1、精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業附件 2：化妝品中 32 種禁限用染料成分的檢測方法1 范圍本方法規定了測定染發類化妝品中 32 種禁限用染料成分（見附錄 A）的高效液相色譜法。本方法適用于染發類化妝品中 32 種禁限用染料成分的含量測定。本方法無法區分所涉及染料成分的游離態、硫酸鹽和鹽酸鹽，化妝品中各種形態同時存在時，應換算成一種形態，以總量表示。2 原理用無水乙醇+水=1+1 的混合溶液提取染發類化妝品中的 32 中禁限用染料成分，用高效液相色譜儀進行分析，以保留時間和紫外吸收光譜定性，峰面積定量。本方法中 32 種禁限用染料成分的檢出限、定量下限及取 0.5g 樣品時的檢出濃度

2、及最低定量濃度見表 1。表 1 32 種禁限用染料成分的檢出限、檢出濃度、定量下限、最低定量濃度序號 附錄 A 中編號物質名稱檢出限/ g檢出濃度/（g/g）定量下限/ g最低定量濃度/（g/g）131,5-萘二酚5.010-3201.510-260251-萘酚3.010-3121.010-240382,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl8.010-3322.510-21004102,6-二氨基吡啶1.510-26057-萘二酚3.010-3121氨基-3-羥基吡啶1.310-2524氯-p-苯二胺硫酸鹽1.510-2

3、605甲基雷瑣辛1.310-2524硝基-p-苯二胺5.010-3201.510-260精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業序號 附錄 A 中編號物質名稱檢出限/ g檢出濃度/（g/g）定量下限/ g最低定量濃度/（g/g）10314-氨基-2-羥基甲苯6.510-3262氨基-3-硝基苯酚6.510-3262氨基-m-甲酚8.010-3322.510-210013344-氯雷瑣辛5.010-3201.510-26014364-硝基-o-苯二胺1.510-2605.010-22

4、0015406-氨基-m-甲酚1.010-2403.010-212016426-羥基吲哚3.010-3121醌3.010-3121-氨基苯酚6.510-3262-苯二胺8.010-3322.510-21002072N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽2.510-21007.510-23002173N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽2.510-21007.510-23002274N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl2.010-2806-苯基-p-苯二胺2.510-3108.010-3

5、322481o-氨基苯酚6.510-3262-氨基苯酚6.510-3262基甲基吡唑啉酮2.010-2806-甲基氨基苯酚硫酸鹽1.010-2403-苯二胺1.210-2483.510-21402991間苯二酚8.010-3322.510-2100精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業序號 附錄 A 中編號物質名稱檢出限/ g檢出濃度/（g/g）定量下限/ g最低定量濃度/（g/g）3095甲苯-2,5-二胺硫酸鹽2.010-2806苯-3,4-二胺8.0

6、10-3322.510-210032OPDo-苯二胺8.010-3322.510-21003 試劑 除另有規定外，所用試劑均為分析純，水為超純水。3.1 無水乙醇。3.2 甲醇，色譜純。3.3 乙腈，色譜純。3.4 亞硫酸氫鈉。3.5 磷酸溶液（1+9）：吸取磷酸（20=1.69g/mL）10mL，加水 90mL。3.6 磷酸鹽混合溶液：稱取十二水合磷酸氫二鈉 1.8g、磷酸二氫鉀 2.8g 和庚烷磺酸鈉（C7H15SO3Na）1.0g，用水稀釋至 1L，混勻，配制成含庚烷磺酸鈉（1g/L）的磷酸鹽緩沖液，加入磷酸溶液（3.5） ，調節 pH 至 6.0 左右，0.45m 微孔濾膜過濾。3.7

7、 染料類化合物標準儲備溶液（染料成分）=10g/L）：稱取染料對照品約100mg（精確至 0.1mg）于 10mL 容量瓶中，以 2g/L 亞硫酸氫鈉水溶液 + 無水乙醇（3.1）=1+1 的混合溶液定容至 10mL，配成約 10g/L 的單標溶液。以下幾種物質在上述溶劑中的溶解性較差，分別采取如下措施：甲苯-2,5-二胺硫酸鹽和 2-氯-p-苯二胺硫酸鹽 2 種物質直接用 2g/L 亞硫酸氫鈉水溶液溶解并定容；甲苯-3,4-二胺直接用無水乙醇（3.1）定容；2-硝基-p-苯二胺和 4-硝基-o-苯二胺需將稱樣量減至 25mg，再用無水乙醇（3.1）定容，配成約2.5g/L 的單標溶液。儲備液

8、保存于 04冰箱中，最多使用 2 天。4 儀器和設備4.1 高效液相色譜儀，具有二極管陣列檢測器。4.2 pH 計。4.3 超聲波清洗器。4.4 離心機。精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業5 分析步驟5.1 樣品預處理樣品預處理稱取樣品約 0.5g（精確至 1mg）于 10mL 具塞比色管中，加無水乙醇（3.1）+ 水=1+1的混合溶液至刻度，超聲提取 15min。超聲過程中，若水溫高于 40應停置降溫，冷卻后繼續超聲，直至樣品溶液完全均一化。渾濁溶液可取適量高速離心，取上清液經 0.45m微孔濾膜過濾，濾液作為待測溶液，并盡快測定。5.2 測定測定5.2.1 色譜參考條件色譜柱：Su

9、pelco DISCOVERY RP-AMIDE C16柱（250mm4.6mm，5m）或等同柱；色譜保護柱：Supelco DISCOVERY RP-AMIDE C16保護柱（20mm4.0mm，5m）或等同柱；流動相 1：乙腈（3.3）+ 磷酸鹽混合溶液（3.6）=10 + 90；流動相 2：甲醇（3.2）+ 磷酸鹽混合溶液（3.6）=10 + 90；流動相 3：乙腈（3.3）+ 磷酸鹽混合溶液（3.6）=40 + 60；流量：1.0mL/min；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：280nm；柱溫：25。5.2.2 校準曲線的制備參照色譜圖 1色譜圖 3，對 32 種禁限用染料成分進行分

10、組，并根據分組情況，分別移取適量染料類化合物標準儲備溶液（3.7）于 10mL 容量瓶中，用無水乙醇（3.1）稀釋至刻度，配成 500mg/L 的混合標準溶液。各取混合標準溶液適量，用無水乙醇（3.1）稀釋，配成 10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L 共 6 個濃度的混合標準系列。標準系列應于使用前配制。取各標準系列 5L 注入高效液相色譜儀，分別采用 3 種流動相進行分析，記錄各色譜峰面積，繪制校準曲線。32 種禁限用染料成分在流動相 1 和流動相 2 中的保留時間參考附錄 B。5.2.3 樣品測定 在設定色譜條件下，取待測溶液 5L 注入

11、高效液相色譜儀，分別采用 3 種流動相體系精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業進行分析。色譜圖檢出的物質，經與該物質對照品的保留時間和紫外光譜圖比較確證后，根據峰面積，從校準曲線上查得相應組分的質量濃度。若待測溶液中染料成分的質量濃度超過了校準曲線線性范圍的上限，需對待測溶液進行適當稀釋。注：實際操作過程中，可參考附錄 B 中 32 種禁限用染料成分在流動相 1 和流動相 2 中的保留時間，并結合色譜分離情況和樣品中染料成分的不同，對 32 種染料成分進行合理分組，使各染料成分獲得完全分離。6 平行實驗 按以上步驟，做兩份樣品的平行測定。在重復性條件下獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不大

12、于這兩次測定值的算術平均值的 10%。7 結果計算 D Vw（染料成分）= 100 （1） m 106式中：w（染料成分） 染發類化妝品中染料成分的質量分數，%； 從校準曲線上查得的待測樣液中染料成分的質量濃度，mg/L；V 樣品定容體積，mL；m 樣品取樣量，g；D 稀釋倍數（不稀釋則取 1） 。8 回收率和精密度32 種禁限用染料成分的提取回收率在 82% 115%之間，方法回收率在 86% 114%之間，相對標準偏差在 1.1% 9.9%之間。9 色譜圖精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業min0510152025mAU050100150200 DAD1 D, Sig=280,8

13、Ref=off (RFJ20110808RFJ20110808 2011-08-08 09-06-15RFJ00007.D) 3.808 4.958 5.471 6.213 6.694 7.268 8.391 9.166 10.848 11.149 13.547 14.072 16.359 17.915 21.117 24.136 25.506圖 1 第一組染料混合標準溶液色譜圖，流動相 11：p-苯二胺；2：p-氨基苯酚；3：甲苯-2,5-二胺硫酸鹽；4：m-氨基苯酚；5：o-苯二胺；6：2-氯-p-苯二胺硫酸鹽；7：o-氨基苯酚；8：間苯二酚；9：2-硝基-p-苯二胺；10：甲苯-3,4-

14、二胺；11：4-氨基-2-羥基甲苯；12：2-甲基雷瑣辛；13：6-氨基-m-甲酚；14：苯基甲基吡唑啉酮；15： N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl；16：4-氨基-3-硝基苯酚min05101520253035mAU01020304050 DAD1 E, Sig=280,16 Ref=off (RFJ20110713RFJ20110712 2011-07-13 14-25-18RFJ00026.D) 5.710 7.296 8.745 10.217 11.447 12.618 15.010 22.369 23.385圖 2 第二組染料混合標準溶液色譜圖，流動相 21：m-苯二胺；2：

15、2,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl；3：氫醌；4：4-氨基-m-甲酚；5：2-氨基-3-羥基吡啶；6：N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽；7：p-甲基氨基苯酚硫酸鹽；8：4-硝基-o-苯二胺；9：2,6-二氨基吡啶；10：N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業min02.557.51012.51517.52022.5mAU024681012 DAD1 E, Sig=280,8 Ref=off (RFJ20110801RFJ20110801 2011-08-01 10-55-31RFJ00021.D) 4.012 5.361 6.454 7.482 8.

16、589 11.781 12.541 22.142圖 3 第三組染料混合標準溶液色譜圖，流動相 31：N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl；2：苯基甲基吡唑啉酮；3：6-羥基吲哚；4：4-氯雷瑣辛；5：2,7-萘二酚；6：N-苯基-p-苯二胺；7：1,5-萘二酚；8：1-萘酚精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業附錄 A32 種禁限用染料成分信息表編號INCI 名中文名稱31,5-Naphthalenediol1,5-萘二酚51-Naphthol1-萘酚82,4-Diaminophenoxyethanol HCl2,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl102,6-diaminopyridine2

17、,6-二氨基吡啶132,7-Naphthalenediol2,7-萘二酚152-amino-3-hydroxypyridine2-氨基-3-羥基吡啶212-Chloro-p-phenylenediamine sulfate2-氯-p-苯二胺硫酸鹽242-Methylresorcinol2-甲基雷瑣辛252-Nitro-p-phenylenediamine2-硝基-p-苯二胺314-Amino-2-hydroxytoluene4-氨基-2-羥基甲苯324-Amino-3-nitrophenol4-氨基-3-硝基苯酚334-Amino-m-cresol4-氨基-m-甲酚344-Chlororeso

18、rcinol4-氯雷瑣辛364-Nitro-o-phenylenediamine4-硝基-o-苯二胺406-Amino-m-cresol6-氨基-m-甲酚426-Hydroxyindole6-羥基吲哚61Hydroquinone氫醌67m-Aminophenolm-氨基苯酚70m-Phenylenediaminem-苯二胺72N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-p- phenylenediamine sulfateN,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽73N,N-Diethyl-p-phenylenediamine sulfateN,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽74N,N-Di

19、ethyltoluene-2,5-diamine HClN,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl78N-Phenyl-p-phenylenediamineN-苯基-p-苯二胺81o-Aminophenolo-氨基苯酚83p-Aminophenolp-氨基苯酚85Phenyl methyl pyrazolone苯基甲基吡唑啉酮精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業編號INCI 名中文名稱87p-Methylaminophenol sulfatep-甲基氨基苯酚硫酸鹽88p-Phenylenediaminep-苯二胺91Resorcinol間苯二酚95Toluene-2,5-diamine s

20、ulfate甲苯-2,5-二胺硫酸鹽96Toluene-3,4-diamine甲苯-3,4-二胺OPDo-Phenylenediamineo-苯二胺精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業附錄 B32 種禁限用染料成分在流動相 1 和流動相 2 中的保留時間參考數據表保留時間/ min出峰順序附錄 A 中編號物質名稱流動相 1流動相 2188p-苯二胺5.0496.163282,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl5.0847.176370m-苯二胺5.2445.681483p-氨基苯酚5.5877.1335152-氨基-3-羥基吡啶6.39611.125695甲苯-2,5-二胺硫酸鹽6.4408.

21、750772N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽6.72212.067867m-氨基苯酚6.7877.4569334-氨基-m-甲酚7.3410.0371061氫醌7.3388.63911OPDo-苯二胺7.4098.15612212-氯-p-苯二胺硫酸鹽8.61910.0761381o-氨基苯酚9.34510.5561487p-甲基氨基苯酚硫酸鹽9.54914.93115102,6-二氨基吡啶10.72423.231691間苯二酚11.16513.33617252-硝基-p-苯二胺11.52713.2901896甲苯-3,4-二胺14.24518.76519314-氨基-2-羥基甲苯1

22、4.86320.54220242-甲基雷瑣辛16.58219.7652173N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽16.77534.27722406-氨基-m-甲酚18.59626.69623364-硝基-o-苯二胺19.97722.0542485苯基甲基吡唑啉酮22.17633.7942574N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl26.43850精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業出峰順序附錄 A 中編號物質名稱保留時間/ min流動相 1流動相 226324-氨基-3-硝基苯酚26.80734.85427426-羥基吲哚35.05643.50428344-氯雷瑣辛48.193502913

23、2,7-萘二酚50503078N-苯基-p-苯二胺50503131,5-萘二酚50503251-萘酚5050精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業化妝品中 32 種禁限用染料成分的檢測方法編制說明1 任務來源受國家食品藥品監督管理局保健食品化妝品監管司委托，根據食藥監許函2011126 號關于委托組織開展化妝品中 m-苯二胺等八種禁用物質或限用物質檢測方法標準研究的函和食藥監許函2011262 號關于委托開展化妝品中 24 種染發劑的檢測方法研究的函 ，開展化妝品中 32 種禁限用染料成分檢測方法研究，建立染發類化妝品中多種染料成分的快速、準確、靈敏的色譜檢測方法。2 研究背景染發作為美容

24、方式之一，已經成為一種世界流行的時尚。在英國，染發劑的消費增長率已經連續 8 年高居生活必需品之首。染發劑可分為氧化型（永久性）染發劑、直接型（暫時性或半永久性）染發劑、金屬鹽類染發劑、天然植物型染發劑等。其中的氧化型染發劑以其染色效果好、維持時間長等諸多優點在歐洲和美國占到市場分額的 80%。染發劑中的染料成分多屬于芳香胺類化合物，芳香胺中有很多物質具有致癌性，所以染發劑的安全性一直受到人們的極大關注。在我國，消費人群也不斷擴大，由于大面積使用染發劑的時間并不長，目前染發劑引起的各種健康問題并沒有引起人們的足夠重視，但是染發人群出現低齡化，意味著人們染發的時間可能越來越長，而染發劑的各種隱性

25、危害很可能在今后幾年內突出地顯現出來。由染發劑引起的過敏反應非常普遍，長期使用還可能致畸、致突變及引起內分泌效應等。鑒于染發劑存在的各種安全問題及數目龐大的接觸者和使用者，加強對染發劑的衛生管理和日常監督非常必要。鑒于染發劑存在的各種安全隱患，我國化妝品衛生規范 （2007 年版）規定了 93 種暫時允許使用的染發劑，并明確了化妝品中最大允許使用濃度和各種限制條件。但是，目前只能對 8 種染料成分進行檢測，覆蓋率不到 1%。因此急需建立化妝品中更多染料成分的檢測方法，以滿足監督檢測的需求。3 研究現狀針對種類繁多的染料成分，各國科學家一直積極地研究新方法以適應不斷增加的新型染發劑的檢測要求。由

26、于氧化型染發劑所占的份額最大，研究人員將重點放在這一領域，精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業只有少數文獻報道了直接型染發劑的檢測方法研究。文獻中報道使用的儀器種類很多，有薄層色譜（TLC） 、高效液相色譜（HPLC） 、高效液相色譜質譜聯用技術（HPLC/MS） 、氣相色譜（GC） 、氣相色譜質譜聯用技術（GC/MS） 、毛細管電泳（CE）等。在我國， 化妝品衛生規范 （2007 年版）中列出了 93 種染發劑原料名單，但只推薦了其中 8 種染料成分的檢測方法，存在著大量的檢測空白，急需建立相應的方法。根據染料的結構及性質，液相色譜是比較合適的檢測手段。本項目擬采用高效液相色譜法，開展

27、化妝品中 32 種禁限用染料成分的檢測方法研究，建立染發劑中多種染料成分的快速、準確、靈敏的色譜檢測方法，為衛生監管提供良好的技術支持。4 項目完成情況 根據食藥監許函2011126 號關于委托組織開展化妝品中 m-苯二胺等八種禁用物質或限用物質檢測方法標準研究的函和開展化妝品中 m-苯二胺等 8 種禁限用染料成分檢測方法標準研究項目委托協議書的要求，按期完成 8 種禁限用染料成分的檢測方法，并按食藥監許函2011262 號關于委托開展化妝品中 24 種染發劑的檢測方法研究的函的要求，同時提交另外 24 種染料成分的檢測方法，具體情況如下： （1）建立了化妝品中 32 種禁限用染料成分的高效液

28、相色譜檢測方法。本項目中 32 種禁限用染料成分的方法檢出限小于 100g/g，提取回收率在 82%115%之間，方法回收率在 86%114%之間，相對標準偏差在 1.1% 9.9%之間，在 5mg/L500mg/L 的濃度范圍內線性關系良好（r0.998） ，基本滿足分析檢測要求。 （2）本方法負責起草單位為中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所，參與驗證單位分別是北京市疾病預防控制中心、廣東省疾病預防控制中心、上海市疾病預防控制中心和山東省疾病預防控制中心。本方法主要起草人為朱英、朱會卷、楊艷偉，參加起草人為吳大南、魯琳、李金花、李蔚、鐘志雄、張昀、陳金東、聶鯤。驗證結果滿足化妝品及

29、其原料中禁限用物質檢測方法驗證技術規范相關要求。5 方法概述5.1 儀器Agilent 公司 Agilent1100 高效液相色譜儀。超聲波清洗器。離心機。5.2 試劑精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業染料標準品：p-苯二胺、p-氨基苯酚、甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、m-氨基苯酚、o-苯二胺、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、o-氨基苯酚、間苯二酚、2-硝基-p-苯二胺、甲苯-3,4-二胺、4-氨基-2-羥基甲苯、2-甲基雷鎖辛、6-氨基-m-甲酚、苯基甲基吡唑啉酮、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺HCl、4-氨基-3-硝基苯酚、6-羥基吲哚、4-氯雷瑣辛、2,7-萘二酚、1,5-萘二酚、N-苯

30、基-p-苯二胺、1-萘酚、m-苯二胺、氫醌、4-氨基-m-甲酚、2-氨基-3-羥基吡啶、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、p-甲基氨基苯酚硫酸鹽、2,6-二氨基吡啶、4-硝基-o-苯二胺、N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽、2,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl 共 32 種染料對照品（除 2,4-二氨基苯氧基乙醇HCl 由化妝品公司提供外，其余 31 種均購于美國 SIGMA 公司和日本東京化成公司，純度95%） ；無水乙醇、磷酸、氨水、亞硫酸氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀為分析純，均購于北京化學試劑公司；乙腈和甲醇為色譜純，購于 Fisher 公司；庚烷磺酸鈉為色譜純，購于美國 T

31、echnologies 公司。5.3 方法5.3.1 色譜條件色譜柱：Supelco DISCOVERY RP-AMIDE C16柱，250 mm 4.6 mm，5m。色譜保護柱：Supelco DISCOVERY RP-AMIDE C16保護柱，20 mm 4.0 mm，5 m。磷酸鹽混合溶液：稱取十二水合磷酸氫二鈉 1.8g、磷酸二氫鉀 2.8g 和庚烷磺酸鈉（C7H15SO3Na）1.0g，用水稀釋至 1L，混勻，配制成含庚烷磺酸鈉（1g/L）的磷酸鹽緩沖液，加入磷酸溶液（1+9）調節 pH 至 6.0 左右，0.45m 微孔濾膜過濾，作為磷酸鹽體系。流動相 1：乙腈+磷酸鹽混合溶液=1

32、0+90；流動相 2：甲醇+磷酸鹽混合溶液=10+90，流動相 3：乙腈+磷酸鹽混合溶液=40+60。流量：1.0 mL/min。檢測器：二極管陣列檢測器，檢測波長為 280 nm。柱溫：25。5.3.2 標準溶液的配制染料成分標準儲備溶液（染料組分）=10g/L）：稱取染料對照品約 100mg（精確至0.1mg）于 10mL 容量瓶中，以 2g/L 亞硫酸氫鈉水溶液 + 無水乙醇 = 1 + 1 的混合溶液定容至 10mL，配成約 10g/L 的單標溶液。以下幾種物質在上述溶劑中的溶解性較差，分別采取如下措施：甲苯-2,5-二胺硫酸鹽和 2-氯-p-苯二胺硫酸鹽 2 種物質直接用 2g/L

33、亞硫酸氫鈉水溶液溶解并定容；甲苯-3,4-二胺直接用無水乙醇定容；2-硝基-p-苯二胺和 4-硝基-o-苯二胺需將稱樣量減至 25mg，再用無水乙醇定容，配成約 2.5g/L 的單標溶液。儲備溶液保存于精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業4冰箱中，最多使用 2 天。根據實際情況進行分組后，分別移取染料標準儲備溶液于 10mL 容量瓶中，再用無水乙醇稀釋至刻度，配成 500mg/L 的混合標準溶液。各取適量混合標準溶液，用無水乙醇稀釋成 5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L 共 6 個濃度的混合標準系列。標準系列應于使用前配制。取各標準系列

34、 5 L 注入高效液相色譜儀，記錄各色譜峰面積，繪制校準曲線。5.3.3 樣品預處理稱取樣品約 0.5g（精確至 1mg）于 10mL 容量瓶中，用無水乙醇 + 水 = 1 + 1 的混合溶液定容至 10mL，超聲提取 15min。超聲過程中，若水溫高于 40度應停置降溫，冷卻后繼續超聲，直至樣品溶液完全均一化。渾濁溶液可取適量高速離心 5min。上清液經0.45m 濾膜過濾，濾液作為待測樣液備用并盡快測定。若待測樣液中染料成分的質量濃度超過了線性范圍的上限，需對待測樣液進行適當稀釋。5.3.4 結果計算 根據峰面積，于校準曲線分別得出待測樣液中染料成分的質量濃度，樣品中的含量應在此濃度上乘稀

35、釋倍數。6 方法研究6.1 色譜柱的選擇根據染料成分的結構性質及文獻查閱結果，選擇流動相 1，并考察了 ODS-2 HYPERSIL C18、ZORBAX SB C8 和 DISCOVERY RP-AMIDE C16 3 種色譜柱，結果分別見圖 1、圖 2 和圖 3。 實驗結果表明，使用 ODS-2 HYPERSIL 柱時峰形大多不規則，使用 ZORBAX SB C8 柱時有部分物質峰形較差，使用 DISCOVERY RP-AMIDE C16柱時多數物質的峰形都能得到較好地改善。這是因為 DISCOVERY RP-AMIDE C16柱中含有酰胺結構，適宜分離胺類化合物，故選擇DISCOVERY

36、 RP-AMIDE C16柱作為分析柱。精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業 min01020304050mAU020406080100120140 DAD1 B, Sig=254,16 Ref=off (D:公 公 公 1ZZDATAZZ0107-1002-0201.D) 2.076 2.430 2.663 2.966 3.043 3.091 3.388 4.186 5.107 5.304 5.824 6.905 7.613 9.298 9.812 11.535 15.023 15.614 16.553 19.647 22.309 22.930 32.924 37.010圖 1 部分染

37、料混合標準溶液的液相色譜圖，ODS-2 HYPERSIL 色譜柱min0510152025mAU050100150200 DAD1 D, Sig=280,8 Ref=off (RFJ20110909RFJ20110909 2011-09-09 10-07-36RFJ00007.D) 2.721 3.228 3.395 3.721 5.698 5.882 6.997 7.670 8.321 10.335 11.760 13.021 13.865 16.207 19.407 20.794 23.379 24.406圖 2 部分染料混合標準溶液的液相色譜圖，ZORBAX SB C8色譜柱 min01

38、02030405060mAU-20020406080100120140 DAD1 C, Sig=280,8 Ref=360,100 (D:公 公 公 1ZZDATAZZ70210ZZ000007.D) 4.584 6.618 8.325 23.509 31.820圖 3 部分染料混合標準溶液的液相色譜圖，DISCOVERY RP-AMIDE C16色譜柱6.2 檢測波長的選擇根據單標的紫外光譜圖，統計了各種染料成分在不同檢測波長下特征吸收的分布情況。精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業實驗結果表明，32 種染料類化合物在 220nm 242nm 和 270nm 310nm 均有特征吸收，

39、可選擇 230nm、280nm 為通用檢測波長，但 280nm 處的吸收低于 230nm。考慮到 280nm 的抗干擾能力較 230nm 強，且該波長下的檢出限完全能夠滿足檢測要求，故選擇 280nm 作為統一檢測波長。6.3 流動相的選擇6.3.1 水相的選擇根據文獻查閱結果，分別試驗了乙腈+磷酸鹽體系和甲醇+醋酸鹽體系。實驗結果顯示，磷酸鹽體系峰形及分離效果較好，后者分離尚可，峰形稍差，故確定乙腈+磷酸鹽體系=10+90 為流動相體系。在以上流動相體系的基礎上對水相中的對離子試劑濃度及 pH 值進行了進一步優化。通過在磷酸鹽體系中加入 0g/L 1.5g/L 的庚烷磺酸鈉及改變 pH 來優

40、化流動相體系。結果發現，不加庚烷磺酸鈉時，峰形稍有拖尾，加入后有較好改善，加入量為 1.0g/L 1.5g/L 時效果均較好，確定 1.0g/L 為最佳濃度。當流動相 pH 值為 5 時，峰形稍有不規則，pH 值為 6和 7 時均較好，考慮到該色譜柱最高允許使用 pH 值為 7.5，故最后確定的 pH 值為 6。6.3.2 有機相的選擇由于染料種類多，單獨用乙腈+磷酸鹽一套體系難以完全分離，有些物質會重疊出峰，所以同時選擇了洗脫能力不同的另一種有機相甲醇和磷酸鹽的混合體系，二者結合進行分離。32 種染料成分在流動相 1 和流動相 2 中的分離情況見表 1。表 1 32 種染料成分在流動相 1

41、和流動相 2 中的保留時間分布情況保留時間/ min出峰順序附錄 A 中編號物質名稱流動相 1流動相 2188p-苯二胺5.0496.163282,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl5.0847.176370m-苯二胺5.2445.681483p-氨基苯酚5.5877.1335152-氨基-3-羥基吡啶6.39611.125695甲苯-2,5-二胺硫酸鹽6.4408.750772N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽6.72212.067867m-氨基苯酚6.7877.4569334-氨基-m-甲酚7.3410.0371061氫醌7.3388.63911OPDo-苯二胺7.4098.156122

42、12-氯-p-苯二胺硫酸鹽8.61910.0761381o-氨基苯酚9.34510.5561487p-甲基氨基苯酚硫酸鹽9.54914.931精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業出峰順序附錄 A 中編號物質名稱保留時間/ min流動相 1流動相 215102,6-二氨基吡啶10.72423.231691間苯二酚11.16513.33617252-硝基-p-苯二胺11.52713.2901896甲苯-3,4-二胺14.24518.76519314-氨基-2-羥基甲苯14.86320.54220242-甲基雷瑣辛16.58219.7652173N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽16.77534

43、.27722406-氨基-m-甲酚18.59626.69623364-硝基-o-苯二胺19.97722.0542485苯基甲基吡唑啉酮22.17633.7942574N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺HCl26.4385026324-氨基-3-硝基苯酚26.80734.85427426-羥基吲哚35.05643.50428344-氯雷瑣辛48.1935029132,7-萘二酚50503078N-苯基-p-苯二胺50503131,5-萘二酚50503251-萘酚5050由以上結果可知，由于乙腈和甲醇的洗脫能力不同，二者結合基本上能分離所有的 32種染料成分，但是其中的 6-羥基吲哚、4-氯雷瑣辛、

44、2,7-萘二酚、1,5-萘二酚、N-苯基-p-苯二胺和 1-萘酚 6 種成分由于保留時間太長，效率低，不可取。故在此基礎上進一步試驗了3 種有機相比例更高的流動相體系以進一步提高上述 6 種成分的洗脫能力，結果見表 2。表 2 6 種染料化合物在不同流動相體系中保留時間的分布情況保留時間/min出峰順序物質名稱乙腈+磷酸鹽體系=50+50乙腈+磷酸鹽體系=40+60乙腈+磷酸鹽體=35+6516-羥基吲哚4.5545.8666.91424-氯雷瑣辛4.8466.4117.92232,7-萘二酚5.2137.3759.52141,5-萘二酚6.46410.08114.1085N-苯基-p-苯二胺

45、6.50510.36014.57661-萘酚9.73718.52327.991由表 2 可知，磷酸鹽的體積分數降低至 60%65%時，能較好地分離上述 6 種成分，且體積分數在 65%時其他成分在短時間內出峰完全，不干擾上述 6 種成分的測定。所以當樣品中含有這 6 種成分時可采用此方法以縮短出峰時間。如果繼續降低磷酸鹽的體積分數，雖然可以進一步縮短保留時間，但會有部分成分達不到基線分離。苯基甲基吡唑啉酮在流動相體系 1 中峰寬較大，N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl 有時與 4-氨基-3-硝基苯酚不能完全分離，故將這 2 種物質也可以加到這 6 種成分中，此時 8 種成分能達到基線分離

46、。精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業根據以上數據，將 32 種染料類化合物分為三組：第一組使用流動相 1，第二組用流動相 2，第三組用流動相 3，具體分組情況見表 3、表 4 和表 5，三組的色譜圖見圖 4、圖 5、圖 6。表 3 第一組所含染料成分出峰順序物質名稱出峰順序物質名稱1p-苯二胺92-硝基-p-苯二胺2p-氨基苯酚10甲苯-3,4-二胺3甲苯-2,5-二胺硫酸鹽114-氨基-2-羥基甲苯4m-氨基苯酚122-甲基雷瑣辛5o-苯二胺136-氨基-m-甲酚62-氯-p-苯二胺硫酸鹽14苯基甲基吡唑啉酮7o-氨基苯酚15N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl8間苯二酚164-

47、氨基-3-硝基苯酚表 4 第二組所含染料成分出峰順序物質名稱出峰順序物質名稱1m-苯二胺6N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽22,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl7p-甲基氨基苯酚硫酸鹽3氫醌84-硝基-o-苯二胺44-氨基-m-甲酚92,6-二氨基吡啶52-氨基-3-羥基吡啶10N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽表 5 第三組所含染料成分出峰順序物質名稱出峰順序物質名稱1N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl52,7-萘二酚2苯基甲基吡唑啉酮6N-苯基-p-苯二胺36-羥基吲哚71,5-萘二酚44-氯雷瑣辛81-萘酚min0510152025mAU050100150200 DAD1 D,

48、 Sig=280,8 Ref=off (RFJ20110808RFJ20110808 2011-08-08 09-06-15RFJ00007.D) 3.808 4.958 5.471 6.213 6.694 7.268 8.391 9.166 10.848 11.149 13.547 14.072 16.359 17.915 21.117 24.136 25.506圖 4 第一組染料混合標準溶液色譜圖，流動相 11：p-苯二胺；2：p-氨基苯酚；3：甲苯-2,5-二胺硫酸鹽；4：m-氨基苯酚；5：o-苯二胺；6：2-氯-p-苯精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業二胺硫酸鹽；7：o-氨基苯

49、酚；8：間苯二酚；9：2-硝基-p-苯二胺；10：甲苯-3,4-二胺；11：4-氨基-2-羥基甲苯；12：2-甲基雷瑣辛；13：6-氨基-m-甲酚；14：苯基甲基吡唑啉酮；15：N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl；16：4-氨基-3-硝基苯酚min05101520253035mAU01020304050 DAD1 E, Sig=280,16 Ref=off (RFJ20110713RFJ20110712 2011-07-13 14-25-18RFJ00026.D) 5.710 7.296 8.745 10.217 11.447 12.618 15.010 22.369 23.385 Ar

50、ea: 124.096 34.325圖 5 第二組染料混合標準溶液色譜圖，流動相 21：m-苯二胺；2：2,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl；3：氫醌；4：4-氨基-m-甲酚；5：2-氨基-3-羥基吡啶；6：N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽；7：p-甲基氨基苯酚硫酸鹽；8：4-硝基-o-苯二胺；9：2,6-二氨基吡啶；10：N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽min02.557.51012.51517.52022.5mAU024681012 DAD1 E, Sig=280,8 Ref=off (RFJ20110801RFJ20110801 2011-08-01 10-55-31RFJ0002

51、1.D) 4.012 5.361 6.454 7.482 8.589 11.781 12.541 22.142圖 6 第三組染料混合標準溶液色譜圖，流動相 31：N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl；2：苯基甲基吡唑啉酮；3：6-羥基吲哚；4：4-氯雷瑣辛；5：2,7-萘二酚；6：N-苯基-p-苯二胺；7：1,5-萘二酚；8：1-萘酚6.4 線性范圍及檢出限結合樣品中染料成分的實際加入量和樣品稱樣量，本研究確定最高配制濃度為500mg/L，最低配制濃度為 5mg/L，這一范圍完全滿足實驗要求。分別配制 5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L 和 500mg/

52、L 共 5 個系列濃度精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業的混合標準系列，進行檢測分析，記錄相應的面積響應值，以被測物質標準溶液的質量濃度為橫坐標（x） ，面積響應值為縱坐標（y）建立標準曲線，進行相關分析得到線性方程和相關系數（r） 。同時，對含混和標準系列的基質標準溶液進行檢測分析，記錄相應的面積響應值，以被測物質基質標準溶液的質量濃度為橫坐標（x） ，面積響應值為縱坐標（y）建立基質標準曲線，進行相關分析得到線性方程和相關系數（r） ，結果見表 6。表 6 32 種染料成分的標準曲線和基質標準曲線及相關系數 序號附錄 A中編號物質名稱標準曲線相關系數基質標準曲線相關系數131,5-

53、萘二酚y= 3.88x - 9.970.9997y= 3.45x + 0.6270.9996251-萘酚y= 3.86x- 2.561.0000y= 4.00 x - 7.370.9998382,4-二氨基苯氧基乙醇 HCly = 1.55x - 6.380.9997y = 1.43x - 13.10.99904102,6-二氨基吡啶y = 2.00 x + 2.650.9997y = 1.78x + 11.70.99905132,7-萘二酚y = 2.93x + 0.9781.0000y= 3.10 x + 0.9610.99996152-氨基-3-羥基吡啶y = 7.05x - 2.430

54、.9999y = 6.26x + 40.70.99897212-氯-p-苯二胺硫酸鹽y = 0.876x - 2.930.9995y = 0.871x + 1.540.99998242-甲基雷瑣辛y = 1.31x - 3.960.9998y = 1.29x 2.8410-20.99999252-硝基-p-苯二胺y = 11.0 x - 41.60.9998y = 11.2x - 20.70.999910314-氨基-2-羥基甲苯y = 4.84x - 18.40.9997y = 4.83x - 23.70.999711324-氨基-3-硝基苯酚y = 8.86x - 9.380.9999y

55、= 8.97x - 16.80.999912334-氨基-m-甲酚y = 3.06x - 1.700.9999y = 3.00 x - 0.1921.000013344-氯雷瑣辛y= 2.44x - 0.1241.0000y= 2.38x+ 2.681.000014364-硝基-o-苯二胺y = 9.22x - 25.20.9999y = 8.90 x + 3.740.999915406-氨基-m-甲酚y = 4.63x - 30.70.9994y = 4.21x 24.00.999716426-羥基吲哚y=3.98x+6.6410-21.0000y = 3.92x+ 5.151.000017

56、61氫醌y = 5.33x + 7.660.9997y = 5.64x + 4.351.00001867m-氨基苯酚y = 4.99x - 17.20.9997y = 4.94x - 10.50.99981970m-苯二胺y = 3.91x - 30.50.9992y = 3.65x + 0.2321.00002072N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽y = 1.76x - 20.70.9990y = 1.77x - 37.10.99822173N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽y = 1.26x - 10.50.9989y = 1.13x - 7.870.99902274N,N-二乙基

57、甲苯-2,5-二胺 HCly = 2.22x - 9.680.9999y = 2.05x - 4.470.99972378N-苯基-p-苯二胺y= 11.6x- 20.20.9999y = 10.2x + 4.991.00002481o-氨基苯酚y = 6.52x - 25.80.9998y = 6.31x - 4.921.00002583p-氨基苯酚y = 3.00 x - 12.40.9996y = 2.81x - 8.920.99992685苯基甲基吡唑啉酮y= 3.40 x- 19.60.9996y = 2.89x - 10.70.99952787P-甲基氨基苯酚硫酸鹽y = 1.83

58、x + 3.330.9990y = 1.67x + 10.50.99932888P-苯二胺y = 2.79x - 12.70.9995y = 2.69x - 6.920.99982991間苯二酚y = 3.58x - 8.580.9998y = 3.34x - 4.420.99993095甲苯-2,5-二胺硫酸鹽y = 1.55x - 7.280.9995y = 1.47x - 8.080.99963196甲苯-3,4-二胺y = 3.32x - 19.80.9997y = 3.36x - 12.90.999532OPDO-苯二胺y = 5.47x - 26.60.9994y = 5.51x

59、8.2910-21.0000精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業 由表 6 可知，除 N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽基質標準曲線相關系數為 0.9982 和N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽的標準曲線相關系數為 0.9989 外，其余染料的線性相關系數均0.9990，滿足方法要求，且兩種曲線差異不大，在實際工作中可直接使用標準曲線。檢出限是指檢測器恰能產生 3 倍噪聲時的色譜進樣量。對工作曲線逐級往下稀釋，計算信噪比（S/N） 。以 S/N=3 為檢出限，以 S/N=10 為定量下限。當樣品稱樣量為 0.5g，定容體積為 10mL 時，計算檢出濃度和最低定量濃度。32 種染料成

60、分的檢出限、定量下限及檢出濃度和最低定量濃度見表 7。表 7 32 種染料成分的檢出限、定量下限及檢出濃度和最低定量濃度序號附錄 A 中編號物質名稱檢出限/g檢出濃度/（g/g）定量下限/g最低定量濃度/（g/g）131,5-萘二酚5.010-3201.510-260251-萘酚3.010-3121.010-240382,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl8.010-3322.510-21004102,6-二氨基吡啶1.510-26057-萘二酚3.010-3121氨基-3-羥基吡啶1.010-2403氯-p-苯二胺硫