1、CCL23/骨髓抑制因子1（MPIF?1）對(duì)于U937細(xì)胞的增殖、凋亡和分化的影響    作者：龔晴，鄭金娥，劉偉，劉黎瓊，李?瑩，黃士昂    【摘要】 CCL23/MPIF?1是人類趨化因子CC家族的一員，在血細(xì)胞中僅在單核細(xì)胞源的樹突狀細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)人、鼠的髓系祖細(xì)胞的增殖和分化均有明顯的抑制作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CCL23在兒童急性髓系白血病骨髓和外周血樣本均有高表達(dá)。為了了解CCL23的高表達(dá)在白血病進(jìn)展、治療和預(yù)后中的意義，選用白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞作為研究對(duì)象，加入人類重組CC

2、L23培養(yǎng)72小時(shí)，用CCK?8試劑盒測(cè)細(xì)胞增殖， FITC?AnnexinV/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，并觀察不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞分化情況及CCL23受體CCR1的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)为?dú)的CCL23對(duì)于U937細(xì)胞的增殖、凋亡和分化無明顯作用(P>0.05)；但在U937受PMA誘導(dǎo)分化的過程中， CCL23有明顯的促分化作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)此過程中CCR1表達(dá)顯著升高(P<0.05)。結(jié)論： CCL23對(duì)U937細(xì)胞無明顯抑制作用，但可能與PMA產(chǎn)生協(xié)同誘導(dǎo)分化作用，而且該作用的出現(xiàn)可能與CCL23受體CCR1表達(dá)升高有關(guān)。    【關(guān)鍵詞】 CC

3、L23/MPIF?1；U937細(xì)胞；細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡；誘導(dǎo)分化 Effect of CCL23/ Myeloid Progenitor Inhibitory Factor 1 (MPIF?1) on the Proliferation, Apoptosis and Differentiation of U937 Cells    Abstract    CCL23 is a human CC chemokine with potential suppression effects on both human a

4、nd murine myeloid progenitor cells both in vitro and in vivo, and only expressed and released by dendritic cells differentiated from monocytes in blood cells. However, recent study has shown that CCL23 was over?expressed in bone marrow and peripheral blood cells from pediatric patients with acute my

5、eloid leukemia (AML). In order to investigate the effects of CCL23 on the development, therapy and prognosis of leukemia, the U937 cells, a leukemic cell strain, were adopted and cultured with rhCCL23 for 72 hours. The cell proliferation and apoptosis rate were detected by Cell Counting Kit?8 and FI

6、TC?AnnexinV/PI respectively; the morphologic changes and the expression of CCR1 (the only receptor of CCL23 known by now) were observed during the differentiation process. The results showed that no obvious effect on the proliferation, apoptosis and differentiation of U937 was found by using CCL23 a

7、lone (P>0.05), but cultured in combination with CCL23 and PMA, the differentiation of U937 cells were promoted remarkably, during which the CCR1 expression increased (P<0.05). It is concluded that CCL23 alone did not inhibit the proliferation and differentiation of U937, while its use in combi

8、nation with PMA may possess synergistic effect on inducting differentiation of U937 through the increase of receptor CCR1 expression.    Key words    CCL23/ MPIF?1; U937 cell; cell proliferation; cell apoptosis; induction differentiation    

9、;CCL23，又稱骨髓造血祖細(xì)胞抑制因子（myeloid progenitor inhibitory factor?1, MPIF?1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3（macrophage inflammatory protein?3, MIP?3）、CK8、 CK8?1，是人類趨化因子CC家族（即類趨化因子）中的一員，于1997年在人主動(dòng)脈上皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)中分離得到1，其結(jié)構(gòu)與造血抑制因子巨噬細(xì)胞炎癥蛋白?1（MIP?1）高度同源2，3,。目前僅發(fā)現(xiàn)其與膜表面受體CCR1有高親和力 4，是其他類趨化因子MIP1和RANTES的競(jìng)爭(zhēng)配體1,2,5。CCL23在肝、肺、胰和骨髓組織中均有表達(dá)，且在單核

10、細(xì)胞分化的樹突狀細(xì)胞中持續(xù)釋放6，可以作為單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和靜止T細(xì)胞的趨化劑7。此外在鼠和人的骨髓干細(xì)胞體外克隆培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CCL23對(duì)定向祖細(xì)胞有劑量依賴性的抑制作用1,可以減慢細(xì)胞周期8，從而在化療過程中保護(hù)正常造血祖細(xì)胞抵抗化療藥物對(duì)快速增殖細(xì)胞的毒性作用9,10。同時(shí)其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也有抑制多形核白細(xì)胞和單核細(xì)胞生成和釋放的作用11。    中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志 J Exp Hematol 2007; 15(3)CCL23/骨髓抑制因子1（MPIF?1）對(duì)于U937細(xì)胞的增殖、凋亡和分化的影響最近一項(xiàng)研究在對(duì)急性髓系白血病（AML）患兒骨髓

11、和外周血的基因芯片篩查過程中，發(fā)現(xiàn)CCL23有異常的高表達(dá)，且其表達(dá)水平隨著化療進(jìn)行而下降，隨復(fù)發(fā)而升高12。U937細(xì)胞是一種白血病單核系細(xì)胞株，易被PMA、GM?CSF等誘導(dǎo)分化，常用來研究體內(nèi)造血過程13，14。本實(shí)驗(yàn)希望通過研究CCL23對(duì)于U937細(xì)胞增殖、凋亡和分化的作用,了解CCL23的表達(dá)在AML發(fā)病過程中可能的作用和對(duì)治療的影響，并為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。    材料和方法    實(shí)驗(yàn)材料    U937細(xì)胞由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院血液病研究所

12、惠贈(zèng)，rhCCL23（R&D公司產(chǎn)品）,PMA (Sigma公司產(chǎn)品)，培養(yǎng)液164010胎牛血清(Gibco公司產(chǎn)品），Cell Counting kit?8試劑盒（Technical Manual公司產(chǎn)品）, Annexin V?FITC kit試劑盒（Bender MedSystems公司產(chǎn)品），anti?CCR1(R&D公司產(chǎn)品), 流式細(xì)胞儀(FACSCaliburTM， Becton Dickinson公司產(chǎn)品), Elx800酶標(biāo)儀(Bio?TEK Instruments公司產(chǎn)品)。    方法  

13、60; 細(xì)胞培養(yǎng) 將U937細(xì)胞培養(yǎng)在配好的培養(yǎng)液中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。    細(xì)胞增殖檢測(cè) 將U937細(xì)胞以2×105/ml×100 l接種于96孔板中，加入試劑，在37、5 CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間。然后每孔加入CCK?8 10l，放入培養(yǎng)箱，3小時(shí)后用Elx800酶標(biāo)儀測(cè)吸光度。    細(xì)胞凋亡測(cè)定 將U937細(xì)胞以3×105/ml×1ml接種于6孔板中，加入試劑培養(yǎng)，用FITC?AnnexinV/PI法上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

14、0;   細(xì)胞分化觀察 觀察培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)由圓形或橢圓形懸浮細(xì)胞向梭形或形態(tài)不規(guī)則的貼壁細(xì)胞變化的情況。    CCR1的表達(dá)水平檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U937本身以及加入PMA（50 ng/ml）培養(yǎng)24小時(shí)后CCR1的表達(dá)水平。    統(tǒng)計(jì)學(xué)分析    用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。    結(jié)    果    CCL2

15、3對(duì)U937細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響    在試驗(yàn)組細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入CCL23（50 ng/ml），培養(yǎng)至24、48、72小時(shí)，鏡下觀察試驗(yàn)組細(xì)胞和未加CCL23的對(duì)照組細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及數(shù)量變化均無明顯差異。用CCK?8法衡量細(xì)胞生長(zhǎng)情況:加入CCK8孵育3小時(shí)后，測(cè)450 nm的吸光度，其吸光度值與細(xì)胞數(shù)量和生長(zhǎng)情況成正比。經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。培養(yǎng)24小時(shí)，對(duì)照組吸光度平均值為2.2±0.097，試驗(yàn)組為2.314±0.128；培養(yǎng)48小時(shí)，對(duì)照組2.176±0.135，試驗(yàn)組2.

16、288±0.143；培養(yǎng)72小時(shí)，對(duì)照組1.747±0.086，試驗(yàn)組1.733±0.141。兩組無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。    細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)結(jié)果： 對(duì)照組凋亡率為3.67%±0.47%，試驗(yàn)組為3.78%±0.55%，兩組均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)（圖2為3次實(shí)驗(yàn)中的1次檢測(cè)結(jié)果）。    CCL23對(duì)于U937分化的影響    首先比較了CCL23單用對(duì)U937細(xì)胞的分化是否有影響,結(jié)果

17、發(fā)現(xiàn)加入50 ng/ml的CCL23作用72小時(shí)后，試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞在形態(tài)上無明顯區(qū)別。隨后，本實(shí)驗(yàn)研究了CCL23對(duì)PMA誘導(dǎo)的U937細(xì)胞分化的影響。結(jié)果表明,在培養(yǎng)72小時(shí)后,與單獨(dú)使用PMA誘導(dǎo)的U937細(xì)胞相比,聯(lián)合使用PMA(50 ng/ml)和CCL23處理的U937細(xì)胞產(chǎn)生了更多的梭形貼壁細(xì)胞,表明CCL23在體外可能協(xié)同PMA誘導(dǎo)U937的分化。    為了進(jìn)一步了解CCL23和PMA的協(xié)同作用,我們用PMA(50 ng/ml)處理U937細(xì)胞24小時(shí),結(jié)果U937細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。隨后,用新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞

18、終止PMA的作用,然后將細(xì)胞等分為兩份,并向其中一份加入50 ng/ml的CCL23，而另一份未加CCL23作為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后觀察發(fā)現(xiàn),未添加CCL23的對(duì)照組U937細(xì)胞仍然維持為圓形懸浮細(xì)胞的形態(tài),而添加了CCL23的試驗(yàn)組中則出現(xiàn)了大量的梭形、多角形、不規(guī)則形狀的貼壁細(xì)胞(圖3)。    隨后對(duì)U937細(xì)胞分化標(biāo)志物CD14和CD11b表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。對(duì)照組細(xì)胞的CD14和CD11b的表達(dá)水平與其陰性對(duì)照相比，平均熒光強(qiáng)度比值(RFI) 小于2，表明其陽(yáng)性表達(dá)很低；而加入了CCL23的試驗(yàn)組細(xì)胞CD14和CD11b的表達(dá)水平有

19、明顯升高（RFI>2）。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)得的CD14表達(dá)的RFI值：對(duì)照組1.07±0.04，試驗(yàn)組2.45±0.07；測(cè)得的CD11b表達(dá)的結(jié)果：對(duì)照組1.14±0.05，試驗(yàn)組2.58±0.08。兩組間具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.01)，提示試驗(yàn)組的分化程度明顯高于對(duì)照組。    CCR1表達(dá)水平檢測(cè)    由于CCR1是目前CCL23唯一已知的受體,本研究通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCR1水平以了解PMA處理是否能誘導(dǎo)U937細(xì)胞中CCR1表達(dá)。 在試驗(yàn)組細(xì)胞的

20、培養(yǎng)液中加入PMA(50 ng/ml),而對(duì)照組細(xì)胞不加PMA,在相同條件下培養(yǎng)24小時(shí)后檢測(cè)。結(jié)果表明，未處理的U937細(xì)胞本身CCR1表達(dá)不明顯(RFI<2)，而經(jīng)過PMA誘導(dǎo)24小時(shí)后,CCR1的表達(dá)即明顯升高(RFI>2)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組RFI值為1.22±0.08，試驗(yàn)組為2.09±0.07（圖5）。兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。因此，PMA誘導(dǎo)的CCR1表達(dá)可能在CCL23和PMA的協(xié)同作用中發(fā)揮了重要作用。    討    論  &

21、#160; 經(jīng)過大量研究證實(shí)，CCL23作為一種骨髓祖細(xì)胞抑制因子，無論是在原代造血祖細(xì)胞的體外集落培養(yǎng)試驗(yàn)中，還是在體內(nèi)試驗(yàn)中，對(duì)于正常祖細(xì)胞，尤其是髓系祖細(xì)胞的增殖和分化均有明顯的抑制作用15。且其目前唯一已知的受體CCR1在正常骨髓造血細(xì)胞，包括各系造血祖細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中均有表達(dá)16,17,18。因此不難理解，為什么生長(zhǎng)旺盛的正常骨髓細(xì)胞不表達(dá)CCL236。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，CCL23在白血病病人的骨髓細(xì)胞中卻有高表達(dá)，其在白血病發(fā)病和進(jìn)展中的作用不明。僅在以往對(duì)于白血病病人骨髓細(xì)胞表面受體的篩查結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：白血病細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)受體CCR119。因此，CCL23對(duì)

22、于白血病細(xì)胞以及對(duì)白血病發(fā)病過程的實(shí)際作用情況有待研究。    U937細(xì)胞為白血病單核細(xì)胞株20，且本身無CCR1表達(dá)14，這樣相似的條件為我們研究推測(cè)CCL23對(duì)于白血病細(xì)胞的作用有所啟發(fā)。我們的研究發(fā)現(xiàn)：CCL23在體外對(duì)于白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞的增殖、凋亡和分化都并無明顯的直接影響,表明CCL23的高表達(dá)對(duì)白血病細(xì)胞自身并無明顯影響，但CCL23可能通過抑制正常祖細(xì)胞的增殖，從而為白血病細(xì)胞的增殖提供有利的環(huán)境。這與腫瘤壞死因子（TNF）作用十分類似：白血病細(xì)胞高表達(dá)TNF，后者對(duì)正常造血細(xì)胞有明顯的抑制作用，但白血病干細(xì)胞本身對(duì)該因子的抑制作

23、用并不敏感21。CCL23是否正是通過對(duì)周圍細(xì)胞產(chǎn)生一種旁分泌作用來調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)環(huán)境的，其中的具體機(jī)制還需實(shí)驗(yàn)證實(shí)，進(jìn)一步的深入研究可能為了解AML的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展新的化療方案提供新的思路。    本研究中意外的發(fā)現(xiàn)，盡管CCL23單用不能影響U937的分化,但CCL23與PMA在體外具有協(xié)同誘導(dǎo)U937細(xì)胞分化的作用；而且進(jìn)一步的試驗(yàn)表明，單獨(dú)的CCL23足以誘導(dǎo)經(jīng)過PMA預(yù)處理的U937細(xì)胞發(fā)生分化,這一作用并不需要PMA始終存在。U937細(xì)胞本身并不表達(dá)CCR1 14，但我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過PMA誘導(dǎo)后U937細(xì)胞的CCR1表達(dá)水平顯著上升。由于CCR1是

24、目前CCL23唯一已知的受體,這提示PMA誘導(dǎo)下CCR1的表達(dá)可能是CCL23產(chǎn)生作用的基礎(chǔ)。當(dāng)然,考慮到CCL23通過CCR1對(duì)正常骨髓細(xì)胞分化的抑制作用4,也不排除PMA處理誘導(dǎo)了其他CCL23未知受體表達(dá)的可能性,從而使得CCL23可以誘導(dǎo)經(jīng)PMA處理的U937細(xì)胞發(fā)生分化,其中詳細(xì)的信號(hào)通路以及分子機(jī)制有待深入研究。有意義的是，有研究發(fā)現(xiàn)GM?CSF也有誘導(dǎo)U937細(xì)胞表達(dá)CCR1的作用14，那么CCL23是否同樣可以與之協(xié)同誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的分化，以及CCR1在其中的作用機(jī)制如何？這些研究可能將有助于我們進(jìn)一步了解CCL23在AML發(fā)生發(fā)展機(jī)制和臨床治療中的作用和應(yīng)用前景。 【參考文獻(xiàn)

25、】 1Patel VP, Kreider BL, Li Y, et al. Molecular and functional characterization of two novel human C?C chemokines as inhibitors of two distinct classes of myeloid progenitors. J Exp Med, 1997; 185: 1163-11722Macphee CH, Appelbaum ER, Johanson K, et al. Identification of a truncated form of the CC ch

26、emokine CK beta?8 demonstrating greatly enhanced biological activity. J Immunol, 1998; 161: 6273-6279    3Pragnell IB, Wright EG, Lorimore SA, et al. The effect of stem cell proliferation regulators demonstrated with an in vitro assay. Blood, 1988; 72:196-2014Nardelli B, Tiffany

27、HL, Bong GW, et al. Characterization of the signal transduction pathway activated in human monocytes and dendritic cells by MPIF?1, a specific ligand for CC chemokine receptor 1. J Immunol, 1999; 162:435-4445Youn BS, Zhang SM, Broxmeyer HE, et al. Characterization of CKbeta8 and CKbeta8?1: two alter

28、natively spliced forms of human beta?chemokine, chemoattractants for neutrophils, monocytes, and lymphocytes, and potent agonists at CC chemokine receptor 1. Blood, 1998; 91: 3118-31266Nardelli B, Morahan DK, Bong GW, et al. Dendritic cells and MPIF?1: chemotactic activity and inhibition of endogeno

29、us chemokine production by IFN?gamma and CD40 ligation. J Leukoc Biol, 1999; 65:822-8287Forssmann U, Delgado MB, Uquccioni M, et al. CKbeta8, a novel CC chemokine that predominantly acts on monocytes. FEBS Lett, 1997; 408:211-2168Noh EK, Ra JS, Lee SA, et al. CKbeta8?1 alters expression of cyclin E

30、in colony forming units?granulocyte macrophage (CFU?GM) lineage from human cord blood CD34 cells. Exp Mol Med, 2005; 37: 619-6239Emilien G, Ponchon M, Caldas C, et al. Impact of genomics on drug discovery and clinical medicine. QJM, 2000; 93:391-42310Rajarathnam K, Li Y, Rohrer T, et al. Solution st

31、ructure and dynamics of myeloid progenitor inhibitory factor?1 (MPIF?1), a novel monomeric CC chemokine. J Biol Chem, 2001; 276: 4909-491611Shih CH, van?Eeden SF, Goto Y, et al. CCL23/ myeloid progenitor inhibitory factor?1 inhibits production and release of polymorphonuclear leukocytes and monocyte

32、s from the bone marrow. Exp Hematol, 2005; 33: 1101-110812Steinbach D, Schramm A, Eggert A, et al. Identification of a seven genes for the monitoring of minimal residual disease in pediatric acute myeloid leukemia. Clin Cancer Res, 2006; 12: 2434-244113Ragg SJ, Kaga S, Berg KA, et al. The mitogen?ac

33、tivated protein kinase pathway inhibits ceramide?induced terminal differentiation of a human monoblastic leukemia cell line, U937. J Immunol, 1998; 161: 1390-139814Li H, Cheung W, Choo HH, et al. IL?10 synergistically enhanceds GM?CSF?induced CCR1 expression in myelomonocytic cells. Biochem Biophys

34、Res Commun, 2003; 304: 417-42415Han IS, Ra JS, Kim MW, et al. Differentiation of CD34 cells from human cord blood and murine bone marrow is suppressed by C6 beta?chemokines. Mol Cells, 2003;15:176-18016de?Wynter EA, Durig J, Cross MA, et al. Differential response of CD34 cells isolated from cord blood and bone marrow to MIP?1