1、利用響應(yīng)面法優(yōu)化全蝕病生防菌YB81的發(fā)醉條件：Inordertoraisingtheantagonisticeffect，thegrowthconditionsandculturemediumofbiocontrolstrainYB-81wasoptimizedbasedonsinglefactortest.TheoptimalcultureconditionsofthebiocontrolstrainYB-81weredeterminedfor0.53%beefextract+glucose(11),0.99%peptone，0.20%odiumchloride，temperatureat

2、36，pH8.0，speedingat200r?min-1，theincubationtimeof36h.Thetotalnumbersofcolonywas1.88x109?mL-1,improvingby72%，andtheinhibitionratetoGaeumannomycesgramimswas87.2%，improvingby32.5%withtheoptimalgrowthconditions.TheoptimalgrowthconditionofthebiocontrolstrainYB-81wasidentified，providingatheoreticalbasisfo

3、renlargementofproduction.小麥全蝕病(Wheattake-all)是一種典型的根部土傳病害，由子囊菌亞門的禾頂囊殼菌小麥變種(Gaeumannomycesgramimsvar.tritici)侵染所致1-4。小麥發(fā)病后，植株根部變黑，分蘗減少，成穗率降低，千粒質(zhì)量下降，甚至全株枯死，減產(chǎn)幅度很大，民間稱此病害為“小麥癌癥”。最近5年，小麥全蝕病擴(kuò)展迅速，造成嚴(yán)重危害，且防控困難已經(jīng)成為一種非常頑固的土傳病害。目前，對全蝕病的防治依靠化學(xué)藥劑拌種，常規(guī)藥劑防治效果不好，全蝕凈防效較好但成本太高。YB-81菌株是河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所利用現(xiàn)代微生物篩選和分子生物學(xué)技

4、術(shù)培育出的對小麥全蝕病具有高效抑制作用的枯草芽孢桿菌，通過室內(nèi)生測試驗以及田間試驗證明對小麥全蝕病菌有較好的防治作用，目前該菌株專利已授權(quán)(專利號201010199739.1)。本試驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵條件，目的是為提高該菌株的防病效果，進(jìn)一步中試生產(chǎn)，為應(yīng)用于大田提供理論基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料供試菌株及培養(yǎng)基：枯草芽孢桿菌YB-81和小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgramimsvar.tritici)均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基，小麥全蝕病菌培養(yǎng)基為PDA。1.2 方法1.2.1 生長量的測定采用平板菌落計數(shù)法5。各處理培養(yǎng)

5、液用梯度稀釋法稀釋涂板后，37C恒溫倒置培養(yǎng)3648h,調(diào)查平板菌落數(shù)，然后計算活菌數(shù)(cfu?mL-1)。1.2.2 抑菌率測定抑菌率的測定采用含毒介質(zhì)法6。1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化通過單因素試驗，測定不同時間、溫度、初始pH值、藥瓶轉(zhuǎn)速對YB-81菌株發(fā)酯效果的影響。1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基試驗設(shè)計，選取對發(fā)酵培養(yǎng)基有顯著影響的3個因素即碳源、氮源及無機(jī)離子，采用單因素試驗方法確定3個因素的試驗點(diǎn)，每個因素選擇2個水平，測定各發(fā)酵培養(yǎng)基中芽孢桿菌的生長量。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，選取碳源牛肉膏+葡萄糖（1:1）（g）、氮源蛋

6、白陳（g）、無機(jī)離子氯化鈉（g）3個因素來研究發(fā)酵培養(yǎng)基最佳條件，以菌落總數(shù)為響應(yīng)值，利用Design-Exper.8.05軟件設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面試驗（表1）。2 結(jié)果與分析2.1 最優(yōu)發(fā)酵條件通過設(shè)置不同時間、溫度、初始pH值、搖瓶轉(zhuǎn)速優(yōu)化菌株YB-81的發(fā)酪條件，結(jié)果如圖1圖4所示。菌落總數(shù)與抑菌率的變化趨勢基本一致，菌落總數(shù)越高，抑菌率也越高。發(fā)酵時間36h抑制率達(dá)最高80.6%,菌落總數(shù)16.6億個？mL-1;隨著發(fā)酪溫度的上升菌落總數(shù)逐漸增多，在36時發(fā)酵代謝物此時的抑菌作用最強(qiáng)，菌落生長總數(shù)也最多，40時抑制率明顯降低；pH值8.0時，抑制率和菌落總數(shù)均在最高點(diǎn)，與其他處理

7、差異顯著；芽孢桿菌在5個不同搖床轉(zhuǎn)速條件下，抑制率變化不明顯，菌落總數(shù)逐漸增多，在200r?min-1菌落總數(shù)達(dá)到最大值16.2億個?mL-1。2.2生防芽孢桿菌YB-81發(fā)酵培養(yǎng)基試驗設(shè)計通過單因素試驗，得出發(fā)酪培養(yǎng)基（100ml）中最佳碳源葡萄糖件肉膏（1：1）添加量為0.5g,最佳氮源蛋白陳1.0g,最佳無機(jī)離子氯化鈉0.20g。2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗以菌落總數(shù)為響應(yīng)值，利用Design-Exper.8.05軟件設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面試驗，菌落總數(shù)響應(yīng)曲面分析試驗結(jié)果見表2。根據(jù)軟件對表2中試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到生防芽胞桿菌培養(yǎng)基設(shè)計過程中A碳源

8、、B氮源、C無機(jī)離子的二次多項回歸模型：Y=+177.60+2.00A-5.88B+1.62C+9.75AB+0.25AC-1.50BC-88.30A2-27.05B2-45.55C22.3.2 響應(yīng)曲面方差分析通過表3可以看出，該模型的F值為38.03說明模型是顯著的，各因素中BC和B2顯著；均二次方A2、C2極顯著。2.3.3 響應(yīng)曲面圖與等高值線圖的分析交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可用等高線的形狀來映出，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖4圖6可知，碳源葡萄糖+牛肉膏（1：1）（A）、氮源蛋白陳（B）、無機(jī)離子氯化鈉（C）之間的相互作用對菌落總數(shù)的影響。如圖中4所示，碳源與氮源之間存

9、在交互作用，當(dāng)碳源在零水平時，在氮源增加的同時，菌落總數(shù)也逐漸增加，當(dāng)碳源超過0.5g以后，菌落總數(shù)不再增加。從等高線圖中可直觀看出兩因素交互作用不顯著。圖5顯示了碳源與無機(jī)離子之間交互作用不顯著，從其等高線可直觀看出，因為等高線的形狀反應(yīng)了交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩個因素作用不顯著。由圖6可知，把氮源加入量固定于零水平（1.0g）時，氮源與培養(yǎng)基中無機(jī)離子交互影響效應(yīng)特點(diǎn)是：隨著氮源的變化，菌落總數(shù)先上升后降低；適當(dāng)?shù)脑黾拥纯梢詼p少一定量無機(jī)離子。說明氮源與無機(jī)離子有一定的交互作用。以上3個響應(yīng)面均為開口向下，說明響應(yīng)值（菌落總數(shù)）存在極大值，3個圖形的等高線中心均位于-11之間，表明

10、培養(yǎng)基最優(yōu)條件存在于所設(shè)計的因素水平范圍之內(nèi)。模型培養(yǎng)基優(yōu)化條件為：碳源0.53g，氮源0.99g，無機(jī)離子0.20g，在此條件下，模型預(yù)測菌落總數(shù)為168.408X107個？mL-1。2.3.4 模型驗證通過Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選出全蝕病生防菌株YB-81發(fā)酵培養(yǎng)基的3個影響因素，模型理論條件牛肉膏+葡萄糖（1:1）0.53%,蛋白陳0.99%,氯化鈉0.20%,這3個主要因素對菌株YB-81生長條件存在顯著影響。在此條件下進(jìn)行驗證試驗，經(jīng)3次平行驗證試驗，取平均值，實際菌落總數(shù)為18.8億個?mL-1，與模型預(yù)測值基本相符，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了72%，對全蝕病菌抑制率達(dá)到

11、87.2%，較優(yōu)化前提高了32.5%3 結(jié)論與討論小麥全蝕病是小麥上的一種毀滅性病害，民間俗稱“小麥癌癥”。枯草芽孢桿菌YB-81菌株經(jīng)過室內(nèi)生測、盆栽試驗、田間試驗已驗證其對小麥全蝕病有較好的抑制作用，同時通過拌種處理，菌株進(jìn)入土壤，能夠改善土壤環(huán)境，對小麥全蝕病的長期預(yù)防與防治大有益處。目前該菌株專利已授權(quán)（專利號201010199739.1）。利用該生防菌株研發(fā)的微生物菌劑已經(jīng)得到了農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥大田試驗批準(zhǔn)證書（農(nóng)藥試驗證號：SY20100169D,已完成農(nóng)藥大田試驗，正在登記，該菌株在生產(chǎn)上的應(yīng)用前景廣泛。在大規(guī)模生產(chǎn)菌劑前，對菌株YB-81的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，能夠確定一套產(chǎn)率最大、最節(jié)約的發(fā)酵模式。傳統(tǒng)上對于生防菌株的發(fā)酵通常采用單因素試驗和正交試驗