1、建立FQPCR定量體系檢測新型隱球菌CAP10 mRNA                        作者：戴琳孫， 林旎， 陳勇， 江凌程祖建， 歐啟水    【摘要】  目的 建立熒光定量PCR（FQPCR）技術定量檢測新型隱球菌（CN）的莢膜相關蛋白10（CAP10）基因mRNA，為新型隱球菌的診斷、

2、預后及療效判斷提供依據。 方法 用逆轉錄PCR的方法從CN標準株（ATCC34874）中擴增得到CAP10，構建重組質粒標準品pGEMTEasyCAP10，以倍比稀釋的標準品制備標準曲線。設計引物和探針，建立FQPCR反應體系并對其重復性、特異性和線性范圍進行評價。 結果 成功構建了重組質粒標準品pGEMTEasyCAP10，并用倍比稀釋的標準品制備了標準曲線Y=-3.11X+38.84。批內重復性試驗CV值為0.31%，批間重復性試驗CV值為2.73%。FQPCR體系能特異擴增新型隱球菌，特異性好，該體系的線性范圍為101copies/L108 copies/L。 結論 成功建立CN的CAP

3、10 mRNA的定量檢測方法；該方法重復性好，特異性強。     【關鍵詞】  細胞莢膜； 隱球菌，新型； 真菌蛋白質類； 逆轉錄聚合酶鏈反應； mRNA，信使    新型隱球菌（cryptococcus neoformans，CN）的莢膜相關蛋白10（capsule associated protein 10，CAP10）對莢膜的形成是必不可少的，它在毒力的形成和維持中起至關重要作用12。傳統的實驗診斷項目，如腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）隱球菌計數、抗原測定和培養等手段靈敏度

4、低、耗時長，無法準確評估CN的毒力和活力3。本研究擬建立實時熒光定量PCR（realtime fluorescent quantitative PCR，FQPCR）技術檢測CN的CAP10基因mRNA，既可為CN的診斷，尤其是毒力和活力的判斷提供敏感、特異的定量手段，又可為治療CN的效果和預后判斷提供依據。        1  材料與方法        1.1  材料  CN標準菌株（ATCC34874）購自上海第二軍醫大學附

5、屬長征醫院皮膚病學研究所；結核桿菌由福州市肺科醫院提供，腦膜炎雙球菌和金黃色葡萄球菌由本室分離保存；RNA提取Trizol試劑自（美國invitrogen公司）；Reverse Transcription System、Taq DNA聚合酶、緩沖液、dNTP及pGEMTEasy Vecto購自（美國Promega公司）；DNA純化回收試劑盒、普通質粒小提試劑盒和真菌裂解液及溶壁酶自（北京天根生化科技公司）。        1.2  RNA的提取及逆轉錄反應  取CN標準株及CSF標本離心沉淀物，加入溶壁酶

6、20 L混勻后37 水浴30 min破壁，離心棄上清，按Trizol RNA提取試劑盒說明書操作抽提RNA。取上述總RNA按試劑盒說明進行逆轉錄反應，被逆轉錄的為CN的mRNA。        1.3  引物與探針的設計與合成  比對CN 5種血清型（A、B、C、D、AD）CAP10基因，尋找同源序列，用Primer 5設計CAP10特異性引物和探針（53）：        上游：CCAAGCCCCCAAACCTCCCATACA

7、0;       下游：AACGCGTACCATTCATCAAAGCCC        TaqMan探針：CCTCTTCTTGTACTCAGCAACGGC        TTCGGGCAA        探針5'端由FAM標記，3'端由TRAMA標記。引物及探針均由美國invitrogen公司合成并純化，目的片段

8、大小為175 bp。        1.4  標準品的制備  （1）目的DNA片段的制備：PCR反應體系含Mg2（25 mmol/L）3 L，10×buffer 2.5 L，dNTP（10 mmol/L）0.5 L，上下游引物（25 mol/L）各0.25 L，Taq聚合酶（5 U/L）0.3 L，DNA模板3 L，加滅菌純水至總體積為25 L。反應條件為94 5 min，94 45 s56 45 s72 45 s，35循環，72 延伸7 min。1.5瓊脂糖凝膠電泳(電壓6080 V，電流強度

9、2030 mA)，檢測PCR產物。（2）載體的構建、鑒定和拷貝數的換算：采用膠回收試劑盒純化回收切下的瓊脂糖凝膠上的目的片段，目的片段與質粒pGEM T連接，轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5中, 37 過夜培養，篩選出重組體，提取質粒，擴增，根據電泳結果，重新將重組體培養至LB培養基，37 搖床過夜，純化質粒，送上海生工公司測序，測吸光度(D)值,根據阿佛加德羅常數(6.023×1023 分子數/摩爾)換算為分子拷貝數。        1.5  FQPCR反應體系的建立  （1）標準曲線的制備：利

10、用ABI7000 Sequence Detector儀器在最優化的反應體系及反應條件下，將插有目的DNA的質粒10倍倍比稀釋成107，106，105，104，103拷貝數/微升，用作定量標準品制備標準曲線，以此定量未知模板的濃度。（2）FQPCR反應及條件：25 L體系中包括Mg2（25 mmol/L）3.5 L，10×buffer 2.5 L，dNTP（10 mmol/L）0.5 L，上下游引物（25 mol/L）各0.25 L，Taq聚合酶（5 U/L）0.3 L，熒光探針0.3 L和1 L倍比稀釋的陽性質粒標準品。反應條件：94 5 min，94 45 s56 45 s，35個

11、循環。儀器根據陽性質粒標準品自動繪制標準曲線，并得出樣品檢測結果。        1.6  方法學評價  (1)重復性試驗：包括批內和批間重復性試驗。以提取的質粒DNA為模板進行重復性檢測，批內重復性試驗是對同一模板同時進行6次重復測定，批間重復性試驗是連續6 d對同一樣本進行重復測定。(2)特異性試驗：分別取臨床上常見的腦膜炎病原體含結核桿菌、腦膜炎雙球菌、金黃色葡萄球菌各一份按標準品目的基因片段的方法制備cDNA作為模板，判斷擴增反應特異性。(3)線性范圍測定：將定量標準品用ddH2O進行10倍倍比稀

12、釋，以此作為模板進行FQPCR，得到標準曲線，通過對每一濃度標準品的熒光曲線形狀和各濃度熒光曲線的相關性大小，確定檢測線性范圍。    2  結  果        2.1  重組質粒的鑒定  重組質粒中插入的CAP10基因片段進行測序并與BLAST比對，結果顯示被測基因片段序列與GenBank報道的完全一致。結果提示，獲得了正確的目的基因，同時成功構建pGEMTEasyCAP10重組質粒(圖1)。     

13、;   2.2  重組質粒的定量  提取的質粒測其D值，D=0.073，D260=0.068，D260/D280=1.6，計算得質粒DNA濃度為5.0×1012拷貝數/微升。        2.3  標準曲線  (1)將重組質粒模板依次稀釋成107、106、105、104、103拷貝數/微升濃度梯度，在ABI7000擴增儀上進行擴增反應，得到重組質粒pGEMTEasyCAP10標準品的定量標準曲線Y=-3.11X+38.84（如圖2），不同濃度模板拷貝數與

14、Ct值之間有很好的線性關系（r=0.998）。(2)重組質粒pGEMTEasyCAP10標準品的擴增曲線，如圖3。橫坐標為Ct值，縱坐標為拷貝數.        2.4  方法學評價        2.4.1  重復性試驗  （1）批內重復性試驗：對同一模板同時進行6次重復測定，測得Ct值為22.27，22.37，22.22，22.23，22.17，22.20，平均Ct值為22.24，批內CV值為0.31%（圖4）。（2）批間

15、重復性試驗：連續6 d對同一樣本進行定量PCR檢測，測得的Ct值為18.5，18.7，19.8，18.8，19.6，19.0，平均Ct值為19.1，批間CV值為2.73%?？梢姳緦嶒灅嫿ǖ膶崟r熒光定量PCR檢測方法具有良好的重復性。        2.4.2  特異性試驗  FQPCR檢測結果，新型隱球菌標準品有熒光曲線增長，而其余孔無熒光曲線增長(圖5)。表明該方法具有良好的特異性。        2.4.3  線性范圍測定

16、  當標準品濃度>108 拷貝數/微升時，擴增曲線不呈典型“S”形，且標準曲線相關性不好，當標準品濃度<101拷貝數/微升時，擴增曲線也不典型，有時因濃度太低甚至無擴增曲線。而在此范圍間，擴增曲線均呈典型“S”形，故認為建立的CAP10基因的FQPCR系統的檢測線性范圍為101108  拷貝數/微升(圖6)。    橫坐標為擴增循環數，縱坐標為熒光強度.  藍色、紅色、綠色、紫色分別為新型隱球菌、結核桿菌、腦膜炎雙球菌、金黃色葡萄球菌.        3

17、  討  論        目前CN的實驗室診斷主要依據CSF印度墨汁染色、培養及CN抗原測定等，這些方法的陽性率不高、耗時長、無法準確判斷CN的活力和毒力。一些文獻報道，用PCR法檢測CN，但針對的靶基因不是毒力相關基因4。長期困擾臨床醫師的問題是，有的病人CN數目不多，可是其臨床癥狀嚴重，有的病人CN數量很多，臨床癥狀卻較輕。另外CN的數量和病情的轉歸之間缺乏相關性，使得醫師無法判斷療效和預后。        本實驗以毒力相關因子C

18、AP10為研究對象，建立FQPCR定量檢測CN的CAP10 mRNA，可提升CN的診斷靈敏度。由于直接檢測決定致病性的隱球菌的毒力，可為療效觀察、預后判斷及病情轉歸的預測提供幫助。此外，實驗表明，相對于DNA，已死亡致病菌mRNA不穩定，直接檢測致病菌的mRNA能夠真實地反應其活力狀態。mRNA檢測不但可以反應感染局部致病菌的有無還可以判斷致病菌的存活狀態56。        本實驗將FQPCR法應用于CN莢膜基因CAP10的檢測，所建立的定量檢測體系有如下特點：（1）特異性強，其他細菌和真菌不對FQPCR反應產生干擾；（2

19、）重復性好，批內重復實驗及批間重復實驗變異系數均<3%；（3）靈敏度高，該檢測體系線性范圍為101108拷貝數/微升，能滿足CAP10定量檢測需要；（4）操作簡便、易行。本實驗所使用的Taqman探針是目前常用的熒光探針之一，國內很多生物工程公司都能合成，且整個實驗過程包括抽提RNA、PCR反應等，操作都不復雜。        此外，FQPCR中的標準品也是該技術能否準確定量模板的基礎和關鍵。本實驗獲得的pGEMTEasyCAP10重組質粒穩定、純化方法簡單、易于定量測定、易于大量擴增、純化和保存，是FQPCR中最常使

20、用的定量標準品。因此完全可以滿足臨床對CN CAP10 mRNA的定量測定。    【參考文獻】  1 Chang Y C,KwonChung K J. Complementation of a capsuledeficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulenceJ. Mol Cell Biol, 1994,14(7):49124919.2 Chang Y C,Chung K. Isolation, characterization, and localization of a capsuleassociated gene, CAP10, of Cryptococcus neoformansJ. Journal of Bacterbiology, 1999,181(18):56365643.3 Harrison T S. Cryptococcus neoformans and Cryptococcosis J.