1、收稿日期:2006-08-10基金項目:遼寧省水利廳項目(05-08-37作者簡介:趙玉華(1959-,女,教授,主要從事水處理理論與技術研究.文章編號:1671-2021(200703-0482-03影響分光光度法檢測藻類葉綠素a 的因素趙玉華,劉 暢,薛 飛,傅金祥(沈陽建筑大學市政與環境工程學院,遼寧沈陽110168摘 要:目的為檢測藻類葉綠素a 提供可借鑒的依據.方法采用玻璃離心管與塑料離心管,待測液樣在分光光度計中穩定不同時間,在葉綠素a 提取過程中對液樣加以冷藏的方法,進行對比試驗.結果塑料離心管測得的水樣葉綠素a 值,比用玻璃離心管測得的值平均高30.1%.液樣在分光光度計中穩定

2、時間05m in 內,葉綠素a 值隨穩定時間延長而提高,5m in 以后提高速度減緩.冷藏時間在6h 以內,葉綠素a 值平均增加1.92L g #(L #h-1,6h 以后,葉綠素a 值增加速度減緩.結論塑料材料對葉綠素a 值測定有干擾作用,采用塑料離心管測得的水樣葉綠素a 值偏高,建議用玻璃離心管.待測液樣在分光光度計中的穩定時間對藻類葉綠素a 值的測定有影響,如果穩定時間過短,會使測定結果偏低.適合的穩定時間為1020min,在葉綠素a 提取過程中,將液樣適當進行冷藏,可使葉綠素a 充分溶解于溶液中,適合的冷藏時間為68h,供分光光度法檢測藻類葉綠素a 參考.關鍵詞:藻類;葉綠素a;分光光

3、度法檢測;離心管材料中圖分類號:X832 文獻標識碼:A 水中藻類過量繁殖會使水透光性差,影響水生物生長繁殖1.產生藻毒素,危害生物及人類健康2-4.水中藻類的檢測通常采用葉綠素a 法和顯微計數法5-8.國家環境保護局公布的5水和廢水監測分析方法6中規定,葉綠素a 的檢測采用分光光度法9.在試驗過程中發現,規定的操作過程與步驟不盡詳細,使得試驗結果會產生一定的誤差.比如,水樣離心所用的離心管材料、測定吸光度時待測液樣在分光光度計中的穩定時間等,都未做說明.因而,筆者進行了離心管材料、待測液樣穩定時間和葉綠素a 提取過程中加以冷藏的對比試驗,為藻類葉綠素a 的檢測提供可借鑒的依據.1 試驗方法1

4、11 試驗儀器設備抽濾裝置(2XZ-0.5型旋片真空泵,過濾器,直徑35mm 、0.45L m 微孔濾膜(混合纖維,小研缽(配套研杵,臺式離心機,冰箱,9100可見光分光光度計.112 試驗用水試驗用原水取自沈陽建筑大學人工湖.該湖于2003年注入地下水,其作用除用做校園景觀外,還兼養魚類.由于湖水流動性較差,光照充足,以及投放魚食等營養物質,造成藻類繁殖,主要以藍藻為主,湖面水呈綠色,處于富營養化狀態.夏季最高水溫在26e 左右,濁度4.0 6.0NTU,高錳酸鹽指數的質量濃度8.229.45m g #L -1,pH 值6.55左右.113 水樣采集因為藻類基本接近水面的淺層水中生長繁殖1,

5、而且受光照條件和水溫影響,因而,每天在同一時間,同一地點,同一液面深度下采集原水水樣.114 葉綠素a 測定過程水樣用濾膜過濾后,將濾膜放在勻漿器或小2007年05月第23卷第3期 沈陽建筑大學學報(自然科學版Journal of Shenyang Jianzhu U niversity (N atural ScienceM ay 2007V ol 123,No 13研缽內,加90%的丙酮溶液23m L,充分研磨,提取葉綠素a,并將漿液移入離心管中,放入冰箱冷藏一定時間,以使葉綠素a充分提取出來,溫度保持在4e.提取完畢后,以3500r/m in轉速離心分離10min.重復提取過程(不需再冷藏

6、和離心過程1次.將漿液移入比色皿內,放入分光光度計穩定一定時間,分別在750nm、663nm、645 nm、630nm波長下測提取液的吸光度.用下式計算葉綠素a值.Q(葉綠素a=11.64(OD663-OD750-2.16 (OD645-OD750+0.1(OD630-OD750式中,OD為吸光度.在葉綠素a測定過程中,還需要注意以下幾點.(1在將離心管放入離心器中進行離心時,要注意離心管對稱放置,譬如:1-3-5,2-4- 6.否則,會引起離心不均勻,同時會對離心器產生一定的破壞.(2在進行水樣抽濾時,需注意抽濾壓力不高于相當150mm汞柱的壓力,否則,過大的壓力會破壞藻細胞,從而帶來葉綠素

7、a測值的失真10.并且抽濾要在一個避光性好的室內操做,并盡快完成,避免將葉綠素暴露在不必要的光中.2試驗結果討論211離心管材料的影響分別采用塑料離心管和玻璃離心管,對水樣提取液進行離心分離,以探討離心管材料對測定結果的影響.測得的葉綠素a值如圖1所示.從圖中可以看出,采用塑料離心管測得的水樣葉綠素a值,始終高于同樣條件下采用玻璃離心管測得的葉綠素a值,誤差在21.0%43.6%之間,平均誤差30.1%.說明塑料離心管與提取液中的成分發生了某種化學反應,嚴重干擾了葉綠素a值的測定結果.因為丙酮對塑料具有腐蝕性,因此,在離心分離過程中,含有丙酮的提取液溶入了離心管材料成分,使測定結果偏高.212

8、穩定時間的影響將盛有待測溶液的比色皿放入分光光度計中,在不同的穩定時間下讀取吸光度,以確定適合的穩定時間.測得的水樣葉綠素a值見圖1.從圖1中可以看出,葉綠素a隨著穩定時間的延長而增大.在05m in時段,葉綠素a值變化幅度較大,相差49.4%;525min時段,葉綠素a值變化幅度減小,差值在5%以下,逐漸趨于穩定.但由于丙酮具有揮發性,如果穩定時間過長,一旦被檢測液的液面高度低于比色皿高度的2/3,也會使測定結果準確度下降 .圖1葉綠紗a值與離心管材料和穩定時間關系213冷藏時間的影響在葉綠素a提取過程中,采用不同冷藏時間進行對比,以使葉綠素a能完全從藻細胞中分離出來,進入溶液中.將過濾后的

9、濾膜加丙酮溶解,然后將水樣轉移到離心管中,外部罩上避光物放入冰箱內,開始計時,到將離心管從冰箱中取出的時刻結束,這段時間定義為冷藏時間.溫度保持在4e.不同冷藏時間條件下測得的葉綠素a值見圖2.在冷藏時間為06h時段,隨著冷藏時間的延長,葉綠素a值提高很快,從15.27L g#L-1增至24.85L g#L-1,增加67.7%,平均增加1.92L g#(L#h-1;在624h時段,增長趨勢變緩,增加7.44%,平均增加0.10L g#(L#h-1,葉綠素a值基本趨于穩定 .圖2葉綠素a值與冷藏時間的關系3結論(1由于塑料材料對葉綠素a值測定有干擾作用,采用塑料離心管測得的水樣葉綠素a值偏高,建

10、議采用玻璃離心管進行含水藻類葉綠素a 值測定的離心操作.第23卷趙玉華等:影響分光光度法檢測藻類葉綠素a的因素483(2待測液樣在分光光度計中的穩定時間對藻類葉綠素a值的測定有影響,如果穩定時間過短,會使測定結果偏低.建議穩定時間至少5 min,適合的穩定時間為1020min.(3在葉綠素a提取過程中,將液樣適當進行冷藏,可使葉綠素a充分溶解于溶液中,隨著冷藏時間的延長,測定的藻類葉綠素a值增加.適合的冷藏時間為68h.參考文獻:1黃萌.富營養化對水生生態系統的污染生態效應J.科技情報開發與經濟,2006,16(20:137-138.2Paer l H W,Fulton RS3rd,M ois

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12、86.4Zhang M M,Pan U,Yan H,et al.A met hod to ex-tract algae tox in of microcystin-LRJ.Env ironSci.(China,2004,16(4:694-696.5Gregor J,M arsalek B.F reshw ater phytoplanktonquantification by chlo rophyll-a:a comparative studyof in v itro,in viv o and in situ methodsJ.Water Re-search,2004,38(3:517-522.

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14、析方法6編委會.水和廢水監測分析方法M.北京:中國環境科學出版社,2002.10張新,劉洪林,王素芬.分光光度法測定葉綠素a含量的方法探討J.山東水利,2002(3:39-40.Test of Factors Influencing Chlorophyl-l a in Water Algal bySpectrophotometryZH A O Yuhua,L I U Chang,X UE Fei,F U Jinx iang(School of M unicipal and Environmental Engineering,Sheny ang Jianzhu U niv ersity,Shen

15、yang110168,ChinaAbstract:In the paper chlorophyl-l a in water algal is measured by spectrophotometry.Glass centrifuge tube and plastic centrifuge tube are used for separateing algal from w ater.The fluid sam ple is deepfrozen in re-frigeratory under4e for different time during separating chlorophyl-

16、l a from algal.After the fluid sample is put in spectrophotometer for different time,w hich is called stabilization time,the absorbency of the sample is taken.The test result indicates that chlorophyl-l a of fluid sample measured through plastic centrifuge tube is averagely hig her by30.1%than glass

17、 tube because of plastic disturbance.If stabilizing for less than5 minutes chlorophyl-l a of fluid sample increases rapidly along w ith stabilization time increasing.If stabilizing for more than5minute chlorophyl-l a increases very slow ly,so the suitable stabilization time is5minutes to 10minutes.If deepfreezing for less than6hours chlorophyl-l a of fluid sample increases averagely by1.92L g per litre