋼桌上和凈化工作臺上。（鑷子和剪刀應插入75%酒精棉球中） 準備7個沉降菌平皿，做好標記和日期 在凈化工作臺上和檢查室地面上擺放好沉降菌平皿。 用消毒液清洗浸泡雙手，將消毒毛巾貼好，放在凈化工作臺臺面上。凈化工作臺2個檢查室地面2個操作者手指1個消毒液1個空白對照1個供試液的制備原則根據供試品的理化特性與生物學特性，采取適宜的方法制備供試液。所用乳化劑，分散劑、中和劑或滅活劑及其用量應證明是有效的，并對微生物無毒性。供試液的制備若需用水浴加溫時，溫度

6、不應超過45，時間不得超過30min常用的供試品制備方法 液體供試品 取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1：10的供試液。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。 固體、半固體或粘稠液供試品 稱取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1：10供試液。有必要時可適當加溫（不應超過45）。供試液的制備 取10g頭孢氨芐膠囊于磨口瓶中，用無菌剪刀將其剪碎，加入100mlpH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液混勻，作為1：10供試液。靜止得上清液備用。 在供試液靜止沉淀的同時準備8個無菌平皿，每2皿

7、為一組，分別在每組的2個平皿蓋上分別依次注明“0（空白）,10-1, 10-2, 10-3”。 準備3瓶膽鹽乳糖培養基，分別在瓶上注明”1-/2,1+/2, 0/2,其中2標示當月2號，1表示當天所做的第一個樣品、+：表示樣品陽性，-：表示樣品、0：表示陰性對照。細菌和控制菌檢查 薄膜過濾法 制備平皿 準備2個無菌平皿，傾注營養瓊脂培養基約15-20ml，半蓋蓋，除出去冷凝水后，蓋上平皿蓋待凝。 火焰噴射器在檢驗儀的過濾頭表面滅菌35秒鐘。 鑷子在火焰上滅菌并冷卻，夾住3張無菌濾膜放置在3個過濾頭中央。 將已經過滅菌的過濾杯小心安裝在過濾頭上。從過濾杯的上邊緣按下過濾杯卡在過濾頭上。在安裝濾杯

8、的時候，手不要接 觸濾杯的內部 預潤濾膜 將事先插在75%酒精棉球中的剪刀過火焰數次后，撬去沖洗液瓶子的鋁塑蓋和膠塞，將瓶口和瓶頸部位過火焰數次。 向3個過濾杯中，分別加入少量的0.1%無菌蛋白胨水溶液，順時針旋轉閥門手柄90度，打開過濾頭對應閥門。按下檢驗儀的啟停開關啟動儀器過濾。 過濾樣品 分別取10ml上清液（取相當于1g供試品），分別加入3個濾杯中過濾或先將10ml上清液加入100ml0.1%無菌蛋白胨水中混勻，再過濾。沖洗 用800ml0.1%無菌蛋白胨水分次沖洗過濾，每次約100ml，總沖洗量不得超過1000ml。每次沖洗時沖洗液瓶的瓶口和瓶頸部位應過火焰數次，每次沖洗時沖洗液瓶的

9、瓶口和瓶頸部位應過火焰數次，在過濾前后，應保持濾膜的完整性。在過濾前后，應保持濾膜的完整性。 樣品過濾完后，逆時針旋轉閥門手柄90度，關閉過濾頭對應閥門，然后按啟停開關停止儀器。 鑷子在火焰上滅菌并冷卻取出第一張濾膜，菌面朝上貼于制備好的培養基平板上。（濾膜貼于平板上時不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長）。 鑷子再次火焰上滅菌并冷卻分別取出第二張和第三張濾膜，快速接至100ml膽鹽乳糖培養基中，分別做為樣品和樣品陽性。 取10mlpH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液加入100ml膽鹽乳糖培養基中作為陰性對照。 再用火焰噴射器在滅菌檢驗儀的過濾頭 鑷子在火焰上滅菌并冷卻，夾住1張無菌濾膜放置在1個

10、過濾頭中央。 安裝過濾杯 用少量的0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，過濾。 取出濾膜，貼于培養基平板上做為陰性對照。酵母菌和霉菌的檢查平皿法樣品的稀釋10-210-110-3每遞增l稀釋級，必須另換一支吸管。稀釋時，吸管插入第1級稀釋液內不低于液面2.5cm，反復吸吹約10次。吸液時，應先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內壁調整液量至刻度，吸管移至第2級稀釋管的內壁近液面處（勿接觸液面）緩慢地放出全部供試液（吸管內應無黏附或殘留液體） 在上述進行10倍遞增稀釋的同時，以該稀釋級吸管，吸取該級稀釋液各1ml至2個滅菌平皿中，（一般為左手持平皿，將蓋半開，右手持吸管），注入平皿時，

11、將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內無殘留液體，防止反流到吸管尖端部。 陰性對照 待各級稀釋液注皿完畢后，用1支吸管吸取試驗用稀釋劑（pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液）各1ml，分別注入2個平皿中右手拿裝有培養基的錐形瓶，左手撥出棉塞。右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。用左手的拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中玫瑰紅瓊脂培養基倒入培養皿，以順時針或反時針方向快速旋轉平皿半蓋蓋，除出去冷凝水后，蓋上平皿蓋至操作臺上待凝傾注培養基注：混勻時切勿將培養基濺到皿邊及皿蓋上培養培養 將冷凝后的平板用保鮮膜包裹好，注明檢查日期。 倒置培養，細菌平板于3035培養箱中培養3天。霉菌、酵

12、母菌計數平板于2328培養箱中培養5天。逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數。 完成微生物限度檢查后，將待培養的樣品、廢棄物等通過傳遞窗傳出。 檢查人員對潔凈室進行清潔。 操作結束后 操作前 每周 每天清潔和消毒頻率 細菌數選取平均菌落數在30300之間的稀釋級。 霉菌、酵母菌數先取平均菌落數在30100之間的稀釋級。 因為超過300有凝聚作用，易計數偏低，且不易點計，低于30細菌分布不是正態分布，不能代表其正常計數，且數量減少，誤差增大。菌落報告原則菌落計數 一般將平皿置菌落計數器或從平皿的背面直接以肉眼點計，以透射光襯以暗色背景，仔細觀察。勿漏計細小的瓊脂層內和平皿邊緣生長的菌落。注意細菌菌落

13、與霉菌菌落和酵母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培養基沉淀物、氣泡等的區別。必要時用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。如仍難區別，可延長培養時間47天，細菌菌落常會生長增大而加以區別。菌落計數 若平板上有2個或2個以上菌落重疊，肉眼可辨別時仍以2個菌落或2個以上菌落計數；若平板生長有鏈狀菌落，菌落間無明顯界限，一條鏈作為一個菌落計，但若鏈上出現性狀與鏈狀菌落不同的可辨菌落時，仍應分別計數，若生長蔓延較大的片狀菌落或花斑樣菌落，一般不宜作為計數用。菌落報告原則菌落報告原則如只有1個稀釋級平均菌落數在30300（30-100）之間，則將該稀釋級的菌落乘以稀釋倍數報告。稀釋稀釋 菌落數菌

14、落數 平均值平均值 報告報告10 1 280 260 270 27010270010 2 29 28 10 3 3 2 當有當有2個或個或2個以上稀釋級的菌落數符合上述規定個以上稀釋級的菌落數符合上述規定時，以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告。時，以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告。如各稀釋級平均菌落數均在如各稀釋級平均菌落數均在30以下，則按最低稀釋級平均菌落數以下，則按最低稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告。乘以稀釋倍數報告。稀釋稀釋 菌落數菌落數 平均值平均值 報告報告10 1 10 12 11 1110 11010 2 2 3 10 3 1 3如各稀釋級的平均菌落數均無菌落生長或最低稀釋級平均落數小如各稀釋級的平均菌落數均無菌落生長或最低稀釋級平均落數小于于1小時，應報告菌數為小時，應報告菌數為1稀釋倍數個稀釋倍數個/g或或ml。結果報告 菌落數在100以內時，按實有數報告。 菌落數大于100時，取兩位有效數字報告，第三位按數值修約規則處理。 復試 供試品細菌數、霉菌數及酵母菌數其中任一項一次檢驗不合格，應重新取2倍包裝量供試品，依法作單項復試兩份，以三次檢驗結果的平均值報告。異常情況處理異常情況處理菌落蔓延1.加TTC（1000ml營養瓊脂加1的TTC(2、3、5氯化三苯四氮唑瓊氯化三苯四氮唑瓊脂脂 )1ml )2.開蓋干燥（將已凝固的營