1、    肝細(xì)胞內(nèi)源性-葡萄糖醛酸酶 與膽紅素結(jié)石關(guān)系的免疫電鏡研究        【摘要】目的了解內(nèi)源性-葡萄糖醛酸酶(-G)與膽 紅素結(jié)石 的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫電鏡膠體金探針技術(shù)對膽紅素結(jié)石組與健康對照 組人肝細(xì)胞溶酶體內(nèi)源性-G進(jìn)行定量比較研究。結(jié)果膽紅素結(jié)石組( n=28)肝細(xì)胞溶酶體-G測定為(16.5±4.3)個/m2，明顯高于健康對照組(n =30)-G測定(10.1±2.9)個/m2(P0.01)；兩組同性別個體間比較差異亦有 顯著

2、意義(P0.01)。膽紅素結(jié)石組內(nèi)不同個體-G測定與年齡、性別、結(jié)石大小、 病程長短、腹痛、黃疸、發(fā)熱等因素均無關(guān)(P0.05)。結(jié)論內(nèi)源 性-G作為人體內(nèi)活性酶，在膽紅素結(jié)石及健康人間存在著差異，與膽紅素結(jié)石的形成密 切相關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】膽紅素結(jié)石免疫電鏡-葡萄糖醛酸酶肝細(xì)胞溶酶體Immunological electron microscopic study on relationship between hepatocytic endogenous -glucuronidase and pigment stone formationYANG Bo, ZHU Shande, ZHAO Yon

3、gguang. Military Region, et al. Department of Hepato biliary Surgery, General Hospital of Shenyang, Shenyang 110015【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between end ogenous -glucuronidase (-G) and formation of pigment stones. Methods Comparison was made for number of lysozymes counted b

4、y immunological e lectron microscopy and colloid gold probe in human hepatic cells between patient s with pigment stones and healthy controls. Results-G granul ations in hepatic cells were 16.5±4.3/m2 in the pigment stone group and wer e 10.1±2.9/m2 in the control gone (P0.01). The differe

5、nces of the amount of -G granulations were not significant when the patients with pigmen t s tones were subdivided by age, sex, size of stones, duration of illness, abdomina l pain, jaundice, fever (P>0.05). ConclusionsThe amount of e ndogenous -G is significantly different between patients with

6、pigment stones and healthy controls, and this might be closely related to the formation of pigm ent stones.【Key words】Pigment stoneImmunological electron microscop ey-glucuronidaseHepatocytic lysozyme膽道感染時細(xì)菌繁殖產(chǎn)生大量外源性-葡萄糖醛酸酶(-G)，水解結(jié)合型 膽紅素成非結(jié)合型膽紅素，后者與高分子物質(zhì)及鈣質(zhì)結(jié)合致石的膽紅素結(jié)石細(xì)菌酶解學(xué)說已 被公認(rèn)1，2。近年來有國外學(xué)者提出，人體組織自身內(nèi)

7、源性-G的質(zhì)和量與膽 紅素結(jié)石形成有關(guān)3。本文選取正常人及膽紅素結(jié)石肝細(xì)胞為研究對象，參照肝 細(xì)胞研究模型4，應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)對其關(guān)系進(jìn)行探討，旨在尋找形態(tài)學(xué)證據(jù)。 材料與方法1.實驗對象：膽紅素結(jié)石組：經(jīng)病理檢查證實的肝內(nèi)外膽管膽紅素結(jié)石肝組織標(biāo)本 28例，男18例，女10例，年齡2278歲，平均42.5歲。健康對照組：正?；顧z肝組織標(biāo)本3 0例，男16例，女14例，年齡2469歲，平均40.8歲。二組間性別，年齡分布比較，差異無 顯著意義(P0.05)。以上病例為1995年至1998年沈陽地區(qū)部分醫(yī)院住院病人。2.標(biāo)本制備：留取新鮮組織標(biāo)本，分別切成1 mm3小組織塊，立即投入Carson

8、-Millong液 中固定4 h，PBS液沖洗數(shù)次，逐級乙醇脫水，White樹脂包埋。低溫聚合，超薄切片機(jī) 下制成7080 nm連續(xù)切片，貼附于鎳網(wǎng)上，各取2張，隨機(jī)分成對照組和實驗組，每組56 張。浸濕的鎳網(wǎng)室溫下在1100兔抗人多克隆抗-G抗體(美國阿拉巴馬大學(xué)Ho KJ教授 惠贈中孵育2 h，行第抗體染色，PBS液沖洗后，125羊抗兔15 nm膠體金抗體再染色1 h ，行第抗體標(biāo)記，再行鈾-鉛復(fù)染，徹底沖洗后，CM10型透射電鏡觀察。對照組中不加 抗，用蒸餾水代替抗，其余實驗條件與實驗組相同。具體方法參照文獻(xiàn)4。3.計數(shù)與統(tǒng)計方法：計數(shù)方法參照Weidener等5法，隨機(jī)拍照10個任意分

9、布區(qū)， 照片最后同樣放大27?500倍，再輸入IPS-500型像分析儀處理，以1 m2為單位 ，測取肝細(xì)胞溶酶體內(nèi)金標(biāo)顆粒的數(shù)目。統(tǒng)計學(xué)處理：選取t檢驗。結(jié)果膽紅素結(jié)石及健康對照組，兩組兩性肝細(xì)胞溶酶體內(nèi)-G測定，見表1。表1兩組兩性肝細(xì)胞溶酶體-G測定結(jié)果及 比較組別例數(shù)金顆粒計數(shù)(個/m2)±s男女合計 男女合計膽紅素結(jié)石組18102816.8±4.416.2±4.216.5±4.3健康對照組16143010.1±2.910.1±2.810.1 ±2.9兩組比較:t5.17*4.28*6.69* P0.01無論男、女，兩

10、組間肝細(xì)胞溶酶體-G均以結(jié)石組高于對照組，差異有極顯著意義，均P 0.01。膽紅素結(jié)石組內(nèi)不同因素與內(nèi)源性-G關(guān)系比較見表2。表2膽紅素結(jié)石組不同因素與-G間相互關(guān) 系比較不同因素例數(shù)金顆粒計數(shù)(個/m2)t值性別男女181016.8±4 .416.2±4.20.351年齡(歲)42.542.5121617.0±4.616.1±4.00 .553結(jié)石大小(cm)1.51.5171116.4±4.416.8±4.70 .229病程(年)31.5141415.8±4.217.0±4.80.704腹痛無有52317.3&

11、#177;4.815.6±4.20.802黃疸指數(shù)(U)202020816.4±4.316.8±4.40.221發(fā)熱()37.037.019915.2±3.817.2±4.9 1.185均P0.05討論免疫電鏡技術(shù)是先進(jìn)的微觀形態(tài)學(xué)研究方法，其膠體金探針具有特異性強(qiáng)，分辨率 高，準(zhǔn)確定位，精確定量的特征，應(yīng)用肝細(xì)胞研究模型對細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)-G進(jìn)行形態(tài)學(xué) 研究，具有重要意義。有研究表明，-G是哺乳動物體內(nèi)組織及體液中的酸性水解酶，完成如下生理功能：第一 ，與類固醇激素的結(jié)合作用；第二，對結(jié)合的葡萄糖醛酸苷的水解作用；第三，參與細(xì)胞的 增生6。其中

12、-G對結(jié)合的葡萄糖醛酸苷的水解作用與膽紅素結(jié)石形成關(guān)系密切 。人體-G有內(nèi)源性和外源性之分，其中外源性-G，即膽道感染細(xì)菌繁殖產(chǎn)生的-G ，在膽紅素結(jié)石形成中所起作用已得到肯定。細(xì)菌酶解學(xué)說認(rèn)為，膽紅素結(jié)石形成與膽道感 染細(xì)菌繁殖產(chǎn)生外源性-G的量，作用的內(nèi)環(huán)境(如pH，最適為7.0)，以及其抑制物的量 與程度有關(guān)1。關(guān)于內(nèi)源性-G，Ho等3認(rèn)為是機(jī)體自身組織細(xì)胞產(chǎn) 生，合成并分泌的，所有哺乳類組織均存在，其中肝臟特別豐富。它的最適pH為4.6，在適 宜情況下，也能水解膽汁中的結(jié)合型膽紅素，因而結(jié)石可以在膽總管及肝內(nèi)膽管中形成并增 大。目前內(nèi)源性-G質(zhì)與量與膽紅素結(jié)石形成是否有關(guān)，國內(nèi)外學(xué)者尚

13、無統(tǒng)一認(rèn)識。本文 作者應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)對肝細(xì)胞溶酶體內(nèi)-G進(jìn)行定量研究是內(nèi)源性-G與膽紅素結(jié)石成 因關(guān)系形態(tài)學(xué)研究的初次探討。實驗結(jié)果表明，內(nèi)源性-G在正常人肝細(xì)胞及膽紅素結(jié)石病人肝細(xì)胞溶酶體中含量測定差 異有非常顯著意義，即膽紅素結(jié)石個體比正常人體內(nèi)源性-G含量增高。實驗結(jié)果還表明 ，在膽紅素結(jié)石不同病人個體間內(nèi)源性-G含量與其性別、年齡、結(jié)石大小、病程長短及 腹痛、黃疸、發(fā)熱等因素均未見明顯關(guān)系。本研究以形態(tài)學(xué)依據(jù)表明，內(nèi)源性-G作為人體內(nèi)一種活性酶，是膽紅素結(jié)石形成的相關(guān) 因素之一。提示：人類不同個體間內(nèi)源性-G含量的差異，可能與膽紅素結(jié)石的形成密切 相關(guān)。基金項目：遼寧省自然科學(xué)基金資

14、助(962252)項目作者單位：楊波(110015沈陽市，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科)朱善德(110015沈陽市，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科)趙永光(110015沈陽市，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科)岳輝(110015沈陽市，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科)杜曉炬(110015沈陽市，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科)李蔭山(110015沈陽市，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科)張弘(中國醫(yī)科大學(xué)病理教研室)于眾(中國醫(yī)科大學(xué)病理教研室)于安民(中國醫(yī)科大學(xué)病理教研室)參考文獻(xiàn)1，黃志強(qiáng).原發(fā)性肝膽管結(jié)石癥.吳階平，裘法祖，主編. 黃家駟外科學(xué).第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994.1393-1395.2，高靜濤，裴德愷.膽道的病理

15、生理學(xué).施維錦，主編.膽道外科學(xué).上海：上 海科學(xué)技術(shù)出版社，1993.52-54.3，Ho KJ. Pathogenesis of the formation of pigment gallstones. The role of human biliary -glucuronidase. Med Today, 1992, 159:694-697.4，楊波，朱善德，杜曉炬，等.人肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)-葡萄糖醛酸酶分布的 定位定量研究及意義.中華實驗外科雜志，1996，13：342-343.5，Weidener Noel, Semole JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis an d metastasis