1、無菌原料藥的無菌工藝驗證摘要 敘述了無菌原料藥的無菌工藝驗證一般過程和注意事項,包括驗證前的準備、驗證的實施、最終報告和再驗證。涉及人員培訓、操作時限、模擬介質的選擇和滅菌、環境監測、取樣和樣品培養等內容。關鍵詞 無菌原料藥 無菌工藝驗證 模擬介質 培養基 環境監測 最終報告 再驗證無菌原料藥的生產通常是把精制過程和無菌過程結合在一起,將無菌過程作為生產工藝的一個單元操作來完成。有很多種方法可以使非無菌的原材料轉化為無菌的原料藥。目前生產上最常用的方法是無菌過濾法,即將非無菌的中間體或原材料配制成溶液,再通過0.22孔徑的過濾器以達到除去細菌的目的,在以后用于精制的一系列單元操作中一直保持無菌

2、,最后生產出符合無菌要求的原料藥。典型的無菌原料藥精制生產工藝為:將原材料配制成溶液除菌過濾結晶過濾洗滌干燥粉碎分裝。在上述的滅菌生產工藝中,除了除菌過濾外,還包括設備滅菌、包裝材料滅菌、無菌衣物滅菌等等。這些滅菌過程經過驗證能保證從非無菌狀態轉化成無菌狀態。但是無菌原料藥的生產過程是精制過程和上述這些滅菌過程的組合,或者稱之為無菌工藝,這種無菌工藝只有經過驗證才能確保產品的無菌性能可靠。驗證過程一般是選擇合適的介質模擬生產流程,使介質流經整個生產系統,然后對模擬介質培養,觀察是否有細菌長出。如果系統中有染菌的因素存在,在對模擬介質的培養中就會被發現。1 驗證前的準備無菌工藝驗證是生產、質量、

3、工程和其它部門之間廣泛合作的一項工作。在驗證之前需要做一些準備工作。1.1 生產設施的設計和確認生產設施的設計應能使潛在的污染降低到最小。生產設施應易于清潔和消毒;產品或物料敞開之處的空氣要有一定的品質要求;溫度和濕度的控制要適宜,使穿著無菌衣的操作人員感到舒適,應能防止污染和交叉污染等等。其中單一因素對無菌操作的具體影響也許并不是很明顯,但如果設施設計不夠全面,這種影響將非常顯著。應重視設計上的細節,減少污染源,以確保無菌生產得以實施。無菌工藝驗證是執行難度較大的驗證之一,參與者應充分意識到設施的設計和確認是驗證成功的主要因素。1.2 公用工程的確認影響產品質量的公用工程如蒸汽、壓縮空氣、加

4、熱、制冷、水系統等都應經過確認。公用工程是生產得以正常實施的保證之一。若其中任何一個系統出現故障,將會使產品發生潛在的或嚴重的污染。應有公用工程的維護計劃并按計劃執行,目的就是不讓系統發生故障,保證生產的順利進行,而不是發生故障后去修理。經常發生故障而被維修的公用工程是不能保證無菌生產的。1.3 設備和工藝確認在本驗證實施之前,所有的設備、無菌環境、計算機控制系統以及生產工藝都應經過驗證。產品暴露是發生污染使無菌工藝驗證失敗的主要原因之一,為防止或降低污染發生的幾率,給暴露產品提供層流空氣的百級層流罩是非常重要的;被滅菌過的物品由滅菌器到生產線的傳遞和經由必要的手工操作進入生產線前的保護也是至

5、關重要的,應盡量避免人員對設備或物料的接觸的操作。這些都應經過驗證。1.4 設備的清洗和滅菌在無菌工藝驗證之前接觸模擬介質的設備表面應清洗滅菌,并防止滅菌后的再污染。若生產的藥品具有抗菌性或者殺菌性,這種清洗尤為重要。若清洗或滅菌不徹底,殘存的藥品會使模擬介質受到污染或設備表面的微生物使模擬介質染菌而使驗證失敗。這種清洗和滅菌過程應經過驗證,能保證清洗徹底和滅菌成功。1.5 模擬介質的選擇選擇的模擬介質應有如下特征:沒有抑菌作用。這是顯而易見的,若模擬介質有抑菌作用,將會對生產系統中的細菌生長產生抑制作用,以至于不能培養出細菌,產生假的結果。模擬介質最好具有促進細菌生長的作用。如果選擇對細菌生

6、長有促進作用的固體培養介質做驗證,對生產環境的保護則特別重要。因為如果有些操作是使介質暴露的,介質的塵粒會飄散在某些較難清洗的地方,如空調系統的送風口和回風口附近,給細菌在該處的滋生創造了條件,所以應有措施保護不易清洗的死角不被介質污染。模擬介質還應在培養基內有較好的溶解度。因為若溶解性能不好,懸浮在培養基中的模擬介質使培養基發生混濁,影響結果的判斷。模擬介質加入培養基后,不應影響培養基的質量,不發生大的變化,以適應大多數細菌的生長。對設備沒有腐蝕性,對人體無害,對環境不發生污染。基于以上分析,通常可供選用的模擬介質有4000、6000、乳糖和甘露醇等。1.6 培養基一般來說,應針對不同的微生

7、物選擇不同的培養基,比如硫乙醇酸鹽培養基適用于需氧菌和厭氧菌,大豆酪蛋白消化物培養基適用于需氧菌和真菌。在無菌工藝驗證中事先不知道系統中存在什么樣的微生物,但分別選擇多種培養基分別做無菌測試也較難做到。應根據實際的生產工藝和生產環境選擇適用于大多數微生物生長的培養基。比較之下,推薦用大豆酪蛋白消化物培養基,因為大多數無菌原料藥的生產都和空氣接觸,污染厭氧菌的幾率很小,而且被污染的微生物大多數為需氧菌或真菌。1.7 模擬介質的滅菌驗證的結果受模擬介質無菌性的影響很大,若不能保證它的無菌性,或在驗證之前受到了污染,則不能保證驗證結果的可信性。模擬介質在使用之前應滅菌。滅菌的方法很多,如射線滅菌,濕

8、熱滅菌等等。不管是哪種滅菌方法,在確定滅菌參數后都應對這種滅菌方法進行驗證。比如驗證射線滅菌,應先測生物負荷量,根據生物負荷量得到所需要的吸收劑量。吸收劑量應經確認,可以用微生物吸收劑量計或者化學吸收劑量計確認吸收劑量。1.8 培養基的滅菌首先選擇一種培養基滅菌的方法。一般地,培養基滅菌方法有射線滅菌法和濕熱滅菌法,選用的滅菌方法應做驗證。培養基滅菌后應做生長促進試驗。根據標準操作規程制備大豆酪蛋白消化物培養基并滅菌,將滅菌后的培養基分裝于預定數量的試管中(此數量應有統計學意義),在一半數量的試管中接枯草芽孢桿菌,接種量<100;在另一半數量的試管中接種白色念珠菌,接種量<100,

9、接種后蓋塞,封口并在32.5±2.5和22.5±2.5分別培養7天,7天內至少50%以上接種的各試管培養基中應出現明顯的所接種微生物生長。2 驗證的實施2.1 標準操作規程的確認以及人員培訓標準操作規程()是指導操作人員進行某項操作的書面程序,是操作人員的操作標準,是生產操作成功的關鍵。標準操作規程應能對操作人員提供足夠的指導以完成本項操作。標準操作規程應由技術人員編寫,部門主管審閱,質量保證部主管批準。將批準后的標準操作規程對操作人員進行培訓,使之真正理解并能熟練掌握。標準操作規程的原件及培訓記錄存放在資料管理部門,操作現場存放的是復印件。驗證前應確認每一項操作有標準可依

10、,以免造成管理上的漏洞,且確認這項操作已被培訓過,且操作人員已能熟練掌握。驗證之前應對所有的操作人員和質量管理人員培訓與驗證有關的各項操作(可根據驗證方案和),以避免驗證過程中有關人員不理解甚至不知道怎么做,保證驗證的順利實施。如果新增加或調換了崗位操作人員,應重新做無菌工藝驗證,以保證無菌操作能順利進行。人是生產中最重要的因素,也是容易被忽略的因素,這一點應特別值得注意。2.2 儀表校正生產中的各項參數都是根據儀表來讀取的,由一個沒有校正過的儀表得到的參數或結果是不可靠的。由沒有校正過的儀表得到錯誤的結果而導致生產中的異常,這樣的情況并不少見。儀表校正應由有資格的人員或單位來進行,并符合國家

11、可追蹤的標準。儀表的校正頻率至少符合國家規定,并要根據使用頻率調整并嚴于此標準。使用頻率越高,儀表的磨損越厲害,校正頻率就應越高。由沒有經過校正的儀表得到的數據無效。2.3 工藝條件無菌原料藥的生產工藝具有其自己的特點:設備種類多,設備復雜,管路長,且不同的生產工藝有不同的特點,根據各自的特點選擇固體或液體模擬介質。雖然盡量減少設備的內部暴露和減少物料產品的暴露,但是不可避免的會有一些設備與外界環境相通,或是物料暴露在環境中,這些開口處應有呼吸器或百級層流空氣的保護。驗證時應有模擬這些物料暴露的操作。有些生產工藝中具有結晶的操作,這使得模擬過程有些困難,因為結晶過程中有相變產生,這種變化是否會

12、影響到微生物的生長是一個值得考慮的問題。最好的辦法是選擇兩種模擬介質,它們在結晶過程發生反應生成另一種模擬介質。選擇這樣的介質可能會有很大困難。簡單起見,也可用同一種液體模擬介質模擬結晶過程流經所有管路加到結晶罐中。若結晶過程有加晶種的操作,模擬過程中也應有這樣的操作。晶種可用模擬介質代替。為使晶體粒度均勻,有些結晶過程有降溫過程,在模擬過程中不應降溫,因為微生物在低溫下不易生長。干燥過程中的溫度一般會抑制微生物生長,甚至將微生物殺死,在模擬過程中應保持室溫,以免溫度太高殺死細菌而使驗證失敗。也有用冷凍干燥除去濕分的,在這種情況下,模擬凍干參數的選擇也不應使細菌的生長受到抑制。總之,在驗證過程

13、中盡量使工藝參數和實際情況一致,但是為了使細菌生長,允許選擇的工藝參數和實際情況不一致,但是這些參數不應和生產工藝產生重大差別。無菌原料藥的分裝劑量一般較大,在這種情況下在分裝過程中應減慢分裝速度,以增加產品暴露的機會,在最差狀況進行操作。2.4 操作時限在原料藥的生產中每一操作都應有操作時限來保證已滅菌的物品避免受到微生物的污染或產品降解。操作時限越長,產品受污染的幾率越大。在無菌工藝驗證時,應將操作時限調整至最大,在最差狀況下操作,如果這時驗證結果是可靠的,那么在小于此時間下進行的操作當然也是可靠的。尤其是已滅菌物品由滅菌到使用時的保存時間更加重要。在驗證時,應將已滅菌物品至少放置到規定的

14、保存時間,這樣的驗證結果更具有說服力。每一步操作都應延長至甚至超過操作時限,這樣會使得總的工藝時間很長,但是這樣的驗證結果更能保證正常生產時的無菌狀態。2.5 環境監測在驗證過程中環境的質量是至關重要的,應在惡劣的環境下進行操作,但是不能惡劣到使產品發生染菌的程度。一般地,采用增加操作人員的數量的辦法惡化環境。應對環境進行監測以評價驗證過程,所有暴露產品的操作都有監測本區域的環境。環境監測包括以下幾個項目:無菌室的溫度、濕度、換氣次數、塵埃粒子、沉降菌、浮游菌、人員和表面微生物。沉降菌和浮游菌用培養皿進行測試,培養基為營養瓊脂。這種方法簡單且價格便宜。培養皿應放置在微生物監測史上情況最差的部位

15、。在驗證過程中應增加取樣的頻率,并且應在分裝區域放有2個以上的取樣培養皿連續暴露取樣,暴露時間應為分裝的全過程,但不宜超過4個小時,否則營養瓊脂變干而不能提供足夠的營養使細菌不能長出。營養瓊脂在使用前應做微生物生長促進試驗,方法同培養基的生長促進試驗,以保證營養瓊脂對微生物生長的適應性。在環境監測中使用了不適當的營養瓊脂培養基,微生物沒有長出來,產生了假的好的結果這種情況也時有發生,這使得生長促進試驗尤為重要。測試浮游菌可以用縫隙-瓊脂撞擊采樣法、離心采樣法、液體撞擊采樣法及膜過濾法。一般說來,浮游菌比沉降菌更能反映環境的質量。表面微生物的測試可用擦拭法或碟。用擦拭法測表面微生物之前應先測回收

16、率。影響回收率的因素很多,包括微生物的種類和數量,不同的操作人員進行測試會得到不同的回收率,主要原因是擦拭時用力的大小,這里建議每個操作人員有自己的回收率數值。測試回收率時不要選擇生命脆弱的微生物,因為這些微生物被擦拭時會死去,產生不可信的結果。用碟測試表面微生物比較方便,但是這種測試會有營養物質殘留在被測試的表面,應清洗干凈,否則這是一個很大的污染。塵埃粒子測試可以采用不同類型的粒子計數器,目前國際上采用,等。塵埃粒子監測的結果應能證明產品暴露的關鍵區域空氣質量達到了100級潔凈區的空氣質量標準。我國有指導環境監測的國家標準,國際上流行的標準是209,它對環境監測及結果評價給出了很詳細的指導

17、。2.6 工藝過程的模擬由于一般原料藥生產工藝都經過結晶過程,其間會發生相變,因此,無菌工藝驗證不可能完全按照原來的實際工藝來進行模擬。可采用分步驟完成的方法:(1)從原材料配制起,以水代料,不加原料,完全用純化水。經過除菌過濾、結晶、過濾、洗滌幾個步驟后,從過濾器底部將水放掉。(2)放掉水后,將過濾器蒸汽滅菌,然后加入滅菌的模擬介質。以下的干燥、粉碎、分裝步驟再按生產工藝進行。生產過程中可能有升溫、降溫過程,此時應注意模擬介質對溫度的敏感性。可通過實驗室考察。2.7 工藝各步驟中的取樣根據各自的生產工藝在每個工藝步驟中比如結晶、過濾、干燥等都應取樣測試無菌,以評價該步驟的無菌性能,為發現解決

18、無菌問題提供足夠的數據指導。取樣頻率和數量應有代表性,否則測試結果失去統計學意義。樣品在從取出到測試的時間里不應被污染,尤其是液體樣品污染的途徑很多可能性很大,諸多因素中時間是一個重要因素,樣品取出后最好立即測試,以免防止時間過長而被微生物污染。2.8 樣品培養陰性對照:在驗證過程中,隨機取出有代表性的一定數量的裝有培養基的包裝容器作為陰性對照。陽性對照:驗證過程中,隨機取出有代表性的一定數量的裝有模擬介質的包裝容器,一半接種濃度為<100個微生物/0.1的枯草芽孢桿菌,另一半接種濃度為<100個微生物/0.1的白色念珠菌。接種后分別在適宜的溫度下培養7天,7天內至少50%的接種包裝容器中有明顯的所接種微生物的生長,以此作為陽性對照。樣品培養:將分裝得到的產品在操作現場灌裝培養基,然后密封,檢查密封性。全部產品應在適宜的溫度下培養14天,14天時檢查培養的全部樣品的微生物生長情況。若發現污染應注明批號,包裝容器號,同時檢查密封情況。若有破損注明原因。污染的樣品應做微生物鑒別,至少鑒別到種。2.9 結果評價在制劑中以污染水平不過0.1%為接受標準,但是在無菌原料藥生產中,包裝單位較大,得到的總分裝容器數一般較小,這使得抽樣測試