1、    人B淋巴母細胞株Yam 1B產生具有 免疫抑制作用的因子        【 摘要 】目的對Yam 1B細胞自發產生的一種可抑制人T、B細胞增殖的可溶性因子(Yam-SF)進行研究。方法3H-TdR摻入法進行淋巴細胞增殖抑制測定，ELISA法測定免疫球蛋白，間接免疫熒光法測定IL-2R，CTLL-2細胞3H-TdR摻入法測定IL-2活性。結果Yam-1B培養上清(Yam-SF)經pronase水解消化而失活，經56處理10分鐘，或在pH10環境中處理

2、6小時抑制活性喪失，在pH2.0環境中可保持其抑制活性。凝膠過濾試驗表明，培養上清抑制活性分布在分子量4300067000范圍內，且TGF-抗體不能阻斷其抑制活性。 結論Yam-SF可能是一種新的免疫調節因子，該因子可抑制人T細胞及B細胞的增殖，并抑制正常B細胞免疫球蛋白的產生，但對PHA剌激的人淋巴細胞IL-2的產生以及IL-2受體(IL-2R)的表達無抑制作用。【 主題詞 】免疫調節細胞因子B淋巴母細胞 A soluble immunosuppressive factor released by Yam 1B cell of a human B-lymphoblastoid cell li

3、neZhang Yongfa*,Ruan Linhai, Zhang Yuzhen,et al.*Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003AbstractYam 1B,a human B lymphoblastoid cell line, spontaneously produced an immunoregulatory factor,which suppressed the proliferation of human T and B lymphocytes and inhibited immunoglobulin generation by nor

4、mal B cells.The serum-free Yam 1B culture supernatant inhibited neither the expression of IL-2 receptor nor the production of IL-2 in the lymphocytes stimulated with PHA. The inhibitory activity of Yam 1B supernatant(Yam-SF) was inactivated at 56 for 10 min and at pH10.0 for 6h and abrogated by dige

5、stion with pronase, but remained at pH2.0. Gel-filtration column assay showed a peak of inhibitory activity in the fraction containing molecules of apparent MW of 43kD to 67kD. The inhibitory activity was not blocked by the anti-TGF-beta antibody. These results indicate that Yam-SF appear to produce

6、 a novel immunoregulatory factor.Subject wordsImmunoregulationCytokinsB lymphoblastoid cells在自身免疫病等難治性免疫相關疾病的發病機制中，免疫調節功能失調及變態反應發揮著重要作用。而近年來的一系列研究表明，由B細胞產生并釋放的細胞因子在免疫調節以及變態反應的調節中極為重要15，在這些因子中，既有增殖因子也有包括TGF-在內的非特異性抑制因子6，7。1993年，日本學者森川等從一成人T細胞性白血病(ATL)患者末梢血細胞中建立了Yam 1B細胞株，該細胞株細胞膜表面表達SmIgG及CD23等B細胞表面標記

7、，細胞內IgM+，培養液中有少量IgM(10100ng/ml)釋放，T細胞系、髓系及粒系表面標記陰性，ATL病毒相關抗原(ATLA)陰性，表明Yam 1B細胞為B細胞系細胞8。我們的初步實驗發現，Yam 1B 細胞在培養中可自發產生一種對人T細胞及B細胞增殖具有抑制作用的可溶性因子。我們對該抑制因子(我們稱之為Yam-SF)進行了詳細的研究。材料與方法試劑與單克隆抗體：RPMI 1640培養基、PHA-P、ConA、PMA、SAC、Ficoll-Hypaque、Sephacryl S-300以及3H-TdR均購自華美公司，鼠抗人TGF-抗體及TGF-購自Pharmacia公司。細胞株：Yam

8、1B 由日本島根大學森川茂教授惠贈，CTLL細胞為本室保存，B淋巴細胞株1E8和前B淋巴細胞株679均購自ATCC公司。Yam 1B細胞培養上清抑制因子：5×105/ml Yam 1B細胞于無血清RPMI 1640培養基中培養72小時，收獲上清，濃縮50700倍備用。取濃縮培養上清過Sephacryl S-300層析柱，并檢測其淋巴細胞增殖抑制活性。淋巴細胞制備：將手術摘出的人扁桃體制成單細胞懸液，以Ficoll-Hypaque密度梯度離心，收集單個核細胞，以花環沉降分離法9分離純化T細胞和B細胞。為進一步純化B細胞，上述方法中收集非花環形成細胞以Percoll不連續梯度離心(4，2

9、500r/min,25分鐘)，收集60%/70%界面間細胞即獲得高密度小B淋巴細胞。健康人外周血淋巴細胞的制備方法同上。淋巴細胞增殖抑制試驗：以含10%胎牛血清的RPMI 1640制備106/ml的淋巴細胞懸液，于96孔板中加入105/孔，然后分別加入一定劑量的PHA-P、ConA、PMA或SAC。實驗組加入50倍濃縮的Yam 1B培養上清，使每孔液體量達到0.2ml；空白對照組則加入等量的RPMI 1640；1E8或679對照組則加入等量的50倍濃縮的1E8或679細胞培養上清，于5% CO2，37條件下培養72小時，收獲前8小時加入3H-TdR10l，使其終濃度為18.5kBq(0.5Ci

10、)/ml，收獲并測定其3H摻入量。免疫球蛋白產生及檢測：105/孔人外周血單個核細胞(RBMNC)或扁桃體MNC在PWM(最終稀釋度150)存在或不存在條件下，加入或不加入50倍濃縮的Yam 1B或1E8或679培養上清，于5% CO2，37條件下培養7天，收集培養上清，以ELISA法測定其中IgM和IgG含量。IL-2的產生，IL-2R表達及檢測：105/孔 PBMNC在PHA-P(最終稀釋度1100)存在或不存在條件下，加入或不加入50倍濃縮的Yam 1B或1E8或679培養上清，于5% CO2，37條件下培養48小時，分別收集細胞及培養上清，采用間接免疫熒光法測定IL-2R10，上清中I

11、L-2活性測定采用CTLL-2細胞3H-TdR摻入法11。結果Yam 1B上清對T、B淋巴細胞增殖的抑制作用：如1A所示，Yam 1B培養上清可顯著抑制PHA-P、ConA及PMA剌激的T細胞增殖反應，而且這一抑制作用呈明顯的Yam 1B上清濃度依賴性，當加入不經稀釋的50倍濃縮的Yam 1B培養上清時，T細胞的增殖被完全抑制；Yam 1B培養上清對SAC及PMA剌激的B細胞增殖也呈濃度依賴抑制(1B)。而1E8及679培養上清則無抑制作用。1Yam 1B上清對扁桃體T、B淋巴細胞增殖的抑制作用Fig 1. Inhibitory effect of Yam 1B supernatant on

12、the proliferation of tonsil T(A) or B(B) lymphocytes A:PHA,Con A,PMA;B:PMA,SAC2Yam 1B 上清抑制活性分析Fig 2. Analysis of the inhibitory activity of Yam 1B supernatant 3H-TdR incorporation of PHA-P stimulated PBMNC;Protein concentration-;Molecular weight markers: Ferritin,LDS,BSA,OA,Cyt CYam 1B上清抑制免疫球蛋白的產生：在

13、PWM剌激下，PBMNC和扁桃體MNC可產生IgM和IgG型免疫球蛋白，其中PBMNC產生免疫球蛋白的能力明顯高于扁桃體MNC，且以產生IgM為主。當在培養體系中加入Yam 1B培養上清時，則PBMNC和扁桃體MNC免疫球蛋白的產生均受到明顯抑制，而且，這一抑制作用呈明顯的Yam 1B上清濃度依賴性(表1)。而1E8及679培養上清則無抑制作用。 表1Yam 1B培養上清對PWM剌激的PBMNC和扁桃體MNC免疫球蛋白產生的影響Table 1. Effect of Yam 1B supernatant on the immunoglobulin productionin PBMNC or to

14、nsillar MNC culture system stimulated by PWMCell source PWMYam-SF(%, vol/vol)Amount of Ig(ng/ml)IgMIgGPBMNC0423100208770896865530112113.12659187*610112* 6.21346165*300100*12.51125122*16268*251151103*8940*TonsillarMNC01026224972027552032293200 3.121872431477238*6.21339116*124176*12.5104155*56762*2511

15、1279*44677*P0.01 compared with “PWM()， Yam-SF(0)” group Yam-SF的理化性質：Yam 1B培養上清在pH10的環境中處理6小時其抑制活性喪失，而在pH2.0的環境中則可保持其抑制活性；當將其加熱至56處理10分鐘也可使其失活，而-20凍存則可保持其活性；以蛋白水解酶，如pronase處理該培養上清同樣可使其失活。凝膠過濾實驗表明，培養上清抑制活性分布在分子量(4367)×103范圍內，其峰值活性位于48.5×103(2)。Yam-SF與TGF-活性比較：105PBMNC在PHA-P(最終稀釋度1100)剌激下培養3天

16、，可出現明顯的淋巴細胞增殖反應，而當加入Yam 1B培養上清(終濃度12.5%vol/vol)后，這種增殖反應受到明顯抑制，且Yam 1B培養上清對淋巴細胞增殖反應的抑制作用不被TGF-抗體所阻斷；同樣，加入TGF-(終濃度1ng/ml)后，這種增殖反應受到明顯抑制，但TGF-對淋巴細胞增殖反應的抑制作用則被TGF-抗體所完全阻斷(表2)。Yam 1B培養上清對IL-2受體及IL-2產生的影響：如表3所示，PBMNC在PHA-P剌激下培養48小時，可有明顯的IL-2產生，加入Yam 1B培養上清對IL-2的產生無影響；Yam 1B培養上清對IL-2受體的產生也無抑制作用。1E8及679培養上清

17、亦無抑制作用。表2抗TGF-抗體不能阻斷Yam 1B培養上清的抑制活性Table 2. Antibody to transforming growth factor-beta does notblock the inhibitory activity of Yam 1B supernatantGroupPHAYam-SFAnti-TGF-antibodyTGF-Lymphocyte proliferation3 H-TdR incorporation(cpm)1-3656519282-2011386*3-2298295*4-3528320435-7221216-15283347-8121008

18、-2355152*9-342392780*10-710132*P0.01 compared with group 1, *P0.05 compared with group 2, *P0.001 compared with group 8 表3Yam 1B培養上清對PBMNC IL-2產生及IL-2R表達的影響Table 3. Effect of Yam 1B supernatant on the production of IL-2and the expression of IL-2R of PBMNCPHA-PYam-SFNIL-2(U/ml)IL-2R(%)-3.

19、7-12121.6011.950.25.3612116.1010.0*51.15.77*-125.5*P0.05 compared with “PHA-P(), Yam-SF(-)” group 討論在參與免疫應答及其調節的細胞因子中，有增殖因子，如IL-2等，也有抑制因子，如TGF-、IFN-6，7等。其中由B細胞產生的抑制因子主要有IFN-及TGF-等。我們的結果顯示，Yam 1B，一株來源于ATL患者外周血的B淋巴母細胞細胞株可以產生并分泌一種蛋白質類免疫抑制因子，這一抑制因子(Yam-SF)在pH10的環境中處理6小時其抑制活性喪失，而在pH2.0的環境中則可保持

20、其抑制活性；當將其加熱至56處理10分鐘也可使其失活，而-20凍存則可保持其活性；以蛋白水解酶，如pronase處理該培養上清同樣可使其失活。其分子量在(4367)×103范圍內，其峰值活性位于48.5×103。Yam-SF不但可以抑制T細胞及B細胞的增殖，而且可以明顯抑制IgG類及IgM類免疫球蛋白的產生，但不抑制IL-2的產生及IL-2受體的表達。從理化性質上來看，Yam-SF無論是分子量還是對pH及溫度的敏感性均與IFN-等存在著明顯的差異；而與TGF-相比，二者對pH及溫度的敏感性均無明顯的差異，即使其發揮作用的特點也存在著明顯的一致性；即二者的抑制作用均不通過IL

21、-2及IL-2受體調節系統。為此，我們進一步比較了Yam-SF與TGF-的活性，結果顯示，Yam-SF的抑制活性不能被TGF-抗體所阻斷，但TGF-的抑制活性可以被TGF-抗體完全阻斷，這一結果清楚地表明，Yam-SF與TGF-不是同一種細胞因子，盡管二者的理化性質及作用特點存在著明顯的一致性。關于Yam-SF的進一步研究尚在進行之中。本項目受河南省自然科學基金資助(9504162058)作者單位：453003 新鄉醫學院(張永法，張玉珍)；河南醫科大學一附院(宋永平)；洛陽醫學專科學校(阮林海)參考文獻1Adolf G R,Hass O A,Fischer P,et al.Spontaneo

22、us production of alpha and beta interferons in human lymphoblastoid and lymphoma cell lines. Arch Virol, 1982, 72169-178.2Gordon J,Ley S C,Melamed M D,et al.:Soluble factor requirements for the autostimulatory growth of B lymphoblasts immortalized by Epstein-Barr virus.J Exp Med,1984,1541554-1559.3F

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