1、College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)第四章 酶的提取與分離純化1College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎酶提取酶提取酶分離純化酶分離純化酶濃縮酶濃縮酶貯存酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液發(fā)酵液2離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)酶的純化過程，約可分為三個(gè)階段：(1) 粗蛋白質(zhì) (crude protein): 采樣 均質(zhì)打破細(xì)胞 抽出全蛋白，多使用

2、 鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。(2) 部分純化 (partially purified): 初步的純化，使用各鐘 柱層析法。(3) 均質(zhì)酶 (homogeneous): 目標(biāo)酶的進(jìn)一步精制純化，可用制備式電泳 或 HPLC。酶分離純化不同階段College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)第一節(jié) 酶的提取細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生的酶有兩種，一種是胞內(nèi)酶，必須對(duì)菌體進(jìn)行破碎，將酶抽提到液相；另一種是胞外酶，在發(fā)酵時(shí)酶已經(jīng)透過細(xì)胞壁進(jìn)入發(fā)酵液中。4College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué) 一、生物組織的破

3、碎5許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎非機(jī)械破碎DY89-I型 電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)JY92-II D超聲波超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞粉碎機(jī)高壓細(xì)胞破碎機(jī)高壓細(xì)胞破碎機(jī)College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)6細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的堅(jiān)固；酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高

4、。 不同種類的細(xì)胞結(jié)構(gòu)差別很大，破碎的難易程度也不同，由難到易的大致排列順序?yàn)椋褐参锛?xì)胞真菌（如酵母菌）革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌動(dòng)物細(xì)胞。酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法 物理破碎凍融法壓力差破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎滲透作用自溶表面活性劑酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理7College of Life Sc

5、iences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)8分分 類類作作 用用 機(jī)機(jī) 理理適適 應(yīng)應(yīng) 性性機(jī)機(jī)械械法法珠磨法珠磨法固體剪切作用固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法高壓勻漿法液體剪切作用液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和絲狀菌和含有包含體的基因工程菌含有包含體的基因工程菌超聲破碎法超聲破碎法液體剪切作用液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，對(duì)酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作不適合大

6、規(guī)模操作X-pressX-press法法固體剪切作用固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合的產(chǎn)物不適合非非機(jī)機(jī)械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差低，通用性差滲透壓法滲透壓法滲透壓劇烈改變滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法凍結(jié)融

7、化法反復(fù)凍結(jié)反復(fù)凍結(jié)- -融化融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法干燥法改變細(xì)胞膜滲透性改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)破碎率的檢測(cè)直接測(cè)定法采用染色的方法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來。如破碎的革蘭氏陽(yáng)性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。目的產(chǎn)物測(cè)定法將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離細(xì)胞碎片，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或酶）的含量或活性

8、，并與100%破碎率所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比較，計(jì)算其破碎率。導(dǎo)電率測(cè)定法細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線性增加 。9College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)二、酶的提取1、提取的主要方法 大多數(shù)酶蛋白是屬于球蛋白，因此，可用稀鹽，稀堿或稀酸的水溶液進(jìn)行抽提；抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性 ，穩(wěn)定性以及有利于切斷酶與其它物質(zhì)的連結(jié)。（1）鹽溶液提?。?）酸溶液提?。?）堿溶液提?。?）有機(jī)溶劑提取10College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師

9、長(zhǎng)教師教學(xué)11提取方法提取方法使用的溶劑或溶液使用的溶劑或溶液提取對(duì)象提取對(duì)象鹽溶液提取鹽溶液提取0.020.020.5mol/L0.5mol/L的鹽溶的鹽溶液液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶較大的酶酸溶液提取酸溶液提取pH2pH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取堿溶液提取pH8pH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取

10、那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶有較多非極性基團(tuán)的酶酶的主要提取方法College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)2、酶提取過程的注意事項(xiàng)pH的選擇 ：首先考慮酶的穩(wěn)定性；其次應(yīng)遠(yuǎn)離等電點(diǎn)；一般選擇pH4-6為宜。鹽的選擇：大多數(shù)酶在低濃度的鹽溶液中有較大的溶解度，一般選擇等滲鹽溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸緩沖液或0.15 mol/L的NaCl等。溫度的選擇：一般控制在0-4 0C，如果酶比較穩(wěn)定可以例外。抽提液用量：常采用材料量的1-5倍。其它：加入蛋白酶抑制劑，半胱氨酸或細(xì)胞色素C等，來穩(wěn)定

11、抽提系統(tǒng)。12College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)三、酶溶液的絮凝、凈化與脫色絮凝：由于發(fā)酵液黏度較大，細(xì)胞表面電荷排斥以及多糖蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成的水化層等給酶溶液的離心或過濾帶來困難；因此要用絮凝劑進(jìn)行處理。絮凝劑有無機(jī)（如醋酸鈣和磷酸鈣等），有機(jī)（如聚丙烯酰胺等）和天然高分子（如殼多糖等）等多種類型。13College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)絮凝采用絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分離。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對(duì)分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，長(zhǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈

12、節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)，包括帶電荷的陰離子（如-COOH）或陽(yáng)離子（如-NH2）基團(tuán)以及不帶電荷的非離子型基團(tuán)。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)結(jié)時(shí)，就形成了較大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用。 14College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)過濾或離心凈化：通過絮凝劑處理后的酶溶液經(jīng)過離心或過濾將細(xì)胞碎片等固性物和雜蛋白，粘多糖，核酸以及脂類等大分子物質(zhì)去除。脫色：酶的工業(yè)生產(chǎn)中，常用的脫色劑為活性炭，活性炭通過吸附色素而脫色；活性炭用量一般為0.1%-1

13、.5%。15College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)第二節(jié) 酶的分離一、根據(jù)溶解度不同的分離方法調(diào)整溶解度的分離方法是根據(jù)酶和雜蛋白質(zhì)在溶解度性質(zhì)上不同而建立的一些方法。16沉淀分離方法沉淀分離方法分離原理分離原理 鹽析沉淀法鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶

14、解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pHpH值，使酶或雜質(zhì)沉值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而在酶液中加入某些物質(zhì)，

15、使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)1、鹽析(Salting Out)法17在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。 College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué) 在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸

16、鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。 最常用的是硫酸銨。鹽濃度以飽和度表示，飽和鹽溶液的飽和度為100%。調(diào)整鹽濃度有兩種方法：加入飽和硫酸銨溶液（蛋白質(zhì)溶液體積不大時(shí)）和直接加入固體硫酸銨（蛋白質(zhì)溶液體積較大時(shí)）。加入飽和硫酸銨：100mL溶液中，由飽和度S1變?yōu)镾2，應(yīng)向其中加入的飽和硫酸銨溶液的mL數(shù) V= V0（S1-S2）/（1-S2）。直接加入固體硫酸銨可以直接查“調(diào)

17、整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表”。18College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)2等電點(diǎn)沉淀法兩性物質(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，因此可通過此方法使不同等電點(diǎn)的物質(zhì)分離3. 有機(jī)溶劑沉淀法（降低介電常數(shù)法）有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20時(shí)水的介電常數(shù)為80，而82乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時(shí)，對(duì)于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。 19College of Life

18、 Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)20常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等 College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)4復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使其與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱為復(fù)合沉淀法。5選擇性變性沉淀法 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法稱為選擇性變性沉淀法。21College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué) 有些多聚電解質(zhì)可以在極低濃度下選擇性地與某些酶結(jié)合而形成沉淀。如聚丙烯酸（

19、PAA）可以與某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分離過程如下： PAA+酶 PAA-酶 PAA-酶+Ca 2+ PAA- Ca 2+ + 酶 PAA- Ca 2+ + SO4 2- CaSO4 + PAA22第八次課結(jié)束College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)二、離心分離離心分離是借助離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等因子的不同，而使物質(zhì)分離的技術(shù)。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。23College of Life Sciences

20、酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī), 其最大轉(zhuǎn)速在8000 r/min以內(nèi)，相對(duì)離心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。 高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為（12.5）104 r/min ，相對(duì)離心力達(dá)到 11041105 g ，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機(jī)。超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá) (2.512)104 r/min，相對(duì)離心力可以高達(dá) 5105 g甚

21、至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測(cè)；沉降系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定等。24College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)25College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)三、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。26過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì) 膜

22、過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì) College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)27過濾的分類及其特性(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ) 類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾粗濾 2m酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾微濾0.22m細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾超濾200.2m病毒、生物大分子等超濾膜反滲透反滲透 20生物小分子、鹽、離子反滲透膜College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)借助于一定孔徑的高分子薄

23、膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆粒或分子進(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用動(dòng)物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時(shí)選擇。28膜分離加壓膜分離加壓膜分離 微濾微濾超濾超濾反滲透反滲透電場(chǎng)膜分離電場(chǎng)膜分離 電滲析電滲析 離子交換膜電滲析離子交換膜電滲析 擴(kuò)散膜分離擴(kuò)散膜分離 透析透析College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)根據(jù)膜材料和不同進(jìn)料液的特性

24、，商品應(yīng)用的膜產(chǎn)品通常采取如下幾種結(jié)構(gòu)形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。29College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)四、層析分離（ Chromatography）30 層析方法分離依據(jù)吸附層析吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親

25、和層析親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的專一而又可逆的親和力親和力，使生物分子分離純化層析聚焦層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)（一） 吸附層析1. 概況層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的(稱為固定相)，另一個(gè)相則流過此固定相(稱為流動(dòng)相)并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源

26、豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。31College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)2.原理吸附作用是物體表面的一個(gè)重要性質(zhì)，理論上任何兩相都可以形成界面，其中一相的物質(zhì)或溶解在其中的溶質(zhì)在另一相表面上發(fā)生密集行為，稱之為吸附。溶質(zhì)從溶液中到停留在固體表面上的過程，稱為吸附現(xiàn)象。在吸附柱層析中，使用的固定相基質(zhì)是顆粒狀的吸附劑。在吸附劑表面存在許多吸附位點(diǎn)，這些位點(diǎn)通過物理的、化學(xué)的等各種作用力與蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子結(jié)合，其結(jié)合力的大小與各種生物分子的結(jié)構(gòu)和吸附劑的性質(zhì)有密切關(guān)系。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。即

27、被吸附在吸附劑上的物質(zhì)在洗脫劑的作用下解吸而隨溶液向下移動(dòng)，又遇到新的吸附劑，被重新吸附，后面流下的洗脫液再把它解吸而向下流動(dòng)，然后再被下層的吸附劑吸附。如此反復(fù)進(jìn)行，經(jīng)過一段時(shí)間以后，該物質(zhì)向下移動(dòng)段距離。32College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)3常用吸附介質(zhì)及其性質(zhì) (1)活性炭： 活性炭的吸附原理：活性炭對(duì)化合物的吸附機(jī)制主要是活性炭分子中的活性基團(tuán)(如羥基等)與被分離物質(zhì)分子中的某些基團(tuán)產(chǎn)生范德華力形成的吸附作用。 (2) 硅膠：硅膠是以硅酸鹽為原料制成的。硅膠的吸附活性決定于其含水量，不同類型的吸附層析所需硅膠的含水量不同。 (3

28、) 羥基磷灰石（結(jié)晶磷酸鈣）： 磷酸鈣是一種極性吸附介質(zhì)，適于分離生物大分子(如蛋白質(zhì)、核酸等)。除了以上幾種外，常見的還有氧化鋁、聚丙烯酰膠、聚苯乙烯等。33College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)4吸附層析技術(shù)(1) 吸附劑的選擇(2) 溶劑和洗脫劑的選擇吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。34College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)（二）分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互

29、不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。分配系數(shù)與溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，同時(shí)受溫度、壓力、等條件的影響。在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動(dòng)，稱為流動(dòng)相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動(dòng)相的帶動(dòng)流經(jīng)固定相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)分配。紙上層析 分配薄層層析 分配氣相層析 35College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)（三）離子交換層析離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）

30、對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽(yáng)離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。 36College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)離子交換劑的性質(zhì)溶脹系數(shù) ：指每克干的離子交換劑吸附水后膨脹的體積，用mL/g表示。交換容量 ：指離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進(jìn)行交換的能力。比重：離子交換劑經(jīng)過溶脹處理后其

31、比重是恒定的37College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)離子交換劑的選擇 1) 陰陽(yáng)離子交換劑的選擇 2) 強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇 3) 不同離子型交換劑的選擇 4) 不同基質(zhì)離子交換劑的選擇 38College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)39離子交換層析的操作過程1）裝柱2）上柱3）洗脫和收集4）再生College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)（四）凝膠層析凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所

32、含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。1基本原理凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。40College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)41College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與

33、分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)2凝膠過濾技術(shù) (1) 層析介質(zhì)的選擇(2) 柱的選擇3凝膠過濾的應(yīng)用 (1) 脫鹽 (2) 用于分離提純 (3) 測(cè)定高分子物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量 (4) 高分子溶液的濃縮42College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)43常用的凝膠：葡聚糖凝膠瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠 College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)（五）親和層析1原理親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。所謂親和力，是指生物大分子和其配基之間形成可逆結(jié)合的能

34、力。酶與底物,酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段,RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對(duì)。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用。44College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)45酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)載體配體臂待分離組分親和吸附洗滌洗脫再 生雜蛋白目的酶圖4-4 親和分離原理示意圖College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)2親和介質(zhì)親和層析法主要使用的載體有葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、纖維素、多孔

35、硅膠、樹脂等3親和層析方法47根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為：共價(jià)親和層析疏水層析金屬離子親和層析免疫親和層析染料親和層析凝集素親和層析 College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)五、 電泳技術(shù)電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)的過程。而電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。（一）原理帶電粒子在電場(chǎng)中會(huì)受到一個(gè)電場(chǎng)力的作用，從而向與它所帶電荷性質(zhì)相反電極的方向移動(dòng)，同時(shí)它又會(huì)受到摩擦力的作用，當(dāng)這兩種力的大小相等時(shí)，該粒子則以速度v移動(dòng)。48College of

36、 Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)(二) 電泳種類1按分離原理分類 區(qū)帶電泳 移界電泳 穩(wěn)態(tài)電泳2 按有無固體支持物分類 自由電泳 支持物電泳3 按電泳的方式分類 端電極電泳 搭橋電泳 潛水電泳49College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)（三）影響電泳速度的因素1電場(chǎng)強(qiáng)度 電場(chǎng)強(qiáng)度愈高，帶電顆粒泳動(dòng)速度愈快2緩沖溶液的pH值 緩沖溶液的pH值決定帶電顆粒解離的程度，亦即決定其凈電荷的量。3緩沖溶液的離子強(qiáng)度4電滲 在電場(chǎng)中液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲5焦耳熱50College of Life Scie

37、nces酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)（四）所用儀器（五）聚丙烯酰胺凝膠電泳1原理聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide，PAG)是由單體丙烯酰胺(Acrylamide, Acr)和交聯(lián)劑N，N亞甲基雙丙烯酰胺(N，NmehylenebisacrylamNe，簡(jiǎn)稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。51College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)2分離效應(yīng)(1) 濃縮放應(yīng)(2) 電荷效應(yīng)(3) 分子篩效應(yīng)523分類 連續(xù)凝膠電泳 不連續(xù)凝膠電泳 梯度凝膠電泳 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳4操作制膠 預(yù)電泳

38、樣品的處理 電泳 染色脫色 保存College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)（六）等電聚焦電泳在電泳系統(tǒng)中，加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體。當(dāng)接通直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)載體即形成個(gè)由陽(yáng)極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。當(dāng)酶或其他兩性電解質(zhì)進(jìn)入這個(gè)體系時(shí)，不同的兩性電解質(zhì)即移動(dòng)到(聚焦于)與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置，從而使不同等電點(diǎn)的物質(zhì)得以分離。這種電泳技術(shù)稱為等電點(diǎn)聚焦電泳。等電點(diǎn)聚焦電泳的顯著特點(diǎn)等電點(diǎn)聚焦電泳的缺點(diǎn)53College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)六、萃取分離萃取(extraction)是一個(gè)液相(或固相

39、)中的溶質(zhì)經(jīng)過物理或化學(xué)作用轉(zhuǎn)移到另一液相，或在兩相中重新分配的過程。利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法稱為萃取分離。1溶劑萃取法溶劑萃取是用一種溶劑(與水不互溶或基本不互溶)將產(chǎn)物自水溶液(如發(fā)酵液)中提取出來，以達(dá)到濃縮和提純的目的。54College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)料液：溶劑萃取過程中，將供提取的溶液溶質(zhì)：料液中欲提取的物質(zhì)萃取劑：用來進(jìn)行萃取的溶劑萃取液：溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與萃取劑形成的溶液萃余液：被萃取出溶質(zhì)后的料液反萃?。赫{(diào)節(jié)水相條件將產(chǎn)物從有機(jī)相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作55College o

40、f Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)2雙水相萃取法雙水相萃取法又稱水溶液兩相分配技術(shù)，雙水相萃取法的主要優(yōu)點(diǎn)是：每一水相中均有很高的含水量，為酶等生物物質(zhì)提供了一個(gè)良好的環(huán)境；PEG等和無機(jī)鹽對(duì)酶等無毒害作用，不會(huì)引起變性。雙水相萃取中使用的雙水相一般由按一定百分比組成的互不相溶的鹽溶液和高分子溶液或者兩種互不相溶的高分子溶液組成。56College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)57各種雙水相系統(tǒng)聚合物P 聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，

41、葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)3超臨界流體萃取法 超臨界流體：當(dāng)溫度和壓力略超過或靠近某一物質(zhì)的臨界點(diǎn)時(shí)，其性質(zhì)介于液體和氣體之間超臨界流體萃取法也是一種溶劑萃取，以一種在超臨界狀態(tài)下的液體氣體（超臨界流體）為萃取劑。 根據(jù)分離的方法不同，可有三種情況：等壓分離、等溫分離、吸附劑分離。58College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)59流體名稱臨

42、界溫度()臨界壓力(Mpa)臨界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙烯C2H49.95.120.227氨NH3132.411.280.236二氧化碳 CO231.17.380.46二氧化硫 SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326笑氣N2O36.57.170.451氟里昂C28.83.900.578某些超臨界流體的超臨界點(diǎn)和超臨界密度College of Life Sciences酶學(xué)與酶工程酶的提取與分離純化師長(zhǎng)教師教學(xué)4反膠束（團(tuán)）萃取法反膠團(tuán)，又稱反膠束，是指表面活性劑分散在連續(xù)有機(jī)相中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級(jí)的聚集體。反膠團(tuán)萃取法是近年發(fā)展起來的另一種新型萃取分離技術(shù)，在分離生物大分子特別是分離蛋白質(zhì)方面取得了很大的進(jìn)展。反膠團(tuán)萃取法具有成本低、溶劑可反復(fù)使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的優(yōu)點(diǎn)，另外此法還能解決胞內(nèi)酶在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題，而且由于構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑往往具有溶解細(xì)胞的能力，因此可用于直接從完整細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)和酶。60酶學(xué)與