1、2 固態(tài)發(fā)酵微生物與基質(zhì)2.1 固態(tài)發(fā)酵微生物特征 有報(bào)道利用細(xì)菌有報(bào)道利用細(xì)菌Gllulomona sp和糞產(chǎn)堿菌和糞產(chǎn)堿菌(Alcaligeros faelalis)或酵母菌或酵母菌Aareobasidium phllulans和產(chǎn)朊假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)采用半采用半固態(tài)發(fā)酵方式成功地將部分纖維材料轉(zhuǎn)化為動(dòng)物固態(tài)發(fā)酵方式成功地將部分纖維材料轉(zhuǎn)化為動(dòng)物飼料，但最終產(chǎn)品中飼料，但最終產(chǎn)品中蛋白含量較低蛋白含量較低。 自然條件下的自然條件下的絲狀真菌絲狀真菌通常在缺乏自由水的固態(tài)通常在缺乏自由水的固態(tài)底物上生長，如植物的根、莖、葉上，而且最終底物上生長，如植物的根

2、、莖、葉上，而且最終發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白含量可達(dá)蛋白含量可達(dá)20一一24。 2.1 固態(tài)發(fā)酵微生物特征 適宜于固態(tài)發(fā)酵的理想微生物應(yīng)具備下面幾個(gè)特征：適宜于固態(tài)發(fā)酵的理想微生物應(yīng)具備下面幾個(gè)特征： 能夠利用多糖的混合物；能夠利用多糖的混合物； 有完整的酶系，可以迅速從對某一種多糖的代謝轉(zhuǎn)為對有完整的酶系，可以迅速從對某一種多糖的代謝轉(zhuǎn)為對另一種多糖的代謝；另一種多糖的代謝； 能夠深入到料層中，也能穿入基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)；能夠深入到料層中，也能穿入基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)； 在發(fā)酵過程中以菌絲形式生長，而不易孢子化；在發(fā)酵過程中以菌絲形式生長，而不易孢子化； 生長迅速，染菌概率小；生長迅速，染菌概率小； 可以在含

3、水量低的基質(zhì)中生長；可以在含水量低的基質(zhì)中生長； 能夠耐受高濃度的營養(yǎng)鹽；能夠耐受高濃度的營養(yǎng)鹽； 可以耐受基質(zhì)預(yù)處理過程中產(chǎn)生的苯類等有毒物質(zhì)。可以耐受基質(zhì)預(yù)處理過程中產(chǎn)生的苯類等有毒物質(zhì)。2.2 界面的作用 界面是指兩個(gè)物體相態(tài)相接觸的分界層，也可稱為界面層，它占有一定的厚度和面積。沒有兩相接觸，就沒有界面。反之，凡是有兩相接觸的地方，就會(huì)有界面出現(xiàn)。 氣固 氣液 液固 液液 固固2.2.1 營養(yǎng)物在界面上的富集 大多數(shù)界面呈凈的大多數(shù)界面呈凈的負(fù)電荷負(fù)電荷，因而，因而吸引陽離子和各吸引陽離子和各種大分子種大分子。 界面對營養(yǎng)物的吸附是由于界面上的界面對營養(yǎng)物的吸附是由于界面上的原子力場不

4、原子力場不飽和飽和，具有一定的，具有一定的表面能表面能，因而可以吸附某些生，因而可以吸附某些生物大分子以降低表面能。物大分子以降低表面能。 另外，在微生物生長代謝過程中產(chǎn)生一些具有很另外，在微生物生長代謝過程中產(chǎn)生一些具有很大吸附作用的蛋白質(zhì)或多糖。這些作用使微生物大吸附作用的蛋白質(zhì)或多糖。這些作用使微生物在界面堆積生長。在界面堆積生長。吸附氣泡分離過程 來源于雨水、大氣散落物、地表徑流或地下水的各種材料富集在空氣水的界面上，形成微薄層。氣泡的形成為營養(yǎng)物離子和大分子在此體系中的吸附、濃縮和遷移到表面提供了一種有效的方法，也可導(dǎo)致在表面上選擇性地富集水柱中的細(xì)菌。這種現(xiàn)象被稱作吸附氣泡分離過程

5、。 固體物沉浸到天然水系中，導(dǎo)致大分子自發(fā)吸附到固體表面上成膜。用臨界表面張力測定法測得，這類膜改變了表面的自由能，并對固液界面附近細(xì)菌的行為發(fā)生明顯的影響。 部分親水、部分親油的聚合物以相同的速度吸附到不同的表面上，但構(gòu)型不同。這影響到微生物在這種表面上黏附的性質(zhì)。 2.2.2 界面分布的微生物 微生物在界面上的分布方式、機(jī)制及效應(yīng)微生物在界面上的分布方式、機(jī)制及效應(yīng)依微生物的種類不同和界面的性質(zhì)而不同。依微生物的種類不同和界面的性質(zhì)而不同。 運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌在營養(yǎng)不足的生境中通常呈現(xiàn)趨化性反應(yīng)，沿著界面附近建立的營養(yǎng)梯度而分布。 不運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌則依靠另外的機(jī)制富集在界面上。 細(xì)胞表面的疏水性是影響

6、細(xì)菌在界面上行細(xì)胞表面的疏水性是影響細(xì)菌在界面上行為的主要因子。為的主要因子。2.2.3 微生物界面效應(yīng)的實(shí)踐意義 提供給微生物生長繁殖的場所。 營養(yǎng)物質(zhì)通過界面作用吸附在界面表面，供給微生物的生長利用。2.3 絲狀微生物生長機(jī)制 絲狀真菌的生長是以其頂端延長的方式進(jìn)行的，頂端之后的菌絲只能變厚而不能伸長；在生長過程中又靠頂端延伸的方式產(chǎn)生繁茂的分枝而構(gòu)成真菌的菌落，可見真菌的生長主要表現(xiàn)在菌絲頂端的生長。2.3.1 初生頂部生長2.3.1.1 菌絲頂端生長的泡囊學(xué)說菌絲頂端生長的泡囊學(xué)說 在研究菌絲頂端細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌絲頂端含有大在研究菌絲頂端細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌絲頂端含有大量的

7、原生質(zhì)的泡囊，而缺乏其他細(xì)胞內(nèi)含物。量的原生質(zhì)的泡囊，而缺乏其他細(xì)胞內(nèi)含物。 泡囊是從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以水泡狀的形式轉(zhuǎn)移到高爾基體，在高爾泡囊是從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以水泡狀的形式轉(zhuǎn)移到高爾基體，在高爾基體內(nèi)進(jìn)行加工，然后出芽并轉(zhuǎn)輸?shù)骄z頂端，與原生質(zhì)基體內(nèi)進(jìn)行加工，然后出芽并轉(zhuǎn)輸?shù)骄z頂端，與原生質(zhì)膜融合，以反胞飲方式通過質(zhì)膜或釋放其內(nèi)含物而進(jìn)入壁膜融合，以反胞飲方式通過質(zhì)膜或釋放其內(nèi)含物而進(jìn)入壁旁的空間。這一過程不但使泡囊內(nèi)含物進(jìn)入膜壁之間，被旁的空間。這一過程不但使泡囊內(nèi)含物進(jìn)入膜壁之間，被用末合成細(xì)胞壁，而且菌絲體的頂部被許許多多的泡囊所用末合成細(xì)胞壁，而且菌絲體的頂部被許許多多的泡囊所占據(jù)，泡囊的膜也并人原

8、生質(zhì)膜，使原生質(zhì)膜增加了面積，占據(jù)，泡囊的膜也并人原生質(zhì)膜，使原生質(zhì)膜增加了面積，從而導(dǎo)致丫菌絲頂端的生長。從而導(dǎo)致丫菌絲頂端的生長。 大多數(shù)真菌尚未發(fā)現(xiàn)高爾基體，泡囊是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特定區(qū)大多數(shù)真菌尚未發(fā)現(xiàn)高爾基體，泡囊是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特定區(qū)域產(chǎn)生的。域產(chǎn)生的。2.3.1.2 菌絲頂端生長的機(jī)制 菌絲頂端泡囊的聚集導(dǎo)致了頂端的延長生長。 研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生長停止時(shí)這些泡囊便從頂端消失，分布在整個(gè)細(xì)胞的周圍表面，在生長旺盛期，便開始在頂端區(qū)聚集成泡囊群，其外面似乎附著于質(zhì)膜，無論大的或小的泡囊都不太緊密地散生于整個(gè)頂端的內(nèi)區(qū)，并以這樣或那樣的方式調(diào)控著一些生長過程。 泡囊的內(nèi)含物是合成細(xì)胞壁物質(zhì)。泡囊的作

9、用的三重性運(yùn)輸細(xì)胞壁溶解酶去破壞原來壁組成之間的鍵；運(yùn)輸新的壁物質(zhì)，并在壁合成酶的作用下并入細(xì)胞壁中；在生長期間增加了原生質(zhì)膜的表面積。2.3.2 生長過程 頂部的壁結(jié)構(gòu)與較老的菌絲區(qū)類似，但壁頂部的壁結(jié)構(gòu)與較老的菌絲區(qū)類似，但壁較薄。較薄。 從頂區(qū)尖端起向基地發(fā)生下列改變：從頂區(qū)尖端起向基地發(fā)生下列改變： 微絲的厚度、數(shù)量和包被都有所增加；微絲的厚度、數(shù)量和包被都有所增加； 其他壁的組分，包括最內(nèi)層圍繞微絲和葡聚其他壁的組分，包括最內(nèi)層圍繞微絲和葡聚糖一些物質(zhì)糖一些物質(zhì)(主要是蛋白質(zhì)主要是蛋白質(zhì))以及位于內(nèi)層外的以及位于內(nèi)層外的糖蛋白也都增加。糖蛋白也都增加。頂部生長所要求的功能 把必需的一

10、些物質(zhì)或其前體轉(zhuǎn)運(yùn)到頂部圓頂蓋把必需的一些物質(zhì)或其前體轉(zhuǎn)運(yùn)到頂部圓頂蓋內(nèi)側(cè)襯里的質(zhì)膜處；內(nèi)側(cè)襯里的質(zhì)膜處； 轉(zhuǎn)移到壁并摻入于壁內(nèi)或?yàn)榫酆衔铮谀承├D(zhuǎn)移到壁并摻入于壁內(nèi)或?yàn)榫酆衔铮谀承├C中從其內(nèi)面至少摻入證中從其內(nèi)面至少摻入100nm或更遠(yuǎn)；或更遠(yuǎn)； 在一些恰當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)壁的聚合物的合成；在一些恰當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)壁的聚合物的合成； 所有這些過程的調(diào)控均是按生長有秩序和穩(wěn)定所有這些過程的調(diào)控均是按生長有秩序和穩(wěn)定的方式發(fā)生而進(jìn)行的。的方式發(fā)生而進(jìn)行的。2.3.3 固態(tài)發(fā)酵過程中真菌的生長機(jī)制 真菌具有單向性圓柱狀菌絲。菌絲的直徑為真菌具有單向性圓柱狀菌絲。菌絲的直徑為10-15m。 菌絲的延伸局限于頂部

11、，因此若將某單一菌絲的菌絲的延伸局限于頂部，因此若將某單一菌絲的頂部切下，則該菌絲體便不能延伸了。而被切下頂部切下，則該菌絲體便不能延伸了。而被切下的頂部都仍能夠延伸到底物當(dāng)中。的頂部都仍能夠延伸到底物當(dāng)中。試驗(yàn)表明頂部1m生長最活躍，此后5m則顯著下降，然而575m范圍內(nèi)仍有水平很低的生理活性。 菌絲的細(xì)胞壁由兩層結(jié)構(gòu)： 外層是不定形的組分，主要是蛋白質(zhì)、甘露聚糖和葡聚糖； 內(nèi)層是定形的，由幾丁質(zhì)、纖維素或二者組成的微纖。 頂部后面堅(jiān)硬的細(xì)胞壁和復(fù)雜的分支系統(tǒng)使得菌絲牢固地固定在底物上，并產(chǎn)生強(qiáng)大的內(nèi)壓使頂部延伸有了動(dòng)力。 胞外酶的產(chǎn)生和龐大的菌絲分枝使得真菌能夠穿透堅(jiān)硬的底物。 2.3.3

12、.1自然條件下真菌在固態(tài)底物中的生長 根據(jù)Cowling的研究以纖維材料為底物的真菌通常可分為三種類型： (1)次生腐生真菌 (2)物質(zhì)腐敗真菌 (3)典型的木材腐朽菌 次生腐生真菌如Trichoderma lighoyum， 僅在底物的外表面；如長喙殼菌(Ceratocystis spp.)，可以深入到底物內(nèi)部，這些真菌僅僅在木材上生長，對底物細(xì)胞壁無任何影響，只是由于菌絲內(nèi)有色素，而使木材著色。物質(zhì)腐敗真菌 這種真菌侵蝕植物細(xì)胞的次生細(xì)胞壁是沿著纖維素分子方向進(jìn)行的，這些真菌的穿透力較前述菌強(qiáng)，它們可以伸入到底物內(nèi)部，但僅局限于纖維分子的方向，而且由于它們的纖維素酶活力較低，而不能將侵蝕的

13、組織全部降解。典型的木材腐朽菌 白腐真菌，這類真菌可分解木質(zhì)素和纖維素，木白腐真菌，這類真菌可分解木質(zhì)素和纖維素，木材在分解過程中不著色，保留白色；材在分解過程中不著色，保留白色；褐腐真菌，分解纖維素，使留下的木質(zhì)素形成褐褐腐真菌，分解纖維素，使留下的木質(zhì)素形成褐色的網(wǎng)，有時(shí)也部分降解木質(zhì)素；色的網(wǎng)，有時(shí)也部分降解木質(zhì)素；軟腐真菌，在潮濕條件下分解木材，一般只能分軟腐真菌，在潮濕條件下分解木材，一般只能分解纖維素，木質(zhì)素被完整的留下。解纖維素，木質(zhì)素被完整的留下。 白腐和褐腐真菌為擔(dān)子菌，而軟腐真菌則為子囊白腐和褐腐真菌為擔(dān)子菌，而軟腐真菌則為子囊菌和半知菌。菌和半知菌。 這些真菌都寄生在植物

14、細(xì)胞的管腔內(nèi)，它們自己鉆孔或利用天然的縫隙從一個(gè)細(xì)胞進(jìn)入另一個(gè)植物細(xì)胞。 菌絲頂部與植物細(xì)胞壁表面緊密接觸，頂部產(chǎn)生的纖維素酶系統(tǒng)和葡聚糖酶，將植物細(xì)胞壁的纖維降解，造成鉆孔，為菌絲的延伸辟路，直到菌絲進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞管腔，如此從一個(gè)細(xì)胞進(jìn)入另一個(gè)細(xì)胞最終整個(gè)組織被降解。 這些孔比穿入的菌絲略粗，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞管腔時(shí)負(fù)責(zé)打洞的菌絲會(huì)自融(anto lyzed)，并將物質(zhì)轉(zhuǎn)移到正在積極生長的菌絲。推測木材中氮的含量較低(0.05)，所以這更適于在管腔內(nèi)的條件下的發(fā)展。 菌絲體停留時(shí)間較長的地方則被繼續(xù)降解，所以細(xì)胞壁上的洞僅比菌絲體的直徑稍大一點(diǎn)。 產(chǎn)生纖維素酶的部分是產(chǎn)生纖維素酶的部分是生長最活躍的

15、菌絲頂端生長最活躍的菌絲頂端，在以打洞方式穿過細(xì)胞壁或沿菌絲的延伸方向降在以打洞方式穿過細(xì)胞壁或沿菌絲的延伸方向降解細(xì)胞管腔內(nèi)表面時(shí)，都會(huì)分泌纖維素酶。只是解細(xì)胞管腔內(nèi)表面時(shí)，都會(huì)分泌纖維素酶。只是在后一種情況下，纖維素酶可以沿纖維分子的方在后一種情況下，纖維素酶可以沿纖維分子的方向迅速擴(kuò)散，滲透到次生細(xì)胞壁中并使之徹底降向迅速擴(kuò)散，滲透到次生細(xì)胞壁中并使之徹底降解；而前一種情況下纖維素的擴(kuò)散受限制。解；而前一種情況下纖維素的擴(kuò)散受限制。 因此這些真菌是由細(xì)胞內(nèi)層開始降解并利用植物因此這些真菌是由細(xì)胞內(nèi)層開始降解并利用植物細(xì)胞壁的。細(xì)胞壁的。 從典型的木材腐朽菌的生長行為可以推斷從典型的木材腐

16、朽菌的生長行為可以推斷只有與纖維素緊密接觸的菌絲表面上才能只有與纖維素緊密接觸的菌絲表面上才能產(chǎn)生高活力的纖維素酶產(chǎn)生高活力的纖維素酶，這種情況下產(chǎn)生，這種情況下產(chǎn)生的纖維素酶可降解高度結(jié)晶的天然纖維素。的纖維素酶可降解高度結(jié)晶的天然纖維素。 采用液態(tài)發(fā)酵方式獲得的李氏木霉纖維素采用液態(tài)發(fā)酵方式獲得的李氏木霉纖維素酶降解天然纖維素的能力很差。酶降解天然纖維素的能力很差。2.3.3.2 真菌在固態(tài)基質(zhì)中生長機(jī)制 分泌水解類酶即是真菌細(xì)胞的一個(gè)重要功能。 在纖維素材料中生長的過程中，菌絲的頂端會(huì)分泌水解類酶，這些酶就擴(kuò)散到底物中并降解底物，而降解產(chǎn)物進(jìn)入菌體內(nèi)被利用，菌絲則伸延到被降解的區(qū)域，繼續(xù)

17、保持與底物密切接觸。接觸誘導(dǎo)假說 菌絲頂端與纖維素的物理接觸就足以將物理信號(hào)(而非化學(xué)信號(hào))經(jīng)細(xì)胞壁傳到真菌的細(xì)胞核中，引發(fā)某種所需要的誘導(dǎo)物的合成。 纖維素與菌體的接觸是引發(fā)纖維素酶合成的必要條件。關(guān)于菌絲頂端分泌復(fù)雜的纖維素酶系統(tǒng)關(guān)于菌絲頂端分泌復(fù)雜的纖維素酶系統(tǒng)分解纖維素機(jī)制的假說分解纖維素機(jī)制的假說 某些物理信息由纖維素傳送到真菌細(xì)胞核某些物理信息由纖維素傳送到真菌細(xì)胞核中導(dǎo)致酶中導(dǎo)致酶El合成，該酶可切斷纖維或微纖合成，該酶可切斷纖維或微纖維與纖維材料的結(jié)晶部分的連接。緊密接維與纖維材料的結(jié)晶部分的連接。緊密接觸是對觸是對E1，也可能是其他酶組分的產(chǎn)生是，也可能是其他酶組分的產(chǎn)生是非

18、常重要的。非常重要的。第二個(gè)酶第二個(gè)酶(E2)合成的啟動(dòng)。合成的啟動(dòng)。 E2由兩種組分構(gòu)成：由兩種組分構(gòu)成： (i) endo 1，4-p-D-glucan glucanohydrolase lendo-glucanse，它可將高聚葡萄糖長鏈隨機(jī)切，它可將高聚葡萄糖長鏈隨機(jī)切斷為短鏈，也有許多葡萄單體釋放出來；斷為短鏈，也有許多葡萄單體釋放出來； () exo-1,4-D-glucan glutohydrolase，從聚，從聚葡萄糖鏈的非還原端切下寡糖葡萄糖鏈的非還原端切下寡糖(cellobiose)，可，可見見E2的產(chǎn)物是寡糖、二糖和葡萄糖。的產(chǎn)物是寡糖、二糖和葡萄糖。纖維二糖被細(xì)胞吸收，誘

19、導(dǎo)第三種酶即纖維二糖被細(xì)胞吸收，誘導(dǎo)第三種酶即E3(-glucosidase)合成，將纖維二糖分解為葡萄糖單體。合成，將纖維二糖分解為葡萄糖單體。 E3屬于胞內(nèi)酶，但仍有一小部分可以分泌到體外。屬于胞內(nèi)酶，但仍有一小部分可以分泌到體外。老細(xì)胞或自融的細(xì)胞中可釋放出大量的老細(xì)胞或自融的細(xì)胞中可釋放出大量的E3，因此，因此纖維二糖在菌體內(nèi)外均可被分解為葡萄糖。纖維二糖在菌體內(nèi)外均可被分解為葡萄糖。2.3.4 分支生長分支生長 真菌的菌絲體或孢子生長在固體培養(yǎng)基上時(shí)，一般會(huì)長出菌絲并向四周蔓延繁殖。在此過程中，菌絲幾乎沿著它的長度的任何一點(diǎn)都能發(fā)生分支。若是生長在平面上，會(huì)形成一個(gè)特征性的圓形輪廓菌

20、落。 在菌落發(fā)育后期，菌絲之間互相接觸，菌絲接觸點(diǎn) 的 壁 局 部 降 解 而 發(fā) 生 菌 絲 的 網(wǎng) 結(jié) 現(xiàn) 象（anastomosis），因此，使菌落形成一個(gè)完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。2.3.5 固態(tài)基質(zhì)中的絲狀微生物生長動(dòng)力學(xué) 固態(tài)發(fā)酵的基本動(dòng)力學(xué)關(guān)系與液體發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)沒有本質(zhì)的差別。 固態(tài)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的主要特點(diǎn)是基質(zhì)顆粒特性和基質(zhì)含水量(或水活度)對固態(tài)發(fā)酵過程微生物生長速率有著明顯的影響。 戚以政教授提出了在固態(tài)發(fā)酵過程中顆粒度和水活度對反應(yīng)動(dòng)力學(xué)影響的修正系數(shù)。(1)顆粒度對反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響 (2)水活度對反應(yīng)的影響2.4 固態(tài)基質(zhì)中的細(xì)菌的生長與代謝 細(xì)菌參與的固態(tài)發(fā)酵過程相對較少，但在傳統(tǒng)

21、自然發(fā)酵過程和食品發(fā)酵工業(yè)上較為重要。 自然漚肥，嗜熱芽孢桿菌； 飼料的青貯 食品發(fā)酵，如：納豆， 枯草芽孢桿菌 芽孢桿菌(Bacillus spp.)， 發(fā)酵麩皮生產(chǎn)淀粉酶。 吸附吸附生物膜生物膜2.4.1 細(xì)菌表面的結(jié)構(gòu) 細(xì)胞壁 附屬物：菌毛、鞭毛 莢膜2.4.2 細(xì)菌表面的理化性質(zhì) 負(fù)電荷 G+：磷壁酸、多肽、莢膜多糖中的羧酸； G-：酸性莢膜多糖、多肽、脂多糖。 疏水性（蛋白、多糖）2.4.3 細(xì)菌在固體表面吸附的過程細(xì)菌在固體表面吸附的過程 微生物從液相移動(dòng)到固液表面：微生物從液相移動(dòng)到固液表面：自由擴(kuò)散、自由擴(kuò)散、對流傳送和自主運(yùn)動(dòng)對流傳送和自主運(yùn)動(dòng)； 最初的吸附過程；最初的吸附過

22、程； 黏附：菌毛、表面特異性蛋白；黏附：菌毛、表面特異性蛋白； 定植。定植。2.5 固態(tài)基質(zhì)中的酵母菌生長 酵母菌參與的固態(tài)發(fā)酵也多是傳統(tǒng)自然固態(tài)發(fā)酵過程。 酵母菌一般出現(xiàn)在飼料青貯的早期。 利用酵母菌的純種固態(tài)發(fā)酵果皮及其他廢棄物產(chǎn)酒精，也愈來愈引起人們的重視。 在淀粉類物質(zhì)為底物的同步糖化發(fā)酵過程中，淀粉酶和酵母菌被同時(shí)引入固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)，酵母菌的存在還有利于提高發(fā)酵產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量。2.6 固態(tài)發(fā)酵過程中生物量的測定 測定固態(tài)發(fā)酵中生物量的方法有四大類：直接從固態(tài)培養(yǎng)基中分離測定；通過檢測代謝活動(dòng)推斷生物量；測定出生物體中某些特殊物質(zhì)的含量推知生物量；利用與菌體生長有關(guān)的某些現(xiàn)象估測生物

23、量。2.5.1 直接從固態(tài)培養(yǎng)基中分離測定 用用半固體明膠基培養(yǎng)半固體明膠基培養(yǎng)釀酒酵母模擬固態(tài)發(fā)酵，研釀酒酵母模擬固態(tài)發(fā)酵，研究固態(tài)發(fā)酵的規(guī)律，使明膠培養(yǎng)基在適當(dāng)?shù)臏囟染抗虘B(tài)發(fā)酵的規(guī)律，使明膠培養(yǎng)基在適當(dāng)?shù)臏囟热刍俳?jīng)熔化再經(jīng)離心離心即得到酵母菌。制成即得到酵母菌。制成菌懸液菌懸液以后，以后，測量光密度測量光密度，對照干細(xì)胞濃度與光密度的關(guān)系曲，對照干細(xì)胞濃度與光密度的關(guān)系曲線即可得到菌體濃度。線即可得到菌體濃度。 類似的方法有用淀粉酶水解米飯，再經(jīng)不銹鋼的類似的方法有用淀粉酶水解米飯，再經(jīng)不銹鋼的金屬篩濾出米曲霉，但未水解的殘?jiān)鼤?huì)干擾檢測金屬篩濾出米曲霉，但未水解的殘?jiān)鼤?huì)干擾檢測結(jié)果。結(jié)果

24、。濾膜培養(yǎng) 在模擬環(huán)境下進(jìn)行濾膜培養(yǎng)可得到較純的真菌菌體，因?yàn)楸∧つ茏柚咕z混入底物。只要將菌絲體從膜上剝離直接稱重或烘干后稱重即可得到總菌量。 不能用于實(shí)際的固態(tài)發(fā)酵，但它可用作生物量的間接測定，其模擬條件要與固態(tài)發(fā)酵的實(shí)際情形相類似。 用濾膜培養(yǎng)所得到的菌體測定生物量明顯好于從液態(tài)培養(yǎng)得到的菌體。 如果底物能被分解，菌絲長度能用血小板計(jì)數(shù)器測出，且菌絲團(tuán)的直徑和密度已知，則細(xì)胞生物量可由此估測出。 需要大量的實(shí)驗(yàn)以便得到較為精確的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，而且真菌在固體培養(yǎng)基表面形成了密集的菌絲團(tuán)，為此測定方法帶來很大困難。2.5.2 通過檢測代謝活動(dòng)推斷生物量1、測定二氧化碳的呼出量或測定氧氣的消耗量測

25、定二氧化碳的呼出量或測定氧氣的消耗量 微生物在呼吸作用下消耗氧氣，放出二氧化碳，產(chǎn)生生長所需的大部分能量，氧氣的消耗量及二氧化碳的排放量與生物體生長息息相關(guān)，所以可用于推斷菌體的生長狀況。利用二氧化碳的產(chǎn)生速率得到了麥麩上生長的黑曲霉的比生長速率，用NaOH吸收排放的氣體，通過電導(dǎo)儀顯示NaOH濃度下降的情況；大米培養(yǎng)的米曲霉二氧化碳比釋放速率與比生長速率之間存在線性關(guān)系。二氧化碳的釋放速率可用紅外線二氧化碳分析儀。1、測定二氧化碳的呼出量或測定氧氣的消耗量、測定二氧化碳的呼出量或測定氧氣的消耗量 耗氧量也被用來表征細(xì)胞生物量，可在一個(gè)封閉的瓦氏呼吸器中用大米培養(yǎng)米曲霉，呼吸作用產(chǎn)生的二氧化碳

26、被NaOH吸收。由于氧氣被消耗，壓力下降，電解氧發(fā)生器自動(dòng)顯示，則耗氧量被連續(xù)檢測出來。 只適用于菌體生長過程中生物量的測定，而對非生長過程中生物量的測定不適用。2、胞外酶的產(chǎn)生 與生長相關(guān)聯(lián)的另一種代謝活動(dòng)是產(chǎn)生胞外酶： 例如麥麩培養(yǎng)的黑曲霉產(chǎn)橘皮軟化酶的速率與菌體生長速率有線性關(guān)系。 Okazaki等人提出蒸米固態(tài)發(fā)酵米曲霉所產(chǎn)的淀粉酶活力與菌絲量有比例關(guān)系。 3、測定熱量的生成 在固態(tài)發(fā)酵中會(huì)伴有熱量的產(chǎn)生，因此，產(chǎn)熱量可以作為與生物量相關(guān)的新陳代謝活動(dòng)的指標(biāo)。 熱傳感器 外置紅外線傳感器4、測定電特性的變化 微生物生長過程中，其培養(yǎng)基的電導(dǎo)率會(huì)隨著NH4+的吸收而降低，又會(huì)隨著有機(jī)酸和

27、NH4+的釋放而增加。 通過測定電導(dǎo)率和阻抗的變化，可以檢測出食物中真菌分生孢子數(shù)在4h內(nèi)達(dá)到大約106個(gè)的水平。 在固態(tài)發(fā)酵中，應(yīng)用電特性的前景更為廣泛。5、其他與代謝活動(dòng)相關(guān)的預(yù)示 ATP含量，作為菌體量的粗略估計(jì)。 熒光素雙醋酸鹽染色。這種特殊的熒光物質(zhì)只有被酶解才會(huì)發(fā)光，由此可鑒別出代謝活躍區(qū)。2.5.3 測定出生物體中某些特殊物質(zhì)的含量推知生物量 如果生物體某特定組分含量始終不變或各生長階段的變化如果生物體某特定組分含量始終不變或各生長階段的變化已知，且測量不受底物干擾，找到該組分生物量的線性關(guān)已知，且測量不受底物干擾，找到該組分生物量的線性關(guān)系，通過測定該組分的量就可以推測細(xì)胞生物

28、量。系，通過測定該組分的量就可以推測細(xì)胞生物量。 如，如，紅外輻射分析技術(shù)紅外輻射分析技術(shù)，測定葡萄糖胺、麥角甾醇，測定葡萄糖胺、麥角甾醇，ATPATP、DNADNA和蛋白質(zhì)的含量；該方法首先要獲得發(fā)酵物料的標(biāo)準(zhǔn)和蛋白質(zhì)的含量；該方法首先要獲得發(fā)酵物料的標(biāo)準(zhǔn)光譜。光譜。 反射光三色刺激分析測定反射光三色刺激分析測定，固態(tài)發(fā)酵過程中，由于生物化，固態(tài)發(fā)酵過程中，由于生物化學(xué)的變化以及孢子和生物體的形成，發(fā)酵基質(zhì)的顏色將隨學(xué)的變化以及孢子和生物體的形成，發(fā)酵基質(zhì)的顏色將隨之變化。之變化。2.5.4 利用與菌體生長有關(guān)的某些現(xiàn)象估測生物量1、模擬培養(yǎng)底物法測定生物量 應(yīng)用惰性載體的方法測定生物量。附著有培養(yǎng)物的載體，通過清洗、干燥、排除營養(yǎng)基質(zhì)后，可以稱取總生物量。 例如，將凝固瓊脂使用在模擬固態(tài)底物孔隙結(jié)構(gòu)的模型中，經(jīng)過培養(yǎng)后，瓊脂通過微波爐熔化并用水清洗、使瓊脂與菌體分離，測定其生物量。 目前人們沒有進(jìn)行從載體中分離出菌量的嘗試，干燥后質(zhì)量的差異被假設(shè)為生、死生物量之和。2、對菌落直徑的增加測定其特定生長速率 測定真菌生長速率最簡單的方法是，在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，定時(shí)測定其單菌落生長的直徑。 該方法對生、死生物量無法進(jìn)行區(qū)別。當(dāng)假設(shè)菌落是均勻的，則菌落的生長可以用來計(jì)算特定生長速率，該生長速率與溫度、水分活度、氣體組成和菌種間的相互作用有關(guān)。 總之，在通氣固