1、重組重組DNA技術操作的主要步驟技術操作的主要步驟生化教研室生化教研室 陳新美陳新美載體載體質粒質粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產物產物限制酶消化限制酶消化開環載體開環載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉化轉化體外包裝，轉染體外包裝，轉染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交一、重組一、重組DNADNA分子的導入分子的導入選定的受體細胞應具備的條件：選定的受體細胞應具備的條件：1. 1. 易于接納重組易于接納重組DNADNA分子導入；

2、分子導入；2.2.對載體的復制、擴增和表達無嚴格限制；對載體的復制、擴增和表達無嚴格限制；3.3.不存在特異性降解外源不存在特異性降解外源DNADNA的酶系統；不對外源的酶系統；不對外源DNADNA進行修飾；能表達重組體分子所提供的某種表進行修飾；能表達重組體分子所提供的某種表型特征。型特征。常用的導入方法常用的導入方法: : （一）轉化（一）轉化（transformationtransformation）（二）轉染（二）轉染（transfectiontransfection）（三）感染（三）感染（infectioninfection）第六節第六節 重組重組DNA分子的導入和篩選與鑒定分子的導

3、入和篩選與鑒定1.氯化鈣法：氯化鈣法：細菌處于低溫、細菌處于低溫、低滲低滲CaCl2溶液中，菌細胞溶液中，菌細胞壁通透性增加，菌體膨脹成壁通透性增加，菌體膨脹成球形，經短暫熱休克后重組球形，經短暫熱休克后重組DNA易進入易進入2.電穿孔法：電穿孔法：除特殊儀器外除特殊儀器外比氯化鈣法更簡單，使用時比氯化鈣法更簡單，使用時注意電場強度、電脈沖長度、注意電場強度、電脈沖長度、DNA濃度等參數。濃度等參數。（一）轉化（一）轉化（transformationtransformation）（二）轉染（二）轉染 將表達載體導入真核細胞的過程將表達載體導入真核細胞的過程方法：方法： 1、磷酸鈣轉染、磷酸鈣轉

4、染 2、二乙氨乙基、二乙氨乙基DEAE葡聚糖介導轉染葡聚糖介導轉染 3、電穿電穿孔孔 :操作簡單且轉染效率高，幾乎可轉染任何細胞用于瞬時表達或穩定表達。但是它需要專門儀器，確定最佳實驗條件。 4、脂質體轉染、脂質體轉染 :脂質體（liposomes）是一種人造類脂膜.用脂質體包裹DNA，瞬時表達和穩定表達，操作簡單，轉染效率高，重復性好，且毒性低、包裝容量大，昂貴。 5、顯微注射顯微注射:轉染效率高，但需要一定的儀器和操作技巧,主要用于穩定表達。（三）感染（三）感染（infectioninfection）感染是指以人工改造的噬菌體或病毒為載體構建感染是指以人工改造的噬菌體或病毒為載體構建的重組

5、體的重組體DNA，經體外包裝成具有感染性的噬菌體顆，經體外包裝成具有感染性的噬菌體顆粒和病毒顆粒后，借助噬菌體或病毒的外殼蛋白將重粒和病毒顆粒后，借助噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組組DNA注入細菌或真核細胞。注入細菌或真核細胞。感染的效率很高，但重組體感染的效率很高，但重組體DNA需經過較為復雜需經過較為復雜的體外包裝過程。的體外包裝過程。與轉染不同，也可以以質粒的方式進入蘇竹君，與轉染不同，也可以以質粒的方式進入蘇竹君，并進行復制繁殖。并進行復制繁殖。第四節第四節 常用載體常用載體 定義定義 載體是攜帶目的基因進入宿主細胞擴增和載體是攜帶目的基因進入宿主細胞擴增和表達的工具。表達的工具。具備的

6、條件具備的條件:具有自主復制能力具有自主復制能力有多個單一限制性內切酶的酶切位點（有多個單一限制性內切酶的酶切位點（MCS）具有選擇性遺傳標記具有選擇性遺傳標記分子量小分子量小拷貝數高（拷貝數高（10個個200個個/細胞）細胞）具有較高的遺傳穩定性。具有較高的遺傳穩定性。 常用載體常用載體:質粒質粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA質粒質粒 (plasmid):是細菌內攜帶的染色體外是細菌內攜帶的染色體外的小型雙鏈環狀的小型雙鏈環狀DNADNA，能獨立進行復制。，能獨立進行復制。質粒載體特點質粒載體特點: 1.分子量相對較小能在細菌內穩定存在，能分子量相對較小能在細菌內穩定存在，能在宿主細

7、胞內獨立自主復制；有較高的拷在宿主細胞內獨立自主復制；有較高的拷貝數。貝數。 2.具有一個以上的遺傳標志，便于在宿主細具有一個以上的遺傳標志，便于在宿主細胞進行選擇。胞進行選擇。 3.具有多個限制性酶的單一切口，稱為多克具有多個限制性酶的單一切口，稱為多克隆位點。便于外源基因的插入。隆位點。便于外源基因的插入。常用質粒載體常用質粒載體（一）（一） pBR322質粒：由一系列大腸桿菌質粒質粒：由一系列大腸桿菌質粒DNA通過重組技術構建成，長度為通過重組技術構建成，長度為4.36kb，特點：，特點：（1）含有復制起始點和復制調節信號；）含有復制起始點和復制調節信號；（2）有單個）有單個EcoRI酶

8、切位點，可切開插入目的基因；酶切位點，可切開插入目的基因；（3）有抗四環素基因）有抗四環素基因Ter+和抗氨芐青霉素基因和抗氨芐青霉素基因 Amp+，便于，便于重組體細胞的篩選。重組體細胞的篩選。（二）（二） pUC系列載體系列載體:由由pBR質粒與質粒與M13噬菌體構建而成，長度為噬菌體構建而成，長度為2.674kb。pUC載體系列已成為載體系列已成為pBR322的替代載體，是基因重組中應用較的替代載體，是基因重組中應用較普遍的質粒載體。普遍的質粒載體。 特點：特點：具有更小的分子量和更高的拷貝數。具有更小的分子量和更高的拷貝數。 “藍白斑藍白斑”篩選篩選: pUC載體中的載體中的LacZ

9、基因可編碼基因可編碼-半乳糖苷半乳糖苷酶（酶（-Gal）N端的端的-肽鏈，該肽鏈，該-肽與宿主細胞肽與宿主細胞(如如E.coli JM109）中）中F 因子上的因子上的LacZ M15基因（基因（-肽缺陷型）的產肽缺陷型）的產物互補，產生完整的、有活性的物互補，產生完整的、有活性的-半乳糖苷酶，分解生色底半乳糖苷酶，分解生色底物（物（X-gal）形成藍色菌落。當外源基因插入）形成藍色菌落。當外源基因插入MCS后，后，LacZ -肽基因的讀碼框被破壞，不能合成完整的肽基因的讀碼框被破壞，不能合成完整的-半乳糖苷半乳糖苷酶分解底物酶分解底物X-gal，菌落呈白色。稱為，菌落呈白色。稱為“藍白斑藍白

10、斑”篩選。篩選。EcoRSacKpnSmaBamHXbaSalPstSphHind pUC19(2 686bp)AmprLacZ Oriori pUC19質粒載體圖 根據根據-半乳糖苷酶顯色反應篩選半乳糖苷酶顯色反應篩選 :AmN2H（三）其它質粒載體1能在體外轉錄克隆基因的質粒載體 此類載體是由pUC系列質粒載體派生而來的，它們與pUC載體之間的主要差別是帶有來自噬菌體帶有來自噬菌體T7、SP6的啟動子，的啟動子，這些啟動子為這些啟動子為RNA聚合酶的聚合酶的附著作用提供了特異性的識別位點，使載體能在附著作用提供了特異性的識別位點，使載體能在體外轉錄插入的外源體外轉錄插入的外源DNA。 如，

11、pGEM-3Z/4Z是由pUC18/19改造而來，大小為2.74kb，序列結構幾乎與pUC18/19完全一樣。與pUC18/19相比，pGEM-3Z/4Z在MCS的兩端添加了SP6和T7噬菌體的啟動子。而pGEM-3Z/4Z之間的差別僅在于SP6和T7兩個啟動子的位置互換、取向相反而已。2穿梭質粒載體（shuttle plasmid vector） 是一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記，因而可在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質粒載體。 這類質粒載體可以攜帶著外源DNA序列在不同物種的細胞之間，特別是在原核和真在原核和真核細胞之間往返穿梭，核細胞之間往返穿梭，因此在基因工程的研究中

12、是非常有用的。（四）T-A克隆載體 此類載體是專為克隆PCR產物而設計的，它們的共同點是在其多克隆位點兩側的3末端攜帶有未配對的T堿基。由于許多耐熱的DNA聚合酶（如Taq、Tth等）擴增時都有在PCR產物3末端加上A堿基的特性，因此在連接酶的作用下可直接將PCR產物插入到T-A載體中。 T-A克隆載體的突出優點是克隆載體的突出優點是能直接克隆能直接克隆PCR產物產物，獲取、連接外源獲取、連接外源DNA不受酶切位點的限制，不受酶切位點的限制，近年來得到非常廣泛的應用，已有不同公司推出具有各自特點的T-A克隆載體系列。 二、噬菌體載體二、噬菌體載體 噬菌體（bacteriophage，簡稱pha

13、ge）是一類細菌病毒，可用于克隆和擴增特定的DNA片段，是廣泛使用的基因克隆載體。（一）噬菌體載體1噬菌體的特點 噬菌體的基因組為線狀雙鏈DNA，全長48 502bp，由左右兩臂組成，共含有66個基因，線性DNA分子的兩端為12堿基組成的彼此完全互補的5單鏈突出黏性末端，稱為cos位點。注入到感染寄主細胞內的線性DNA分子，會借助cos位點互補連接形成環狀雙鏈結構，按方式及滾環方式復制。 噬菌體感染細菌后，可進入溶菌生命周期及溶源生命周期。溶菌性生長是噬菌體基因組晚期基因表達，大量復制噬菌體DNA，并包裝成病毒顆粒，通過裂解宿主細胞而釋放出來的生長方式，這一方式可使噬菌體克隆外源噬菌體克隆外源

14、DNA后大量復制。后大量復制。溶源性生長是噬菌體只表達早期基因，通過與宿主染色體DNA重組、整合，隨宿主染色體的復制而復制，在宿主細胞內只有一個噬菌體基因組DNA拷貝。2噬菌體載體的構建 噬菌體是最早發展和使用的基因工程載體，以溶菌方式生長。 與質粒載體相比，其突出優點是：可插入較大外源DNA片段（可達23kb）；噬菌體的感染效率遠高于質粒載體的轉化效率。（二）粘粒載體（二）粘粒載體 雖然用噬菌體作為載體最大能容納23kb的外源DNA片段，但是有些基因可達35kb40kb或更大，同時在分析基因組結構時，還要了解相連鎖的基因及基因排列的順序，這就要求克隆更大的DNA片段。 粘粒是由質粒和由質粒和

15、噬菌體的噬菌體的cos黏性末端構黏性末端構建而成建而成。可作為克隆大片段基因組DNA的一種載體。目前已發展出許多不同類型的粘粒載體，大體具有以下的結構與特點： 1含有DNA的cos黏性末端及與噬菌體包裝有關的短序列 在噬菌體的生活周期中，通過cos端位的突出單鏈相互補，可將許多個DNA串聯在一起，若兩個cos位點相距35kb45kb，則能被包裝酶系識別并切斷而包裝成病毒顆粒。 2含有質粒的抗藥性標記（如Ampr基因）和自主復制成分 具有質粒的復制子，因此當體外重組的粘粒分子包裝成病毒顆粒感染細菌后，可按質粒方式在細菌中進行復、擴增。而粘粒載體上所攜帶的抗藥性基因，可作為重組體分子的篩選標記。

16、3具有一個或多個單一切口的限制性內切酶位點 用于插入外源DNA片段。 4粘粒分子小 如pJB8為5.4kb，所以可插入大片段的外源DNA（可達45kb），對多基因家族組織結構的研究很有用。 5某些粘粒若接上能在真核細胞生活的元件（如SV40復制區及啟動子）及選擇標記，便可作為穿梭載體在真核細胞中生存及表達。（三）M13噬菌體載體 M13是一種絲狀單鏈噬菌體，基因組全長6 407bp，為閉環單鏈閉環單鏈DNA。M13只能感染具有F傘毛的雄性大腸桿菌，在細菌內復制時形成雙鏈DNA，這種復制型（replication form，RF）M13相當于質粒，可用作基因克隆載體。當RF的M13在細菌內達到1

17、00個200個拷貝后，M13只合成單鏈DNA，經包裝成噬菌體顆粒而分泌至細胞外。 利用利用RF的的M13作為載體插入外源作為載體插入外源DNA，使其在細，使其在細菌內產生單鏈菌內產生單鏈DNA，以進行，以進行DNA序列分析、體外序列分析、體外定點突變和核酸雜交等。定點突變和核酸雜交等。 通過對M13噬菌體進行改造，已成功構建了M13mp系列載體，如M13mp8/9、M13mp10/11及M13mp18/19等。它們都含有LacZ基因，并在其中插入了MCS序列。 M13mp系列載體大多是成對的，且有pUC質粒系列的MCS與之相對應。需注意的是，M13噬菌體載體克隆的外源DNA片段不宜大于1 50

18、0bp，這就限制了這類載體在基因克隆中的應用。 為解決這一問題，研究者們已發展出一類由質粒載體和單鏈噬菌體載體結合而成的新型載體系列，稱為噬菌粒（phagemid），如pUC118/119噬菌粒載體。三、人工染色體載體三、人工染色體載體 人工染色體載體是為了克隆更大的DNA片段以及建立真核生物染色體物理圖和進行序列分析等的需要而發展起來的一類新型載體。酵母人工染色體載體（yeast artificial chromosome vector，YAC） 是第一個成功構建的人工染色體載體，用于在酵母細胞中克隆大片段外源DNA。 YAC由酵母染色體、酵母2m DNA質粒的復制起始序列等元件衍生而成，主

19、要包括以下調控元件：著絲粒（centromere，CEN），以保證染色體在細胞分裂過程中正確地分配到子代細胞；端粒（telomere，TEL），作為染色體復制所必需的成分，可防止染色體被核酸外切酶降解而縮短；復制起始點和限制性酶切位點；YAC載體的兩臂均帶有選擇標記；原核序列及調控元件，包括大腸桿菌復制起始點、Ampr基因等，以便于在大腸桿菌中操作。細菌人工染色體載體（bacterial artificial chromosome vector，BAC） 是繼YAC之后的又一人工染色體載體，是以細菌的F因子（一種特殊質粒）為基礎構建而成的，可插入100kb300kb的外源DNA片段。與YAC相

20、比，具有克隆穩定、易與宿主DNA分離等優點。BAC是人類基因組計劃中基因序列分析用的主要載體。 此外，噬菌體P1衍生的人體染色體（PAC）和哺乳動物人工染色體（MAC）也在不斷發展中。四、病毒載體四、病毒載體 近年來為適應真核細胞DNA重組技術的需要，特別是為實現真核基因表達或基因治療的需要為實現真核基因表達或基因治療的需要，已發展了用動物病毒（如SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒及反轉錄病毒等）改造的病毒載體及用于昆蟲細胞表達的桿狀病毒載體等。 目前常用的病毒載體有兩類：整合型和游離型。目前常用的病毒載體有兩類：整合型和游離型。整合型載體可整合到宿主細胞的染色體上，并隨染色體的復制而復制，可持續

21、表達外源基因，但存在插入誘變的危險。游離型載體并不整合到宿主染色體DNA上，而是游離于染色體外瞬時表達外源基因，有較好的安全性。 （一）反轉錄病毒載體（一）反轉錄病毒載體 反轉錄病毒為單正鏈RNA病毒，可高效感染許多類型的宿主細胞，并穩定整合到宿主細胞染色體上，是最先被改造且應用最為廣泛的基因治療載體。 （二）腺病毒載體（二）腺病毒載體 腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，基因組長約36kb，兩端各有一個反向末端重復區（inverted terminal repeat，ITR），為病毒復制和包裝所必需。基因組由早期轉錄域（分布著四個轉錄單位E1、E2、E3、E4，承擔調節功能）、晚期轉錄域（負

22、責結構蛋白的編碼）和RNA聚合酶轉錄子組成。 （三）感染（三）感染（infectioninfection）感染是指以人工改造的噬菌體或病毒為載體構建感染是指以人工改造的噬菌體或病毒為載體構建的重組體的重組體DNA，經體外包裝成具有感染性的噬菌體顆，經體外包裝成具有感染性的噬菌體顆粒和病毒顆粒后，借助噬菌體或病毒的外殼蛋白將重粒和病毒顆粒后，借助噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組組DNA注入細菌或真核細胞。注入細菌或真核細胞。感染的效率很高，但重組體感染的效率很高，但重組體DNA需經過較為復雜需經過較為復雜的體外包裝過程。的體外包裝過程。與轉染不同，也可以以質粒的方式進入宿主菌，與轉染不同，也可以以質

23、粒的方式進入宿主菌，并進行復制繁殖。并進行復制繁殖。( (一）根據重組載體的遺傳表型進行篩選一）根據重組載體的遺傳表型進行篩選 1 1根據載體的抗藥性標記篩選根據載體的抗藥性標記篩選 2 2根據載體的抗藥性標記插入失活選擇根據載體的抗藥性標記插入失活選擇 3 3根據根據-半乳糖苷酶顯色反應篩選半乳糖苷酶顯色反應篩選 4 4根據插入的外源基因性狀進行篩選根據插入的外源基因性狀進行篩選（二）限制性核酸內切酶酶切鑒定（二）限制性核酸內切酶酶切鑒定（三）核酸分子雜交法（三）核酸分子雜交法（四）（四）PCR法法（五）免疫化學檢測法（五）免疫化學檢測法：二二. 重組體的篩選與鑒定重組體的篩選與鑒定1.抗抗

24、藥藥性性標標記記選選擇擇（一）根據重組載體的遺傳表型進行篩選（一）根據重組載體的遺傳表型進行篩選BamH酶切酶切目的目的DNA重組質粒重組質粒轉化轉化大腸桿菌大腸桿菌含含Amp平板平板BamH酶切酶切DNA連接酶連接酶重組體重組體TetrTetrAmprAmpr含含Amp和和Tet平板平板轉化轉化大腸桿菌大腸桿菌AmprTetrBamH位點位點BamH酶切酶切BamH酶切酶切DNA連接酶連接酶目的目的DNA重組質粒重組質粒大腸桿菌大腸桿菌含含Amp平板平板含含Amp平板平板含含Tet平板平板 2.抗抗藥藥性性標標記記插插入入失失活活選選擇擇含含Amp平板平板3根據根據-半乳糖苷酶顯色反應篩選半

25、乳糖苷酶顯色反應篩選 :AmN2H4根據插入的外源基因性狀進行篩選根據插入的外源基因性狀進行篩選如把酵母基因組如把酵母基因組DNA隨機切割后插入到隨機切割后插入到質粒載體中，然后將重組質粒轉化到質粒載體中，然后將重組質粒轉化到組氨酸組氨酸缺陷型大腸桿菌缺陷型大腸桿菌細胞中，并在無組氨酸的培細胞中，并在無組氨酸的培養基中培養。這樣只有含酵母組氨酸基因并養基中培養。這樣只有含酵母組氨酸基因并獲得表達的轉化菌獲得表達的轉化菌才能在無組氨酸的培養基才能在無組氨酸的培養基中生長中生長。（二）（二）.限制性核酸內切酶酶切鑒定限制性核酸內切酶酶切鑒定（三）（三）. .核酸分子雜交法核酸分子雜交法: :（四）

26、（四）PCR法法 某些載體的某些載體的MCS兩側存在保守的序列，如兩側存在保守的序列，如pGEM系列載體的系列載體的MCS兩側是兩側是T7及及SP6啟啟動子序列，可根據此序列設計引物，對提動子序列，可根據此序列設計引物，對提取的重組質粒進行取的重組質粒進行PCR擴增。擴增。 如果已知目的基因的全序列或其兩端的序如果已知目的基因的全序列或其兩端的序列與全長，可設計合成一對引物，以轉化列與全長，可設計合成一對引物，以轉化菌的質粒菌的質粒DNA為模板進行為模板進行PCR擴增，擴增，若若PCR產物與目的基因的預期長度相一致，產物與目的基因的預期長度相一致，那么即可初步篩選出含重組體的陽性菌落。那么即可

27、初步篩選出含重組體的陽性菌落。雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出ACTGAAGGCT基因表達基因表達是指結構基因在調控序列的作用下轉錄成是指結構基因在調控序列的作用下轉錄成mRNA，經加工后在核糖體的協助下又轉譯出相應的基因，經加工后在核糖體的協助下又轉譯出相應的基因產物產物蛋白質，再在受體細胞環境中經修飾而顯示出相蛋白質，再在受體細胞環境中經修飾而顯示出相應的功能。應的功能。從基因到有功能的產物這整個轉錄、轉譯及所從基因到有功能的產物這整個轉錄、轉譯及所有的加工過程就是基因表達的過程，它是在一系列酶和調有的加工過程就是基因表達的過程，它是在一系列酶和調控序列的共同作用下完成的。

28、控序列的共同作用下完成的。基因重組的基因重組的主要目的主要目的是要使目的基因在某一細胞中能是要使目的基因在某一細胞中能得到高效表達，即產生人們所需要的高產目的的基因產物，得到高效表達，即產生人們所需要的高產目的的基因產物，如蛋白質、多肽類生物藥物。如蛋白質、多肽類生物藥物。重組重組DNA技術的技術的核心核心是是基因表達技術基因表達技術。 外源基因的表達設計目的基因的外源基因的表達設計目的基因的克隆、復制、轉錄、翻譯、蛋白克隆、復制、轉錄、翻譯、蛋白產物的加工及分離純化等過程。產物的加工及分離純化等過程。 表達體系分為原核表達系統和真表達體系分為原核表達系統和真核表達系統。核表達系統。目前已構建

29、出了多種基因表達系統，包括原核生物表達系目前已構建出了多種基因表達系統，包括原核生物表達系統和真核生物表達系統，不同的表達系統具有各自的特點。統和真核生物表達系統，不同的表達系統具有各自的特點。在原核生物中，基因表達是以在原核生物中，基因表達是以操縱子操縱子的形式進行的。當操的形式進行的。當操縱子的調節基因與縱子的調節基因與RNA聚合酶作用時，結構基因則開始轉錄成聚合酶作用時，結構基因則開始轉錄成相應的相應的mRNA，與此同時，與此同時， mRNA立即與核糖體結合轉譯出相立即與核糖體結合轉譯出相應的多肽或蛋白質，轉錄完畢時轉譯也完成，隨之應的多肽或蛋白質，轉錄完畢時轉譯也完成，隨之mRNA也被

30、也被水解掉。水解掉。在真核生物基因表達系統中，轉錄是在核內進行的，先生在真核生物基因表達系統中，轉錄是在核內進行的，先生成成hnRNA，再加工去掉內含子，外顯子相連接，并修飾，再加工去掉內含子，外顯子相連接，并修飾5和和3末端后才形成末端后才形成mRNA，而，而mRNA只能在細胞漿中的核糖體上轉只能在細胞漿中的核糖體上轉譯成多肽或蛋白質，再經過加工、糖化、形成高級結構。譯成多肽或蛋白質，再經過加工、糖化、形成高級結構。v基因表達在原核生物與真核生物中的差別？基因表達在原核生物與真核生物中的差別？外源基因表達系統外源基因表達系統外源基因表達系統：外源基因表達系統：泛指目的基因與表達載體重組后，導

31、入泛指目的基因與表達載體重組后，導入合適的受體細胞，并能在其中有效表達，產生目的基因產物合適的受體細胞，并能在其中有效表達，產生目的基因產物（目的蛋白）。（目的蛋白）。外源基因表達系統外源基因表達系統基因表達載體基因表達載體受體細胞受體細胞基因表達系統基因表達系統原核生物基因表達系統：原核生物基因表達系統：如大腸桿菌表達如大腸桿菌表達系統、系統、芽孢桿菌表達系統、鏈霉菌表達系芽孢桿菌表達系統、鏈霉菌表達系統、藍藻表達系統等。統、藍藻表達系統等。真核生物基因表達系統：真核生物基因表達系統：如酵母表達系如酵母表達系統統、植物細胞表達系統、昆蟲細胞表達、植物細胞表達系統、昆蟲細胞表達系統、系統、哺乳

32、動物細胞表達系統等。哺乳動物細胞表達系統等。v （一）原核生物作為基因表達系統的受體細（一）原核生物作為基因表達系統的受體細胞所具有的特點：胞所具有的特點：原核生物大多數為單細胞異養，生長快，代謝易于控制，可原核生物大多數為單細胞異養，生長快，代謝易于控制，可通過發酵迅速獲得大量基因表達產物。通過發酵迅速獲得大量基因表達產物。基因組結構簡單，便于基因操作和分析。基因組結構簡單，便于基因操作和分析。多數原核生物細胞內含有質粒或噬菌體，便于構建相應的表多數原核生物細胞內含有質粒或噬菌體，便于構建相應的表達載體。達載體。生理代謝途徑及基因表達調控機制比較清楚。生理代謝途徑及基因表達調控機制比較清楚。

33、不具備真核生物的蛋白質加工系統，表達產物無特定的空間不具備真核生物的蛋白質加工系統，表達產物無特定的空間構相。構相。內源蛋白酶會降解表達的外源蛋白，造成表達產物的不穩定。內源蛋白酶會降解表達的外源蛋白，造成表達產物的不穩定。一一. . 外源基因在原核細胞中的表達外源基因在原核細胞中的表達1 1、強啟動子及兩側調控序列、終止序列、強啟動子及兩側調控序列、終止序列2 2、含、含SDSD序列序列3 3、選擇標志、選擇標志4 4、多接頭克隆位點、多接頭克隆位點（三）外源基因在原核細胞中的表達（三）外源基因在原核細胞中的表達1 1融合型表達蛋白融合型表達蛋白 所謂融合型表達是指將外所謂融合型表達是指將外

34、源目的基因與另一基因相拼接構建成融合基因源目的基因與另一基因相拼接構建成融合基因進行表達。進行表達。2 2非融合型表達蛋白非融合型表達蛋白 3 3分泌型表達蛋白分泌型表達蛋白 利用分泌型表達載體，需利用分泌型表達載體，需要在信號肽的幫助下進行。要在信號肽的幫助下進行。4 4包涵體包涵體（二）原核表達載體（二）原核表達載體1融合型表達蛋白融合型表達蛋白融合蛋白融合蛋白將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，以這因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，以這種方式表達的蛋白稱為融合蛋白。種方式表達的蛋白稱為融合蛋白。*融合蛋白與單獨表達

35、的外源蛋白相比具有以下優點：融合蛋白與單獨表達的外源蛋白相比具有以下優點：穩定性好；穩定性好；表達效率高；表達效率高；較易于分離純化。較易于分離純化。寡聚型外源蛋白：寡聚型外源蛋白：在構建外源蛋白表達載體時，將多個外源目的在構建外源蛋白表達載體時，將多個外源目的蛋白基因串連在一起，克隆在質粒載體上，以這種蛋白基因串連在一起，克隆在質粒載體上，以這種方式表達的外源蛋白稱為方式表達的外源蛋白稱為寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白。2非融合型表達蛋白非融合型表達蛋白整合型外源蛋白整合型外源蛋白將要表達的外源基因整合到染色體的將要表達的外源基因整合到染色體的非必需編碼區非必需編碼區上，上，使之成為染色體結構

36、的一部分而穩定地遺傳，以此種方式表使之成為染色體結構的一部分而穩定地遺傳，以此種方式表達的外源蛋白即為達的外源蛋白即為整合型外源蛋白整合型外源蛋白。為獲得含整合基因的重組體，被選擇的載體一般是那些在為獲得含整合基因的重組體，被選擇的載體一般是那些在受體細胞內不能自主復制或溫度敏感型質粒。那么當外源基因受體細胞內不能自主復制或溫度敏感型質粒。那么當外源基因被交換到染色體上后，由于宿主菌的不斷分裂和增殖，細胞內被交換到染色體上后，由于宿主菌的不斷分裂和增殖，細胞內的質粒逐漸被稀釋直至消失。外源基因整合到染色體上后雖只的質粒逐漸被稀釋直至消失。外源基因整合到染色體上后雖只含有單拷貝，但在合適的條件下

37、仍能高效表達外源蛋白。含有單拷貝，但在合適的條件下仍能高效表達外源蛋白。3、分泌型表達蛋白、分泌型表達蛋白外源基因的表達產物，通過運輸或分泌的方式外源基因的表達產物，通過運輸或分泌的方式穿過細胞的外膜進入培養基中，即為穿過細胞的外膜進入培養基中，即為分泌型外源表分泌型外源表達蛋白達蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表達時，須在外源蛋白以分泌型蛋白表達時，須在N端加入端加入1530個氨基酸組成的個氨基酸組成的信號肽（信號肽（signal peptides）序序列。信號肽列。信號肽N端的最初幾個氨基酸為極性氨基酸，端的最初幾個氨基酸為極性氨基酸，中間和后部為疏水氨基酸，它們對蛋白質分泌到細中間和后部為疏水

38、氨基酸，它們對蛋白質分泌到細胞膜外起決定性作用。當蛋白質分泌到位于大腸桿胞膜外起決定性作用。當蛋白質分泌到位于大腸桿菌細胞內膜與外膜之間的外周質時，信號肽被信號菌細胞內膜與外膜之間的外周質時，信號肽被信號肽酶所切割。肽酶所切割。分泌到細胞外周質的蛋白質產物較穩定，不易被分泌到細胞外周質的蛋白質產物較穩定，不易被細胞內蛋白酶所降解。細胞內蛋白酶所降解。簡化了發酵后處理的純化工藝。簡化了發酵后處理的純化工藝。缺點：缺點：外源蛋白分泌型表達通常產量不高，有時信外源蛋白分泌型表達通常產量不高，有時信號肽不被切割或在不適當的位置發生切割。號肽不被切割或在不適當的位置發生切割。以分泌型蛋白的形式表達外源基

39、因的優點：以分泌型蛋白的形式表達外源基因的優點：分泌型可能使蛋白質按適當的方式折疊，有利于分泌型可能使蛋白質按適當的方式折疊，有利于形成正確的空間構相，獲得有較好生物學活性或免形成正確的空間構相，獲得有較好生物學活性或免疫原性的蛋白質。甚至有些在細胞內表達時無活性疫原性的蛋白質。甚至有些在細胞內表達時無活性的蛋白質分泌后則有活性。的蛋白質分泌后則有活性。4、包涵體、包涵體包涵體包涵體：在一定條件下，外源基因的表達產：在一定條件下，外源基因的表達產物在大腸桿菌中積累并致密地集中在一起形物在大腸桿菌中積累并致密地集中在一起形成無膜的裸露結構，這種結構稱為包涵體。成無膜的裸露結構，這種結構稱為包涵體

40、。包涵體存在部位包涵體存在部位：細胞質、細胞周質：細胞質、細胞周質包涵體包涵體的組成的組成蛋白質蛋白質非蛋白質非蛋白質外源基因的表達產物：外源基因的表達產物：占大部分，具有正占大部分，具有正確的氨基酸序列，但空間構相錯誤，因而包涵確的氨基酸序列，但空間構相錯誤，因而包涵體蛋白一般體蛋白一般沒有生物學活性沒有生物學活性。受體細胞本身的表達產物：受體細胞本身的表達產物：如如RNA聚合聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達載體編碼酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達載體編碼的蛋白等。的蛋白等。：包括包括DNA、RNA和脂多糖等和脂多糖等。包涵體形成的本質包涵體形成的本質是細胞內蛋白質的不斷聚集，主要包括是

41、細胞內蛋白質的不斷聚集，主要包括三個方面：三個方面：折疊狀態的蛋白質的聚集作用；折疊狀態的蛋白質的聚集作用；非折疊狀態的蛋白質的聚集作用；非折疊狀態的蛋白質的聚集作用；蛋白質折疊中間體的作用。蛋白質折疊中間體的作用。原核表達體系的不足：原核表達體系的不足：v不宜表達真核基因組不宜表達真核基因組DNA；v不能加工表達的真核蛋白質；不能加工表達的真核蛋白質；v表達的蛋白質常形成不溶性包涵體表達的蛋白質常形成不溶性包涵體(inclusion body) ；v很難表達大量可溶性蛋白很難表達大量可溶性蛋白 優點：優點：可表達克隆的可表達克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA 可適當修飾表達的蛋白質

42、可適當修飾表達的蛋白質 表達產物分區域積累表達產物分區域積累 缺點：缺點：操作技術難、費時、經濟操作技術難、費時、經濟（一）真核表達體系（酵母、昆蟲、（一）真核表達體系（酵母、昆蟲、乳類動物細胞等）乳類動物細胞等）二、外源基因在真核細胞中的表達二、外源基因在真核細胞中的表達（二）真核表達載體大多是穿梭載體（二）真核表達載體大多是穿梭載體, 通通常包括以下元件：常包括以下元件：1啟動子啟動子 包括包括SV40、CMV、RSV及及LTR等。等。2增強子增強子 3剪接信號剪接信號4終止信號和終止信號和PolyA化信號化信號5遺傳選擇標記遺傳選擇標記 ：胸苷激酶基因（：胸苷激酶基因（tk）、二氫葉）、

43、二氫葉酸還原酶基因（酸還原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰轉移酶基因）、氯霉素乙酰轉移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（）、新霉素抗性基因（neor）等。）等。（三）外源基因導入宿主細胞（三）外源基因導入宿主細胞(轉染或感染轉染或感染)新霉素的類似物新霉素的類似物G418（geneticin）對真）對真核和原核細胞均有毒性。表達載體中攜帶的核和原核細胞均有毒性。表達載體中攜帶的neor基因編碼的基因編碼的磷酸轉移酶磷酸轉移酶能使能使G418失活，失活，所以當真核細胞中導入了含所以當真核細胞中導入了含neor基因的載體基因的載體后，轉染細胞就后，轉染細胞就可以在含有可以在含有G418的培養基中的培

44、養基中生長而得以篩選生長而得以篩選。該選擇系統適用于所有真。該選擇系統適用于所有真核細胞核細胞。v新霉素抗性選擇系統新霉素抗性選擇系統 （四）轉染細胞的篩選（四）轉染細胞的篩選酵母表達系統酵母表達系統:酵母（酵母（yeast）是一類以芽殖或裂殖進行無性繁殖的單細是一類以芽殖或裂殖進行無性繁殖的單細胞胞真核生物真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表達系統。，是外源基因最理想的真核生物基因表達系統。v酵母菌的特點：酵母菌的特點：基因表達調控的機制比較清楚，遺傳操作相對簡便，并于基因表達調控的機制比較清楚，遺傳操作相對簡便，并于1996年完成了對釀酒酵母基因組全序列的測定；年完成了對釀酒酵母基因

45、組全序列的測定；具有原核生物所不具備的蛋白質翻譯后加工和修飾系統；具有原核生物所不具備的蛋白質翻譯后加工和修飾系統；可將外源基因表達產物分泌到培養基中；可將外源基因表達產物分泌到培養基中；對人體和環境安全，不含毒素和特異性病毒；對人體和環境安全，不含毒素和特異性病毒；可進行大規模的發酵，工藝簡單而成熟，成本低廉。可進行大規模的發酵，工藝簡單而成熟，成本低廉。真核表達體系真核表達體系實例：實例：酵母、昆蟲、乳類動物細胞等酵母、昆蟲、乳類動物細胞等哺乳動物細胞基因表達系統哺乳動物細胞基因表達系統:哺乳動物細胞是最高等的真核生物細胞，其結構、功能哺乳動物細胞是最高等的真核生物細胞，其結構、功能和基因

46、表達調控更加復雜。要表達具有生物學功能的蛋白質和基因表達調控更加復雜。要表達具有生物學功能的蛋白質和具有特異性催化功能的酶，需要在高等真核生物細胞中進和具有特異性催化功能的酶，需要在高等真核生物細胞中進行。外源基因在哺乳動物細胞中的表達包括行。外源基因在哺乳動物細胞中的表達包括基因的轉錄、基因的轉錄、mRNA翻譯及翻譯后蛋白質加工翻譯及翻譯后蛋白質加工等過程。等過程。7.3.6.1 哺乳動物基因表達載體的組成特征哺乳動物基因表達載體的組成特征哺乳動物基因表達載體哺乳動物基因表達載體質粒載體質粒載體病毒載體病毒載體哺乳動物基因表達質粒載體是一類哺乳動物基因表達質粒載體是一類穿梭質粒穿梭質粒，能夠

47、在，能夠在細細菌菌（大腸桿菌）和（大腸桿菌）和哺乳動物細胞哺乳動物細胞中進行擴增。中進行擴增。哺乳動物基因表達宿主細胞哺乳動物基因表達宿主細胞 哺乳動物基因表達宿主細胞選擇的哺乳動物基因表達宿主細胞選擇的基本原則基本原則：來來源豐富、轉化效率高、表達效果好。源豐富、轉化效率高、表達效果好。在哺乳動物基因表達過程中，在哺乳動物基因表達過程中，與正常細胞生理特與正常細胞生理特性盡可能接近的腫瘤細胞性盡可能接近的腫瘤細胞常被選擇為基因轉移的受常被選擇為基因轉移的受體細胞。體細胞。目前用作哺乳動物基因表達系統的受體細胞主要目前用作哺乳動物基因表達系統的受體細胞主要有：有：CHO-K1細胞、細胞、COS

48、細胞、鼠骨髓瘤細胞細胞、鼠骨髓瘤細胞等。等。CHO-K1細胞細胞CHO-K1細胞是從中國倉鼠卵巢中分離出的一株上皮細胞。細胞是從中國倉鼠卵巢中分離出的一株上皮細胞。目前被用于基因表達的受體細胞是一株缺乏二氫葉酸還原酶目前被用于基因表達的受體細胞是一株缺乏二氫葉酸還原酶（dhfr）的突變株，它可在氨甲蝶呤選擇壓力下，使外源基因）的突變株，它可在氨甲蝶呤選擇壓力下，使外源基因拷貝數擴增并得到較高水平的表達，表達量可達拷貝數擴增并得到較高水平的表達，表達量可達10g/ml以上。以上。外源基因在沒有選擇壓力的情況下能穩定保持；外源基因在沒有選擇壓力的情況下能穩定保持；適合多種蛋白質的分泌表達和胞內表達

49、；適合多種蛋白質的分泌表達和胞內表達；對培養基的要求較低，可在無血清培養基中培養；對培養基的要求較低，可在無血清培養基中培養；細胞可進行貼壁培養，也可進行大規模懸浮培養。細胞可進行貼壁培養，也可進行大規模懸浮培養。該細胞株是目前應用該細胞株是目前應用最廣泛最廣泛的哺乳動物基因表達受體細胞的哺乳動物基因表達受體細胞之一，已有多種外源基因如人組織型纖溶酶原激活劑（之一，已有多種外源基因如人組織型纖溶酶原激活劑（tPA）、）、干擾素干擾素、干擾素、干擾素 、凝血因子、凝血因子等在等在CHO細胞中得到表達。細胞中得到表達。CHO-K1細胞特點細胞特點COS細胞細胞它來源于非洲綠猴腎細胞系（它來源于非洲

50、綠猴腎細胞系（CV-1），能組成性表達），能組成性表達SV40的大的大T抗原。抗原。COS細胞的特點：細胞的特點：細胞來源豐富；細胞來源豐富；細胞易于培養和轉染；細胞易于培養和轉染；能使轉染到該細胞中的帶有能使轉染到該細胞中的帶有SV40復制子復制子的轉錄載體快速擴增；的轉錄載體快速擴增；能瞬時大量表達外源基因的產物。能瞬時大量表達外源基因的產物。由于轉染質粒在由于轉染質粒在COS細胞中無節制復制，最終將導致細細胞中無節制復制，最終將導致細胞無法忍受而死亡。利用胞無法忍受而死亡。利用COS細胞作為外源基因瞬時表達的細胞作為外源基因瞬時表達的受體細胞可廣泛用于哺乳動物基因的表達與調控、蛋白結構受體細胞可廣泛用于哺乳動物基因的表達與調控、蛋白結構與功能分析等研究。與功能分析等研究。鼠骨髓瘤細胞鼠骨髓瘤細胞鼠骨髓瘤細胞如鼠骨髓瘤細胞如Sp2/0、NSO和和J558L等已被用作基因表等已被用作基因表達的受體細胞。目前已有免疫球蛋白（達的受體細胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、）、tPA等多種外等多種外源基因在鼠骨髓瘤細胞中得到表達。源基因在鼠骨髓瘤細胞中得到表達。鼠骨髓瘤細胞的特點：鼠骨髓瘤細胞的特點： 細胞易于培養和轉染，可在無血清培細胞易