1、.國家基金申請存在國家基金申請存在的問題和對策的問題和對策.申請書需回答的問題申請書需回答的問題l為什么為什么 立項依據(jù)立項依據(jù)l做什么做什么 研究目標、研究內(nèi)容研究目標、研究內(nèi)容l怎么做怎么做 研究方案、技術(shù)路線研究方案、技術(shù)路線l能否做能否做 可行性：工作基礎(chǔ)、工作條件可行性：工作基礎(chǔ)、工作條件.標標 題題一個好的標題等于成功一半一個好的標題等于成功一半確切、醒目、新穎、主題明了確切、醒目、新穎、主題明了 圍繞圍繞“科學問題科學問題” 大小適中，防止大小適中，防止“大題目、小課題大題目、小課題”與與“科學問題科學問題”和和“研究目標研究目標”呼應呼應. 神經(jīng)元凋亡時神經(jīng)元凋亡時SP1對對B

2、H3-only蛋白蛋白Bim的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控細胞凋亡細胞凋亡 時時SP1對對BH3-only蛋白蛋白Bim的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控神經(jīng)元凋亡時神經(jīng)元凋亡時 BH3-only蛋白蛋白Bim的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控神經(jīng)元凋亡時神經(jīng)元凋亡時SP1對對BH3-only蛋白蛋白Bim的的 調(diào)控調(diào)控 SP1對對BH3-only蛋白蛋白Bim的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 SP1對神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用對神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：SP1/Bim /基因調(diào)控基因調(diào)控/信號轉(zhuǎn)導信號轉(zhuǎn)導/神經(jīng)元凋亡神經(jīng)元凋亡 標題標題.摘摘 要要1. 1. 工作基礎(chǔ)工作基礎(chǔ) 繼續(xù)和深入繼續(xù)和深入 發(fā)表和未發(fā)表發(fā)表和未發(fā)表 創(chuàng)新創(chuàng)新2.

3、 2. 科學問題科學問題 重要！不能缺！中肯重要！不能缺！中肯 3. 3. 預實驗預實驗 針對針對“問題問題”的預實驗結(jié)果的預實驗結(jié)果4. 4. 工作假設(shè)工作假設(shè) 思想性、創(chuàng)新性思想性、創(chuàng)新性5. 5. 主要方法主要方法 可靠性第一可靠性第一 先進性第二先進性第二6. 6. 研究目標研究目標 明確、具體明確、具體7. 7. 研究意義研究意義 理論性和應用性理論性和應用性.神經(jīng)元凋亡時神經(jīng)元凋亡時SP1對對BH3-only蛋白蛋白Bim的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 我們已經(jīng)證明了撤鉀誘導神經(jīng)元凋亡時我們已經(jīng)證明了撤鉀誘導神經(jīng)元凋亡時JNK/c-Jun JNK/c-Jun 和和PI3K/Akt/FKHRL

4、1PI3K/Akt/FKHRL1信號通路不參與信號通路不參與BH3BH3onlyonly蛋白蛋白BimBim的上調(diào)。的上調(diào)。 那么，那么，BimBim上調(diào)的轉(zhuǎn)錄機制是什么？啟動子上調(diào)的轉(zhuǎn)錄機制是什么？啟動子5 5末端序列續(xù)減分末端序列續(xù)減分析確立了誘導析確立了誘導BimBim表達的啟動子核心區(qū)，進而發(fā)現(xiàn)一個典型的表達的啟動子核心區(qū)，進而發(fā)現(xiàn)一個典型的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子SP1SP1結(jié)合序列位于其中。進一步實驗顯示：神經(jīng)元凋結(jié)合序列位于其中。進一步實驗顯示：神經(jīng)元凋亡時亡時SP1SP1被激活；負顯性被激活；負顯性SP1SP1和和SP1-DNASP1-DNA結(jié)合抑制劑結(jié)合抑制劑mithramycin

5、mithramycin A A抑制了抑制了BimBim上調(diào)和神經(jīng)元凋亡。由此，我們首次提出了上調(diào)和神經(jīng)元凋亡。由此，我們首次提出了Bim Bim 上上調(diào)的新機制，即：神經(jīng)元凋亡時轉(zhuǎn)錄因子調(diào)的新機制，即：神經(jīng)元凋亡時轉(zhuǎn)錄因子SP1SP1被激活，激活的被激活，激活的SP1SP1直接調(diào)控直接調(diào)控BimBim的誘導表達。本項目擬進一步采用腺病毒表達的誘導表達。本項目擬進一步采用腺病毒表達技術(shù)以及啟動子定點突變、技術(shù)以及啟動子定點突變、EMSAEMSA和和CHIPCHIP方法，旨在獲得方法，旨在獲得SP1SP1直直接調(diào)控接調(diào)控BimBim基因的可靠證據(jù)。本項目將闡明基因的可靠證據(jù)。本項目將闡明SP1SP

6、1對促凋亡蛋白對促凋亡蛋白BimBim的調(diào)控作用和機制、為確立的調(diào)控作用和機制、為確立SP1SP1作為神經(jīng)退行性疾病治療的作為神經(jīng)退行性疾病治療的新靶點提供更充分的科學依據(jù)。新靶點提供更充分的科學依據(jù)。.CaMKII磷酸化磷酸化GSK-3對去極化介導的神經(jīng)元存活的調(diào)控對去極化介導的神經(jīng)元存活的調(diào)控 GSK-3/GSK-3GSK-3/GSK-3是促神經(jīng)元凋亡的重要激酶。研究表明去極是促神經(jīng)元凋亡的重要激酶。研究表明去極化可使化可使GSK-3 Ser21/GSK-3 Ser9GSK-3 Ser21/GSK-3 Ser9發(fā)生磷酸化并抑制其活性，發(fā)生磷酸化并抑制其活性，從而保護性干預凋亡的發(fā)生。但是，

7、去極化時，究竟哪一個激酶從而保護性干預凋亡的發(fā)生。但是，去極化時，究竟哪一個激酶介導了介導了GSK-3GSK-3磷酸化尚不清楚。排除了磷酸化尚不清楚。排除了AKTAKT、PKAPKA、p90RSKp90RSK的參與的參與后，通過底物一致序列分析和抑制劑實驗，我們提出后，通過底物一致序列分析和抑制劑實驗，我們提出CaMKIICaMKII介導介導GSK-3GSK-3磷酸化的可能性。進一步的體外重組激酶反應分析證明，磷酸化的可能性。進一步的體外重組激酶反應分析證明，CaMKIICaMKII可直接磷酸化可直接磷酸化GSK-3 Ser21/GSK-3 Ser9GSK-3 Ser21/GSK-3 Ser9

8、。本項目擬采。本項目擬采用共免疫沉淀、用共免疫沉淀、siRNAsiRNA和激光共聚焦等方法，旨在獲得和激光共聚焦等方法，旨在獲得CaMKIICaMKII與與GSK-3GSK-3直接相互作用的可靠證據(jù)，評價和證實直接相互作用的可靠證據(jù)，評價和證實CaMKIICaMKII磷酸化磷酸化GSK-3GSK-3這一事件在去極化促神經(jīng)元存活效應中的作用。本項目有望揭示這一事件在去極化促神經(jīng)元存活效應中的作用。本項目有望揭示去極化調(diào)控去極化調(diào)控GSK-3GSK-3的新機制，為確立的新機制，為確立GSK-3GSK-3作為神經(jīng)退行性疾病治作為神經(jīng)退行性疾病治療的新靶點提供更充分的科學依據(jù)。療的新靶點提供更充分的科

9、學依據(jù)。 .立項依據(jù)立項依據(jù)？必要性：意義？必要性：意義 價值價值 思想思想 創(chuàng)新創(chuàng)新 2. 2. 誰來做呢？舍我其誰誰來做呢？舍我其誰 3. 3. 科學問題？中肯科學問題？中肯 明確明確 4. 4. 突出自己的工作突出自己的工作 預實驗預實驗 圖文規(guī)范化圖文規(guī)范化 5. 5. 文獻文獻 檔次檔次 時效性時效性 自己的文章自己的文章 規(guī)范化規(guī)范化6. 主線清楚主線清楚 深入淺出深入淺出 通俗易懂通俗易懂.Fig.6 Mithramycin A, a SP1-DNA binding inhibitor, attenuates bim upreguation by activity depriva

10、tion in CGNs. (A) Mithramycin A attenuates the upregulation of BimEL induced by activity deprivation in a dose dependent manner. CGNs were placed in 25K or 5K media in the absence or presence of mithramycin A at the indicated concentrations for 6 h. BimEL expression was assessed by Western blot as d

11、escribed in Fig.1(A). Results shown are representative of four separate experiments. (B) Mithramycin A inhibits the increase in bim mRNA level in a dose-dependent manner. Neurons were treated as described in (A), bim and actin mRNAs were determined by RT-PCR, Results shown are representative of five

12、 separate experiments. (C) Mithramycin A suppresses the activation of bim promoter induced by activity deprivation. Neurons were co-transfected with bim-Luc and pEF-RL for 8 hr. Luciferase activities were measured as described in Fig.2, The experiments were repeated three times with duplicates for e

13、ach treatment. The data represent S.E.M. of three experiments. .參參 考考 文文 獻獻1. Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu,Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and Mingtao Li. Activity deprivation-dependent induction of the proap

14、optotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375：7-12. 2. Wenya Wang, Leyu Shi, Yuanbin Xie, Chi Ma, Wenming Li, Xingwen Su, Shoujian Huang, Ruzhu Chen, Zhenyu Zhu, Zixu Mao, Yifan Han and Mingtao Li. SP60012

15、5, a new JNK inhibitor, protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinsons disease. Neurosci Res 2004；48:195-202 .研究內(nèi)容、研究目標與研究內(nèi)容、研究目標與擬解決的關(guān)鍵問題擬解決的關(guān)鍵問題.要求：明確要求：明確 具體具體 解決學術(shù)問題為目的解決學術(shù)問題為目的 研究目標研究目標題目題目：神經(jīng)元凋亡時：神經(jīng)元凋亡時SP1對對BH3-only蛋白蛋白Bim的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控實例：獲得實例：獲得SP1直接調(diào)控直接調(diào)控bim基因表達的可基因表達的可靠證據(jù)，闡明促凋亡蛋白

16、靠證據(jù)，闡明促凋亡蛋白Bim由由SP1轉(zhuǎn)錄調(diào)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的新機制，為確立控的新機制，為確立SP1作為神經(jīng)退行性疾作為神經(jīng)退行性疾病治療的新靶點提供更充分的科學依據(jù)。病治療的新靶點提供更充分的科學依據(jù)。. 研究內(nèi)容研究內(nèi)容 （圍繞研究目標）（圍繞研究目標） 1. 證明證明bim啟動子核心區(qū)的啟動子核心區(qū)的SP1結(jié)合序列是否介導了結(jié)合序列是否介導了bim基因的基因的上調(diào)上調(diào) 為了證實為了證實bim啟動子核心區(qū)的啟動子核心區(qū)的SP1結(jié)合序列是否介導了結(jié)合序列是否介導了bim基因的上調(diào)，將其基因的上調(diào)，將其中的中的SP1結(jié)合序列進行點突變，使其不能結(jié)合結(jié)合序列進行點突變，使其不能結(jié)合SP1；確定這一突變是

17、否能夠消除；確定這一突變是否能夠消除bim啟動子的撤鉀反應。啟動子的撤鉀反應。 2. 分析分析SP1 是否能夠與是否能夠與bim啟動子核心區(qū)的啟動子核心區(qū)的SP1結(jié)合序列結(jié)合結(jié)合序列結(jié)合 應應用用EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)技術(shù)，證實技術(shù)，證實bim啟動子核心區(qū)的啟動子核心區(qū)的SP1 結(jié)結(jié)合序列是否能夠與合序列是否能夠與SP1結(jié)合；進一步采用結(jié)合；進一步采用CHIP(Chromatin immunoprecipitation)方法，方法，獲得獲得SP1與與bim啟動子核心區(qū)在細胞內(nèi)結(jié)合的證據(jù)。啟動子核心區(qū)在細胞內(nèi)結(jié)合的證據(jù)。 3. 從從

18、 bim 的的mRNA 和蛋白質(zhì)水平，觀察負顯性和蛋白質(zhì)水平，觀察負顯性SP1是否能夠抑是否能夠抑制撤鉀誘導的制撤鉀誘導的bim基因的上調(diào)基因的上調(diào) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CGNs的轉(zhuǎn)染率只能達到的轉(zhuǎn)染率只能達到0.1-1.0 %，腺病，腺病毒的感染率可達毒的感染率可達7080%1。 因此，構(gòu)建因此，構(gòu)建dnSP1的腺病毒載體的腺病毒載體Ad-dnSP1，感染，感染CGNs才能達到才能達到可靠分析可靠分析bim的的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平改變的目的。和蛋白質(zhì)表達水平改變的目的。 4. 4. 分析分析SP1誘導誘導Bim這一機制對神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用這一機制對神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用 確立確立SP1轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)

19、錄激活激活bim這一機制后，進一步分析這一機制對神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用。這一機制后，進一步分析這一機制對神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用。 .l項目需求為前提項目需求為前提l可靠性第一，先進性第二可靠性第一，先進性第二l參考文獻參考文獻l突出關(guān)鍵技術(shù)的描述突出關(guān)鍵技術(shù)的描述l不主張使用流程圖，建議開頭：不主張使用流程圖，建議開頭：“有關(guān)方法、有關(guān)方法、技術(shù)路線、實驗手段、關(guān)鍵技術(shù)綜述如技術(shù)路線、實驗手段、關(guān)鍵技術(shù)綜述如下下” 研究方案研究方案.基本方法基本方法 大鼠小腦顆粒神經(jīng)元培養(yǎng)、大鼠小腦顆粒神經(jīng)元培養(yǎng)、Western blot、RTPCR、鈣磷沉淀法轉(zhuǎn)染基因、轉(zhuǎn)基因神、鈣磷沉淀法轉(zhuǎn)染基因、轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元

20、的凋亡分析、報道基因表達分析、免疫沉經(jīng)元的凋亡分析、報道基因表達分析、免疫沉淀等基本方法均按我們報道淀等基本方法均按我們報道1, 2, 3, 4, 5, 6的進行。的進行。 .負顯性負顯性SP1腺病毒腺病毒(Ad-dnSP1)載體載體的構(gòu)建、擴增、純化和保存的構(gòu)建、擴增、純化和保存 為了達到在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平（而不僅僅是人工的報道基因水平）觀察dnSP1是否能夠抑制撤鉀誘導bim基因的上調(diào)的目的，必須保證dnSP1導入CGNs有較高的導入率?，F(xiàn)有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CGNs方法的轉(zhuǎn)染率只能達到0.1-1.0 %，而在方法得當?shù)那闆r下（見后）腺病毒的感染率可達7080%1。因此，dnSP1的腺病毒載

21、體Ad-dnSP1的構(gòu)建是采用RTPCR和Western blot分析bim的mRNA和蛋白質(zhì)的前提。 腺病毒的擴增和純化按本人報道的進行1。腺病毒的活性高低是決定能否對CGNs達到7080感染率的關(guān)鍵，而正確的腺病毒保存條件又是其活性高低的決定因素。我們曾經(jīng)研究過儲存條件對腺病毒感染CGNs的影響，并制定了腺病毒的最佳儲存條件，即小量分裝后置于20C/20%甘油或80C/50%甘油，一月內(nèi)可保證感染率在70-80%。.申請者簡歷申請者簡歷申請者和項目組主要成員申請者和項目組主要成員 l學歷學歷l研究簡歷研究簡歷l文章目錄文章目錄l學術(shù)獎勵學術(shù)獎勵l承擔的任務承擔的任務.黎明濤黎明濤 (Li

22、Mingtao) 項目負責人，中山大學中山醫(yī)學院藥理教研室教授，博士生導師，中項目負責人，中山大學中山醫(yī)學院藥理教研室教授，博士生導師，中山醫(yī)學院蛋白質(zhì)組學實驗室主任。山醫(yī)學院蛋白質(zhì)組學實驗室主任。1996年獲得博士學位，在美國科羅拉多年獲得博士學位，在美國科羅拉多大學從事大學從事2年博士后工作。學科專業(yè)為分子神經(jīng)生物學與蛋白質(zhì)組學，主年博士后工作。學科專業(yè)為分子神經(jīng)生物學與蛋白質(zhì)組學，主要研究領(lǐng)域是神經(jīng)元凋亡的信號轉(zhuǎn)導、基因調(diào)控和蛋白質(zhì)組學。近年來發(fā)要研究領(lǐng)域是神經(jīng)元凋亡的信號轉(zhuǎn)導、基因調(diào)控和蛋白質(zhì)組學。近年來發(fā)表表SCI文章文章36篇，其中作為第一作者或通訊作者在篇，其中作為第一作者或通訊

23、作者在J Biol Chem, Mol Cell Biol, J Neurosci, Neuropharmacology和和 Neuroscience等雜志上發(fā)表了等雜志上發(fā)表了12篇篇論文，并在論文，并在Drug News Perspect上發(fā)表了相關(guān)專題綜述。上發(fā)表了相關(guān)專題綜述。 近五年來，作為第一主持人獲得了近五年來，作為第一主持人獲得了2項國家自然科學基金面上項目，項國家自然科學基金面上項目，已結(jié)題已結(jié)題1項；項；1項國家自然科學基金廣東省自然科學聯(lián)合基金。在研項目項國家自然科學基金廣東省自然科學聯(lián)合基金。在研項目進行順利。進行順利。發(fā)表的相關(guān)論文發(fā)表的相關(guān)論文 1. Ma C, Y

24、ing C, Yuan Z, Song B, Li D, Liu Y, Lai B, Li W, Chen R, Ching YP, Li M. dp5/HRK is a c-Jun target gene and required for apoptosis induced by potassium deprivation in cerebellar granule neurons. J Biol Chem. 2007;282(42):30901-30909. 2.Mei Y, Yuan Z, Song B, Li D, Ma C, Hu C, Ching YP, Li M. Activat

25、ing transcription factor 3 up-regulated by c-Jun NH(2)-terminal kinase/c-Jun contributes to apoptosis induced by potassium deprivation in cerebellar granule neurons. Neuroscience. 2008;151(3):771-779. 3.Wang W, Yang Y, Ying C, Li W, Ruan H, Zhu X, You Y, Han Y, Chen R, Wang Y, Li M. Inhibition of gl

26、ycogen synthase kinase-3beta protects dopaminergic neurons from MPTP toxicity. Neuropharmacology. 2007;52(8):1678-1684. 4. 皮榮標皮榮標(Pi Rongbiao) 33歲，博士學位，講師。歲，博士學位，講師。2002年畢業(yè)于中山大學，獲神經(jīng)藥理學博士。年畢業(yè)于中山大學，獲神經(jīng)藥理學博士。同年赴香港科技大學生物化學系從事博士后研究，現(xiàn)在中山大學藥學院任同年赴香港科技大學生物化學系從事博士后研究，現(xiàn)在中山大學藥學院任講師。主要研究興趣涉及神經(jīng)保護藥物的作用及其機制的研究。曾負責

27、或講師。主要研究興趣涉及神經(jīng)保護藥物的作用及其機制的研究。曾負責或參加包括國家自然科學基金等多項研究。已發(fā)表或待發(fā)表論著近參加包括國家自然科學基金等多項研究。已發(fā)表或待發(fā)表論著近20篇，其篇，其中中SCI論文論文5篇。篇。 皮博士與本人合作達皮博士與本人合作達11年，有共同的研究趣向，作為共同作者發(fā)表多年，有共同的研究趣向，作為共同作者發(fā)表多篇篇SCI論文。他掌握了本項目涉及的大部分實驗方法和技術(shù)，尤其在腺病論文。他掌握了本項目涉及的大部分實驗方法和技術(shù)，尤其在腺病毒載體構(gòu)建方面積累了經(jīng)驗（見文章）。主要負責腺病毒載體構(gòu)建等工作。毒載體構(gòu)建方面積累了經(jīng)驗（見文章）。主要負責腺病毒載體構(gòu)建等工作

28、。 發(fā)表的相關(guān)論文發(fā)表的相關(guān)論文 1. Rongbiao Pi, Wenming Li, Nelson T.K.Lee, Hugh H.N.Chan, Yongmei Pu, Ling Nga Chan, Nikolaus J. Sucher, Doanld C. Chang, Mingtao Li and Yifan Han. Minocycline prevents glutamate-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by differential regulation of p38 and Akt pathways. J N

29、eurochem. 2004, 91:1212-1230. 2. 3. .項目組主要成員項目組主要成員.經(jīng)費申請表經(jīng)費申請表.申請項目同行評議意見反饋信 黎明濤先生：黎明濤先生： 您好！您申請的項目經(jīng)專家投票表決，同意資助您好！您申請的項目經(jīng)專家投票表決，同意資助。關(guān)于你的項目的同行關(guān)于你的項目的同行評議意見如下：評議意見如下： 1. 本項目在小腦顆粒細胞撤鉀的離體凋亡模型中，發(fā)現(xiàn)了一種直接調(diào)節(jié)本項目在小腦顆粒細胞撤鉀的離體凋亡模型中，發(fā)現(xiàn)了一種直接調(diào)節(jié)Bim的新轉(zhuǎn)錄因子的新轉(zhuǎn)錄因子SP1，申請人試圖采用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)、基因突變以及分子生物，申請人試圖采用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)、基因突變以及分子生物學

30、方法進一步論證學方法進一步論證SP1是直接調(diào)控是直接調(diào)控bim基因的這一假說。立項具有前言性，申基因的這一假說。立項具有前言性，申請人工作基礎(chǔ)好，并與美國請人工作基礎(chǔ)好，并與美國Emory大學、香港大學有長期的合作條件，完全大學、香港大學有長期的合作條件，完全能夠完成本項課題。建議優(yōu)先資助。能夠完成本項課題。建議優(yōu)先資助。 2. 本項課題的立項依據(jù)較為充分，具有一定的學術(shù)創(chuàng)新及科學意義。研究本項課題的立項依據(jù)較為充分，具有一定的學術(shù)創(chuàng)新及科學意義。研究內(nèi)容明確、技術(shù)路線清晰、研究方法和方案可行。申請者有較高的學術(shù)水平，內(nèi)容明確、技術(shù)路線清晰、研究方法和方案可行。申請者有較高的學術(shù)水平，以及多次

31、主持國家自然科學基金課題的經(jīng)驗。同時，申請者所在單位又有比以及多次主持國家自然科學基金課題的經(jīng)驗。同時，申請者所在單位又有比較好的實驗室及條件。建議給予資助。較好的實驗室及條件。建議給予資助。 3. 課題研究具有較好的工作基礎(chǔ)，研究具有較高的學術(shù)價值，建議資助。課題研究具有較好的工作基礎(chǔ)，研究具有較高的學術(shù)價值，建議資助。 4. 同意資助。理由：該項目立論依據(jù)充分，其重要的意義表現(xiàn)在澄清撤鉀同意資助。理由：該項目立論依據(jù)充分，其重要的意義表現(xiàn)在澄清撤鉀誘導神經(jīng)元凋亡時，誘導神經(jīng)元凋亡時，Bim上調(diào)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制。申請者有較好的研究基上調(diào)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制。申請者有較好的研究基礎(chǔ)和研究能

32、力，項目的內(nèi)容設(shè)置合適，重點突出，總體方案合理，技術(shù)路線礎(chǔ)和研究能力，項目的內(nèi)容設(shè)置合適，重點突出，總體方案合理，技術(shù)路線可行，可資助?？尚校少Y助。 5. This is a nicely writen proposal with a clear aim and practical approaches. Further, the group has published results related to the current proposal, indicating the ability of the group to perform the experiments. .申請項目同行

33、評議意見反饋信 黎明濤先生：黎明濤先生： 您好。您申請的項目經(jīng)專家投票表決，同意資助。您好。您申請的項目經(jīng)專家投票表決，同意資助。 關(guān)于你的項目的關(guān)于你的項目的同行評議意見如下：同行評議意見如下： 1. 在神經(jīng)退行性疾病的病理過程中，在神經(jīng)退行性疾病的病理過程中，GSK-3是介導神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵性激是介導神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵性激酶之一，闡明其信號傳導機制將有助于今后臨床藥物的開發(fā)，可以通過酶之一，闡明其信號傳導機制將有助于今后臨床藥物的開發(fā)，可以通過藥物干擾其上游激酶的活性而改變藥物干擾其上游激酶的活性而改變GSK-3活性，從而抑制疾病過程中特活性，從而抑制疾病過程中特異神經(jīng)元的凋亡。具有重要的科

34、學意義。項目組的研究能力強，研究方異神經(jīng)元的凋亡。具有重要的科學意義。項目組的研究能力強，研究方案合理，重點突出，建議優(yōu)先資助。案合理，重點突出，建議優(yōu)先資助。 2. GSK-3是一個重要的粗神經(jīng)元凋亡的激酶。在神經(jīng)退行病的病理發(fā)生是一個重要的粗神經(jīng)元凋亡的激酶。在神經(jīng)退行病的病理發(fā)生中可能起重要作用。申請人采用該酶抑制劑進行了神經(jīng)保護及其機制的中可能起重要作用。申請人采用該酶抑制劑進行了神經(jīng)保護及其機制的分析，并深入提出本項目的研究。立題依據(jù)較充分，研究內(nèi)容和設(shè)計較分析，并深入提出本項目的研究。立題依據(jù)較充分，研究內(nèi)容和設(shè)計較合理，結(jié)合本人的工作基礎(chǔ)，和上一項目完成的情況，建議考慮資助。合理

35、，結(jié)合本人的工作基礎(chǔ)，和上一項目完成的情況，建議考慮資助。 .3. GSK-3/GSK-3是促神經(jīng)元凋亡的重要激酶，去極化可使其磷酸化并抑制其活是促神經(jīng)元凋亡的重要激酶，去極化可使其磷酸化并抑制其活性，從而抑制凋亡的發(fā)生。但目前對性，從而抑制凋亡的發(fā)生。但目前對GSK-3 磷酸化的上游激酶尚不清楚。該課題組磷酸化的上游激酶尚不清楚。該課題組的前期研究提示的前期研究提示CaMKII 可能介導了可能介導了GSK-3 的磷酸化。該項目擬進一步證實的磷酸化。該項目擬進一步證實CaMKII 與與GSK-3 的直接相互作用及在去極化促神經(jīng)元存活效應中的作用，有望揭的直接相互作用及在去極化促神經(jīng)元存活效應中

36、的作用，有望揭示去極化調(diào)控示去極化調(diào)控GSK-3 的新機制，為確立的新機制，為確立GSK-3 作為神經(jīng)退行性疾病治療的新靶點作為神經(jīng)退行性疾病治療的新靶點提供更充分的科學依據(jù)。立題新穎，研究內(nèi)容合適，研究方案可行。申請人及課題提供更充分的科學依據(jù)。立題新穎，研究內(nèi)容合適，研究方案可行。申請人及課題組人員研究能力強，工作基礎(chǔ)好。組人員研究能力強，工作基礎(chǔ)好。 4. 神經(jīng)元凋亡是神經(jīng)退行性疾病等神經(jīng)系統(tǒng)疾患的重要原因，該申請擬研究神經(jīng)元凋亡是神經(jīng)退行性疾病等神經(jīng)系統(tǒng)疾患的重要原因，該申請擬研究CaMKII磷酸化磷酸化GSK3對去極化介導的神經(jīng)元存活的調(diào)控作用及其機制，具有重對去極化介導的神經(jīng)元存活

37、的調(diào)控作用及其機制，具有重要科學意義與研究價值。項目在要科學意義與研究價值。項目在GSK3神經(jīng)元凋亡中作用的原有發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，提神經(jīng)元凋亡中作用的原有發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，提出的出的GSK3磷酸化及其具體信號通路的工作假設(shè)具有很強的創(chuàng)新性與系統(tǒng)性。研磷酸化及其具體信號通路的工作假設(shè)具有很強的創(chuàng)新性與系統(tǒng)性。研究目標明確，研究內(nèi)容恰當，關(guān)鍵科學問題把握準確。展示的預實驗結(jié)果，顯示了究目標明確，研究內(nèi)容恰當，關(guān)鍵科學問題把握準確。展示的預實驗結(jié)果，顯示了申請者在申請者在GSK3信號轉(zhuǎn)導通路方面扎實的工作基礎(chǔ)與研究方案的合理可行。申請信號轉(zhuǎn)導通路方面扎實的工作基礎(chǔ)與研究方案的合理可行。申請者曾經(jīng)主持并很好完成國

38、家自然科學基金，在國際重要學術(shù)刊物發(fā)表多篇學術(shù)論文，者曾經(jīng)主持并很好完成國家自然科學基金，在國際重要學術(shù)刊物發(fā)表多篇學術(shù)論文，體現(xiàn)了突出的研究實力。建議優(yōu)先資助。體現(xiàn)了突出的研究實力。建議優(yōu)先資助。 5. 該項目旨在探討去極化時該項目旨在探討去極化時GSK3的磷酸化及其相關(guān)激酶信號通路與神經(jīng)元存活關(guān)的磷酸化及其相關(guān)激酶信號通路與神經(jīng)元存活關(guān)聯(lián)性，申請人擬運用生物化學、細胞生物學手段進行研究。選題創(chuàng)新性強，研究內(nèi)聯(lián)性，申請人擬運用生物化學、細胞生物學手段進行研究。選題創(chuàng)新性強，研究內(nèi)容較系統(tǒng)，研究重點突出，所選擇的關(guān)鍵問題準確?？傮w研究方案合理，研究方法容較系統(tǒng)，研究重點突出，所選擇的關(guān)鍵問題準

39、確?？傮w研究方案合理，研究方法和手段先進，技術(shù)路線可行。項目有相關(guān)的工作基礎(chǔ)，研究隊伍結(jié)構(gòu)合理，具備相和手段先進，技術(shù)路線可行。項目有相關(guān)的工作基礎(chǔ)，研究隊伍結(jié)構(gòu)合理，具備相應研究的工作條件。經(jīng)費預算合理，建議優(yōu)先資助。應研究的工作條件。經(jīng)費預算合理，建議優(yōu)先資助。.獲得資助的決定因素獲得資助的決定因素l科學問題，創(chuàng)新性科學問題，創(chuàng)新性l工作基礎(chǔ)、工作基礎(chǔ)、SCISCI文章文章l依據(jù)充分依據(jù)充分l目標明確目標明確l研究內(nèi)容具體研究內(nèi)容具體l技術(shù)路線清晰技術(shù)路線清晰l重點突出、方案合理重點突出、方案合理l國際合作國際合作.可行性分析可行性分析 從學術(shù)思想角度提出從學術(shù)思想角度提出 1. 工作基礎(chǔ)

40、工作基礎(chǔ) （學術(shù)思想）（學術(shù)思想） 2. 科研梯隊科研梯隊 3. 實驗條件實驗條件 4. 實驗技術(shù)實驗技術(shù) 5. 交流與合作（國內(nèi)、國外）交流與合作（國內(nèi)、國外）. 申請人觀察到內(nèi)源性大麻素（申請人觀察到內(nèi)源性大麻素（Endocannabinoids,eCBs, 如如2AG）可抑制）可抑制COX-2的表達，并根據(jù)的表達，并根據(jù)eCBs保護神經(jīng)元這保護神經(jīng)元這一事實（已有報道），推測或假設(shè)一事實（已有報道），推測或假設(shè)eCBs可能是通過抑制可能是通過抑制COX-2發(fā)揮其保護神經(jīng)元的作用。項目不僅想證實這一假發(fā)揮其保護神經(jīng)元的作用。項目不僅想證實這一假設(shè)，而且想進一步闡明設(shè)，而且想進一步闡明eCB

41、s抑制抑制COX-2的分子機制。但是，的分子機制。但是，不知申請人是否已有不知申請人是否已有COX-2介導神經(jīng)元損傷的證據(jù)？這一介導神經(jīng)元損傷的證據(jù)？這一資料的缺失使得立項依據(jù)不很充分。另外，申請人沒有明資料的缺失使得立項依據(jù)不很充分。另外，申請人沒有明確、具體的指出研究確、具體的指出研究eCBs抑制抑制COX-2機制的切入點。最近，機制的切入點。最近，已有報道，已有報道，eCBs通過通過PI3K/Akt通路保護神經(jīng)元（通路保護神經(jīng)元（Selective CB2 receptor agonism protects central neurons from remote axotomy-indu

42、ced apoptosis through the PI3K/Akt pathway.J Neurosci. 2009，29:4564-70）。申請人是否要）。申請人是否要避免思維定勢形成，改變些思路？考慮到申請人作為第一避免思維定勢形成，改變些思路？考慮到申請人作為第一作者發(fā)表了作者發(fā)表了5篇篇SCI文章，且剛從美國回來，急需基金支持，文章，且剛從美國回來，急需基金支持，建議資助。建議資助。 . 項目創(chuàng)新性不明顯，研究目標或科學問題不明確，項目創(chuàng)新性不明顯，研究目標或科學問題不明確，申請書撰寫非常凌亂，沒有條理。項目涉及到腺申請書撰寫非常凌亂，沒有條理。項目涉及到腺病毒技術(shù)、病毒技術(shù)、ChI

43、P方法、質(zhì)粒構(gòu)建、方法、質(zhì)粒構(gòu)建、RT-PCR、報道、報道基因分析和蛋白蛋白作用等分子生物學手段，基因分析和蛋白蛋白作用等分子生物學手段，但從簡歷或以前文章的發(fā)表記錄看，申請人沒有但從簡歷或以前文章的發(fā)表記錄看，申請人沒有這方面的經(jīng)驗，其分子生物學基礎(chǔ)十分薄弱。因這方面的經(jīng)驗，其分子生物學基礎(chǔ)十分薄弱。因此，可行性極差。此外，申請人獲得題為此，可行性極差。此外，申請人獲得題為“MRTF-A與與ERK相互作用對腦缺血相互作用對腦缺血.”的面上的面上項目，在研。我甚至擔心這個在研的項目都不能項目，在研。我甚至擔心這個在研的項目都不能完成。最后，申請人沒有在主流完成。最后，申請人沒有在主流SCI期刊

44、上發(fā)表過期刊上發(fā)表過文章。不予資助。文章。不予資助。 .交流與合作交流與合作 我們與國際同行建立了良好的交流渠道， 與毛子旭(Zixu Mao, Associate Professor， Brown University， 現(xiàn)在Emory University)、韓怡凡(Yifan Han, Associate Professor，Hong Kong University of Science and Technology)一直保持密切合作關(guān)系，我們已經(jīng)共同發(fā)表了多篇SCI論文（見工作基礎(chǔ)中的參考文獻），在人員、信息、試劑和載體等多方面真正做到了互通和互惠。本人將此視為完成本項目的寶貴條件之一

45、。 . 創(chuàng)新是靈魂，是評議和能否批準的關(guān)鍵創(chuàng)新是靈魂，是評議和能否批準的關(guān)鍵 創(chuàng)新：學術(shù)創(chuàng)新，思想創(chuàng)新創(chuàng)新：學術(shù)創(chuàng)新，思想創(chuàng)新 新的理論新的理論 新的方法新的方法 新的體系新的體系 新的規(guī)律新的規(guī)律 源頭創(chuàng)新：原始性源頭創(chuàng)新：原始性 唯一性唯一性 源頭：有進一步發(fā)展的前景源頭：有進一步發(fā)展的前景創(chuàng)創(chuàng) 新新 性性.本項目的特色與創(chuàng)新本項目的特色與創(chuàng)新 申請人首次報道了神經(jīng)元凋亡時促凋亡蛋白申請人首次報道了神經(jīng)元凋亡時促凋亡蛋白BimBim上調(diào)是不依賴上調(diào)是不依賴于于JNK/c-JunJNK/c-Jun通路通路(Leyu Shi,et al, Neurosci Lett. 2005)(Leyu S

46、hi,et al, Neurosci Lett. 2005)一觀察一觀察之后，又以可靠的實驗結(jié)果證明之后，又以可靠的實驗結(jié)果證明PI3K/Akt/FKHRL1PI3K/Akt/FKHRL1信號通路也不參信號通路也不參與與bimbim的上調(diào)（見立項依據(jù)）。的上調(diào)（見立項依據(jù)）。 bimbim上調(diào)的轉(zhuǎn)錄機制是什么？我們率先對上調(diào)的轉(zhuǎn)錄機制是什么？我們率先對bimbim啟動子進行了啟動子進行了5 5末末端序列續(xù)減分析，確立了誘導端序列續(xù)減分析，確立了誘導bimbim表達的啟動子核心區(qū)，表達的啟動子核心區(qū)， 進而發(fā)現(xiàn)進而發(fā)現(xiàn)一個典型的轉(zhuǎn)錄因子一個典型的轉(zhuǎn)錄因子SP1SP1結(jié)合序列位于其中。進一步實驗顯

47、示：神結(jié)合序列位于其中。進一步實驗顯示：神經(jīng)元凋亡時經(jīng)元凋亡時SP1SP1被激活；負顯性被激活；負顯性SP1SP1突變體和突變體和SP1-DNASP1-DNA結(jié)合抑制劑結(jié)合抑制劑mithramycin Amithramycin A可抑制可抑制bimbim的上調(diào)。根據(jù)以上生物信息學分析和實驗的上調(diào)。根據(jù)以上生物信息學分析和實驗觀察，我們首次提出了觀察，我們首次提出了SP1SP1介導介導bimbim上調(diào)這一新的上調(diào)這一新的bimbim轉(zhuǎn)錄機制：神轉(zhuǎn)錄機制：神經(jīng)元凋亡時轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)元凋亡時轉(zhuǎn)錄因子SP1SP1被激活，激活的被激活，激活的SP1SP1與與bimbim啟動子核心區(qū)的啟動子核心區(qū)的SP1SP

48、1結(jié)合序列結(jié)合，從而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)合序列結(jié)合，從而轉(zhuǎn)錄激活bimbim的表達。的表達。 本項目擬進一步采用負顯性本項目擬進一步采用負顯性SP1SP1突變體的腺病毒表達技術(shù)以及突變體的腺病毒表達技術(shù)以及啟動子點突變、啟動子點突變、EMSAEMSA和和CHIPCHIP方法，旨在獲得方法，旨在獲得SP1SP1直接調(diào)控直接調(diào)控bimbim基因的基因的可靠證據(jù)，為闡明可靠證據(jù)，為闡明SP1SP1對促凋亡蛋白對促凋亡蛋白BimBim的調(diào)控作用和機制并進一步的調(diào)控作用和機制并進一步確立確立SP1SP1作為神經(jīng)退行性疾病治療的新靶點提供更充分的科學依據(jù)作為神經(jīng)退行性疾病治療的新靶點提供更充分的科學依據(jù)。 . 研究

49、基礎(chǔ)與工作條件研究基礎(chǔ)與工作條件 突出與項目相關(guān)的工作積累突出與項目相關(guān)的工作積累l研究基礎(chǔ)研究基礎(chǔ) 已取得的研究工作成績及與本項目已取得的研究工作成績及與本項目有關(guān)的研究工作積累有關(guān)的研究工作積累( (對于自由申請項目，著重對于自由申請項目，著重填寫申請人近期的主要工作業(yè)績；對于重點項目，填寫申請人近期的主要工作業(yè)績；對于重點項目，請著重填寫本課題組與本項目相關(guān)的研究工作積累請著重填寫本課題組與本項目相關(guān)的研究工作積累和近五年的主要研究業(yè)績和近五年的主要研究業(yè)績) )l工作條件工作條件 已具備的實驗條件，尚缺少的實驗已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑條件和擬解決的途徑( (包括

50、利用國家重點實驗室包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況和部門開放實驗室的計劃與落實情況) ).研究基礎(chǔ)研究基礎(chǔ) 申請人近年有如下工作積累和成績申請人近年有如下工作積累和成績：1. 申請人多年的研究興趣主要集中在神經(jīng)元凋亡的信號轉(zhuǎn)導與基因調(diào)控、申請人多年的研究興趣主要集中在神經(jīng)元凋亡的信號轉(zhuǎn)導與基因調(diào)控、帕金森病的研究方面，發(fā)表了帕金森病的研究方面，發(fā)表了36篇與神經(jīng)元凋亡的信號轉(zhuǎn)導和基因調(diào)篇與神經(jīng)元凋亡的信號轉(zhuǎn)導和基因調(diào)控有關(guān)的控有關(guān)的SCI論文，其中作為第一作者的有論文，其中作為第一作者的有2篇，作為通訊作者的有篇，作為通訊作者的有10篇，作為共同作者的有篇，作為共同作者的

51、有24篇。篇。2. 申請人在申請人在GSK-3促神經(jīng)元凋亡研究方面有著厚實的工作基礎(chǔ)。申請促神經(jīng)元凋亡研究方面有著厚實的工作基礎(chǔ)。申請人曾發(fā)現(xiàn)人曾發(fā)現(xiàn)PKA可以直接使可以直接使 GSK-3的的Ser9磷酸化并抑制其活性，并進磷酸化并抑制其活性，并進而闡明了而闡明了cAMP/PKA 通過磷酸化并抑制通過磷酸化并抑制GSK-3發(fā)揮其促神經(jīng)元存活發(fā)揮其促神經(jīng)元存活的作用的作用 (Mol Cell Biol, 2000)。此外，申請人還證明了。此外，申請人還證明了GSK-3的抑制的抑制劑可以保護黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元，并對劑可以保護黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元，并對MPTP 誘導的帕金森動物模型有誘導的帕金森動物模型有

52、很好的治療效果很好的治療效果(Neuropharmocolgy, 2007)。.研究基礎(chǔ)研究基礎(chǔ) 3. 申請人已經(jīng)排除了申請人已經(jīng)排除了AKT、PKA、p90RSK參與去極化時參與去極化時GSK-3磷酸化，磷酸化，經(jīng)一致序列分析和抑制劑實驗，提出經(jīng)一致序列分析和抑制劑實驗，提出CaMKII介導介導GSK-3磷酸化的可能磷酸化的可能性，進一步的體外重組激酶反應分析證明，性，進一步的體外重組激酶反應分析證明，CaMKII可直接磷酸化可直接磷酸化GSK-3 Ser21/ GSK-3 Ser9。此外，申請人還用可靠的實驗結(jié)果證明了。此外，申請人還用可靠的實驗結(jié)果證明了CaMKII促神經(jīng)元存活作用。這些

53、寶貴的研究資料是本項目重要的工作促神經(jīng)元存活作用。這些寶貴的研究資料是本項目重要的工作基礎(chǔ)之一?；A(chǔ)之一。4. 申請人一直進行神經(jīng)元凋亡中一條重要信號轉(zhuǎn)導通路申請人一直進行神經(jīng)元凋亡中一條重要信號轉(zhuǎn)導通路JNK/c-Jun 通通 路的靶基因及其對神經(jīng)元凋亡調(diào)控的研究。在路的靶基因及其對神經(jīng)元凋亡調(diào)控的研究。在c-Jun促凋亡靶基因的研究促凋亡靶基因的研究方面取得一定成績：首次證實方面取得一定成績：首次證實bim不是不是c-Jun的靶基因的靶基因(Neurosci Lett, 2005)，并從源頭，并從源頭尋尋找和確立了若干介導凋亡的新的找和確立了若干介導凋亡的新的c-Jun靶基因。其中，靶基因。其中，已經(jīng)完成了已經(jīng)完成了c-Jun直接調(diào)控促凋亡的直接調(diào)控促凋亡的BH3-only 蛋白蛋白dp5的研究的研究 (J Biol Chem,2007)，隨后又證實了，隨后又證實了ATF3是是c-Jun的促凋亡靶基因的促凋亡靶基因 (Neuroscience, 2008) 。.工作條件工作條件 2001年回國，獲得年回國，獲得2